1、病毒的病毒的鸡胚培鸡胚培养养（一）实验目的（一）实验目的 1.1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 2.2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的操作技术。的操作技术。（二）实验原理（二）实验原理 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚培养两种方法，而鸡胚培养更为常见。培养两种方法，而鸡胚培养更为常见。一般而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分一般而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热也可经鸡离病毒，其他动物病如犬瘟热也可经鸡胚分离病毒。胚分离病毒。 鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新
2、的疫鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的疫苗接种方法。这种方法就是对孵化后期的苗接种方法。这种方法就是对孵化后期的鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些病毒疫鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响，通过这苗不会对孵化率产生不利的影响，通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具有免疫保护力。护力。 （三）实验器材（三）实验器材 1. 1.鸡胚鸡胚：要选择要选择SPFSPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。鸡胚或低母源抗体的鸡胚。从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感要用无母源
3、抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡胚。胚。 孵化前的鸡胚应注意消毒，置孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-3837-38、相对湿相对湿度度45-60%45-60%的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，孵蛋的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，孵蛋第第4 4天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。多采用天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。多采用9-119-11日龄的活胚接种。日龄的活胚接种。（四）实验方法（四）实验方法 1. 1.接种前的准备：接种前的准备： a.a.鸡胚的准备：鸡胚的准备：选择选择9-119-11日龄的鸡胚，在照蛋日龄的鸡胚，在照蛋
4、时以记号笔勾出气室，于气室稍下方胚胎活跃而时以记号笔勾出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位。用作为接种部位。用3%3%碘酊对接种部位进行消毒，碘酊对接种部位进行消毒，再用再用75%75%酒精棉球擦一遍，在接种定位处打孔，气酒精棉球擦一遍，在接种定位处打孔，气室向上竖放于蛋托上。室向上竖放于蛋托上。鸡胚的模式结构鸡胚的模式结构1.1.卵壳卵壳 2.2.绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 3.3.尿囊腔尿囊腔4.4.羊水腔羊水腔 5.5.卵黄囊卵黄囊 6.6.鸡胚胎鸡胚胎 7.7.卵白卵白 b.b.病毒材料的准备：病毒
5、材料的准备：要分离培养的病毒材料应要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每10001000羽份配成羽份配成250ml,250ml,为达到无菌的目的，可在每为达到无菌的目的，可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各毫升接种物中加入青霉素和链霉素各100-5000IU100-5000IU，置室温中置室温中1h1h处理。处理。法氏囊病毒的分离 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5（w/v）加入生理盐水，研磨，-20，反复冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为
6、准； 将冻融物转入离心管中，3000转/分，离心5分钟，将上清取出，使用无菌滤器过滤2.2.接种接种 鸡胚接种的方法有几种：鸡胚接种的方法有几种：绒毛尿囊腔内接种绒毛尿囊腔内接种 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种羊膜腔接种羊膜腔接种卵黄囊内接种卵黄囊内接种 取取10-1210-12日龄的鸡胚，照日龄的鸡胚，照蛋选择血管较少的部位做蛋选择血管较少的部位做一记号，用磨蛋器磨一于一记号，用磨蛋器磨一于纵轴平行的裂痕，小心挑纵轴平行的裂痕，小心挑开蛋壳，将白色的壳膜用开蛋壳，将白色的壳膜用针尖小心挑破，不要伤及针尖小心挑破，不要伤及血管丰富而透明的绒毛尿血管丰富而透明的绒毛尿囊膜，在气室顶端钻一小囊膜，在
7、气室顶端钻一小孔，用滴管贴近小孔，轻孔，用滴管贴近小孔，轻轻一吸，绒毛尿囊膜便下轻一吸，绒毛尿囊膜便下陷成一小凹。陷成一小凹。绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种1.1.鸡胚胎鸡胚胎2.2.羊膜腔羊膜腔3.3.绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜 取取10-1210-12日龄的鸡胚，消日龄的鸡胚，消毒气室顶上的蛋壳，并毒气室顶上的蛋壳，并将气室顶端的蛋壳锉一将气室顶端的蛋壳锉一三角形的裂痕，用灭菌三角形的裂痕，用灭菌镊子揭去裂痕部位的蛋镊子揭去裂痕部位的蛋壳和壳膜，用灭菌平头壳和壳膜，用灭菌平头镊子刺破尿囊膜，并轻镊子刺破尿囊膜，并轻轻夹去羊膜，用小号针轻夹去羊膜，用小号针头刺进羊膜腔内，
8、注入头刺进羊膜腔内，注入0.05-0.1ml0.05-0.1ml的病毒接种的病毒接种液，以氧化锌胶布封口，液，以氧化锌胶布封口，滴上溶化的固体石蜡。滴上溶化的固体石蜡。放回孵化器，使蛋直立放回孵化器，使蛋直立孵化。孵化。羊膜腔接种羊膜腔接种羊膜腔接种羊膜腔接种1.1.鸡胚胎鸡胚胎2.2.羊膜腔羊膜腔3.3.绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜4.4.羊膜羊膜 选择选择6-8日龄的鸡胚，日龄的鸡胚，照蛋检查，划出气室照蛋检查，划出气室和胎位，并以气室向和胎位，并以气室向上竖立在蛋托上，气上竖立在蛋托上，气室端的蛋壳经消毒后室端的蛋壳经消毒后以打孔器钻一小孔，以打孔器钻一小孔，将注射针头刺过小孔，将注射针头刺过小
9、孔，沿着卵的纵轴刺入约沿着卵的纵轴刺入约3cm，然后注入，然后注入0.2ml的病毒接种液，的病毒接种液，用氧化锌胶布及石蜡用氧化锌胶布及石蜡封口后放回孵化器中封口后放回孵化器中培养。培养。卵黄囊内接种卵黄囊内接种卵黄囊接种卵黄囊接种鸡胚的各种接种途径1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种绒毛尿囊腔内接种绒毛尿囊腔内接种 绒毛尿囊膜接种绒毛尿囊膜接种羊膜腔接种羊膜腔接种卵黄囊内接种卵黄囊内接种3.3.收毒：收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。病毒的收毒根据接种的途径而定。尿尿 囊囊 液液绒毛尿囊膜绒毛尿囊膜羊羊 水水卵黄液和卵黄膜卵黄液和卵黄膜4.4.废料处理废料处理 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等残物煮沸消毒后弃去。残物煮沸消毒后弃去。（五）实验作业（五）实验作业 1. 1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什么问题？么问题？ 2.2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应注意哪些问题？注意哪些问题？
