1、临床应用时，我们常会有诸多疑问 需要用多大的panel？ 需要测多深？ 多少灵敏度就是足够？ 如何理解突变丰度？ 如何理解多突变并存？ 哪个是主克隆？亚克隆？如何用药？ 在哪些情况下，NGS“测不准”？ 样本质量与污染的干扰 TMB检测的局限性（来自样本的LoD限制）选择好的NGS检测如何读懂NGS的有效信息NGS应用的局限性核心结构Summary小结体细胞突变 对应有何药物？胚系突变 遗传风险？TMB/MSI等结果 免疫治疗获益？质控 样本是否符合要求1：总体小结信息提取临床信息：肺癌，血浆样本l 有临床意义变异：NTRK基因融合l 肿瘤突变负荷：7.9个突变/Mbl 胚系致病变异：无l 样
2、本质量评估：合格2：体细胞变异及解读体细胞变异及解读l 基因变异形式l 突变丰度l 靶向药物及证据级别：A？B？C？D？突变丰度怎么定义？（组织）Wild type 野生型 = “G”Mutation 突变型 = “A”AlleleAllele Fraction(AF)Fraction(AF) = “A” / total depth突变丰度突变丰度 = 测到A的次数/总深度突变丰度在组织检测中的解读：突变丰度在组织检测中的解读：突变丰度突变丰度= =肿瘤细胞占比肿瘤细胞占比 * * 突变亚克隆在肿瘤中占比突变亚克隆在肿瘤中占比 * * 0.50.5（杂合突变）（杂合突变）or 1.0or 1.
3、0（纯合突变）（纯合突变） 10%-90%10%-90%1.1. 肿瘤组织中的突变丰度需与肿瘤细胞占肿瘤组织中的突变丰度需与肿瘤细胞占比结合来解读。比结合来解读。2.2. 多个突变的相对丰度提示亚克隆的占比多个突变的相对丰度提示亚克隆的占比突变丰度在血液检测中的解读：突变丰度在血液检测中的解读：突变丰度突变丰度= =ctDNActDNA在所有在所有cfDNAcfDNA中占比中占比 * * 突变亚克隆在肿瘤中占比突变亚克隆在肿瘤中占比 * * 0.50.5 or 1.0or 1.00.1%-90%0.1%-90%1.1.ctDNActDNA中的低丰度突变是真实中的低丰度突变是真实存在且有临床意义
4、的存在且有临床意义的2.2.丰度高低提示体内的肿瘤负荷丰度高低提示体内的肿瘤负荷3.3.大多数情况下，大多数情况下，ctDNActDNA被大量被大量来自正常细胞的来自正常细胞的cfDNAcfDNA稀释，稀释，因而丰度很低因而丰度很低4.4.经治后的经治后的ctDNActDNA可能转阴可能转阴共500例血液样本中32.3%的突变丰度在1%以下16.1%的突变丰度在0.5%以下低丰度突变有多少？低丰度突变有多少？这些突变所对应的组织中突变丰度平均为12%低丰度突变有意义吗？低丰度突变有意义吗？突变丰度怎么定义？（血液）临床证据级别分为ABCD级The Journal of Molecular Di
5、agnostics, Vol. 19, No. 1, January 2017 治疗诊断预后FDA已批准专业指南高证据级别临床研究专家共识FDA推荐其它瘤种临床研究入组标准临床前研究提示有效A级证据：FDA批准，如拉罗替尼#2018 ESMO11月26日FDA加速批准TRK抑制剂Larotrectinib上市C级证据：目前仍在临床阶段，如恩曲替尼#2018 ESMO根据不同证据等级推荐靶向药物级别The Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 19, No. 1, January 2017 变异与药物敏感性的证据级别根据ASCO和CAP指南，共分为 A、B
6、、C、D 四个等级变异按照临床意义的重要性分为四个等级：I类变异（具有A级或B级证据）类变异（具有C级或D级证 据） I-II类变异有详细解读类变异（尚无相关临床证据）IV类变异（已知无临床意义，报告未列）3：胚系变异关注致病性胚系变异及解读l 关注变异的致病性l 变异的致病性分为5级5-致病4-可能致病3-意义未明2-可能不致病1-不致病l 相应的遗传风险？遗传相关性肿瘤及其遗传易感基因肿瘤类型肿瘤类型相关遗传易感基因及患癌风险相关遗传易感基因及患癌风险乳腺癌ATM、BARD1、BRCA1（5559%）、BRCA2（4251%）、BRIP1、CDH1(3950%)、CHEK2、MRE11A、
7、MUTYH、NBN、NF1、PALB2、PTEN（2650%）、RAD50、RAD51C、RAD51D、STK11（32%54%）、SMAD4、TP53(4960%)、卵巢癌BRCA1（34%45%）、BRCA2（13%21%）、BRIP1、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM、PTEN、RAD50、RAD51C、RAD51D、TP53、 子宫内膜癌BRCA1、BRCA2、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM(1240% )、FH(子宫平滑肌瘤/肉瘤）PTEN、STK11、CHEK2结直肠癌结直肠癌MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM(1286% )M
