1、聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）聚合酶链（PCR）技术PCR反应体系PCR技术过程及原理.聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术 聚合酶链反应（PCR）技术是一个能在试管内模仿细胞内核酸复制过程，也就是能在体外特异地扩增一段特定核酸序列的技术.PCR的反应体系 参与PCR反应的成分： 模板 引物 dNTPTaq DNA聚合酶Mg2+缓冲液. 模板：即为要被复制的核酸片段 条件：需要较高的纯度. 引物：化学合成的寡核苷酸 条件： 1.一般长度为20个核苷酸 2.两条引物的序列不能互补 3.两条引物之间的Tm值不能相差太多 . dNTP:4种核苷酸 条件：4种核苷酸的浓度需要一致，否则容易出现
2、DNA聚合酶错配的概率. Taq DNA聚合酶：是从水栖嗜热菌中提取的一种酶，能催化DNA合成。具有5端3端的外切酶活性。. Mg2+：是Taq DNA聚合酶的辅助因子，可以稳定其活性. 缓冲液：在扩增过程中使PH值维持在7.2左右，使DNA聚合酶发挥最大的活性.PCRPCR技术基本过程技术基本过程.变性变性在熔点温度的条件下（94左右），使双链DNA结构的氢键断裂，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。 94 DNA双链解开.退火退火 将反应体系温度将至熔点温度以下（4070），以便使引物与模板DNA序列互补，形成杂交链。 4070 引物与DNA模板杂交 .延伸延伸 将反应体系
3、的温度升至72，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对的原则一次把dNTP加至引物的3端，在Taq DNA聚合酶的作用下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。新的DNA又可以作为下一个模板进行扩增，如此反复循环，可以到达数十万倍到百万倍的扩增数 72 4种dNTP在引物和DNA聚合酶的 的作用下延伸 .定量PCR技术 指在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。. Taqman荧光探针： 5端荧光基团 FAM 3端淬灭基团 . PCR扩增时，Taq酶的5- 3外切酶活性将探针酶切降解，使探针上的荧光基团和淬灭
4、基团分离，使荧光基团在激发光作用下发出荧光； 每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。16. 荧光阈值荧光阈值 在荧光扩增曲线在荧光扩增曲线指数增长期指数增长期设定一个荧光强度标准设定一个荧光强度标准( (即即PCRPCR扩扩增产物量的标准增产物量的标准) )。阈值线阈值线实时定量实时定量PCRPCR的两个重要概念的两个重要概念17. CtCt值值(cycle threshold)(cycle threshold)的概念的概念 指指PCRPCR扩增过程中，扩增产物扩增过程中，扩增产物( (荧光信号荧光信号) )到达阈值时所经过到达阈值时所经过的扩增循环次数的扩增循环次数。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起。它与起始拷贝数的对数成线性关系（即与起始拷贝数反比关系始拷贝数反比关系）C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-阈值线阈值线18. 方法学评价： 优点：杂交效率高 缺点： 荧光淬灭难以彻底，本底较高 探针的水解依赖于Taq 酶的外切活性，故受酶性能和试剂质量影响 .