8、LH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM(1286% )、APC(100%)APC(100%)、BMPR1A(39%)BMPR1A(39%)、SMAD4(39%)SMAD4(39%)、MUTYH(80%)MUTYH(80%)、BRAFBRAF、PTENPTEN、STK11STK11（39%39%）、）、TP53TP53、GREM1GREM1、POLD1POLD1、POLEPOLE、ATMATM、BLMBLM、CHEK2CHEK2、胃癌CDH1(4083%)、STK11(29%)、BMPR1A、SMAD4、MUTYH、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM、SDHA、SDHB
9、(77%)、SDHC、SDHD(86%)、SDAF2、MET、PDGFR、KIT胰腺癌APC(1.7%)、ATM、BRCA1、BRCA2、CDKN2A(1725%)、PALB2、PALLD、SMAD4、STK11、TP53MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM肾癌、肾上肾癌、肾上腺髓质瘤、腺髓质瘤、副神经节瘤副神经节瘤BAP1BAP1、FH(15%)FH(15%)、FLCN(34%)FLCN(34%)、METMET、MITFMITF、PTENPTEN、SDHASDHA、SDHB(77%)SDHB(77%)、SDHCSDHC、SDHD(86%)SDHD(86%)、SDAF2SDAF2
10、、TP53TP53、TSC1TSC1、TSC2TSC2、TMEM127TMEM127、VHL(2857%)VHL(2857%)、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAMMLH1/MSH2/MSH6/PMS2/EPCAM、MAXMAX脑肿瘤AIP、ALK、APC、CDKN1B、CDKN2A、DICER1、MEN1（15-50%）、MLH1/MSH2/MSH6/PMS2、NF2、NBN、NF1、PHOX2B、POT1、PRKAR1A、PTCH1、PTEN、RB1、SMARCA4、SMARCB1、SMARCE1、SUFU、TP53、TSC1/TSC2、VHL甲状腺癌APC(2%)、SDHB
11、、MEN1(80100%)、RET、GNAS1、BRAF皮肤癌/恶性黑色素瘤CDKN2A(2867%)、BRAF、CDK4、PTCH1、FLCN、WRN(20%)、KIT、TSC1/24：免疫治疗获益指标：TMB和MSI免疫治疗相关Biomarkerl TMB显示具体数值；l MSI分为三个级别：MSI-H；MSS；MSI-L燃石大Panel经过8000例数据验证，能准确检出TMB，与WES相关性极好OncoScreenTM Plus panel size=1.86Mb燃石医学国内最大样本量临床验证MSI，正确率97%，同时方法学发表于权威分子诊断杂志，准确可靠(The Journal of
12、Molecular Diagnostics)TMB验证MSI验证TMB、MSI等需经实际临床验证J Mol Diagn. 2018 Mar;20(2):225-231.5：样本质控 关注质控是否合格； 组织样本评估恶性肿瘤细胞占比； 燃石基于HS自动化建库技术要求占比10%，30ng以上；燃石报告质控细节质控细节【CSCO NGS共识】声明10：应有充分的样本评估和起始核酸用量：适合于NGS检测的组织标本中肿瘤细胞含量建议应达到20%以上；组织样本抽提获得的DNA量应达50 ng以上用于NGS检测。血液样本建议采血至少8 ml6：其他信息SNP位点小结检测方法局限性说明PANEL基因列表参考文
13、献临床中单基因/多基因异常的解读“决策树”u所有基因组信息结果必须结合临床信息解读多个基因异常共存单基因异常存在Driver不存在Driver网络化逻辑流程结合临床背景进行可否采取行动的解读进入更广泛基因组信息生物学含义解读的逻辑流程：TMB？IO？是Driver非Driver直线型逻辑流程进入更广泛的逻辑流程相互作用和优先级排序克隆演化与耐药机制考察异质性考察必须考虑临床证据级别瘤种信息干预信息配对信息全阴性分析结合临床背景进行全阴性分析有基因异常结果无基因异常检测结果说明：各个癌种Driver mutation定义不同，肺癌指EGFR、ALK、ROS1、MET、RET、BRAF V600E
14、、KRAS、HER2、NTRK无基因变异全阴报告，首先看质控是否合格肿瘤细胞占比测序深度 Panel大小限制 朗克8 gene至少检出1个突变的几率约75% OncoScreen 520 gene 至少检出1个突变的几率约 95% 癌种差异 朗克8 gene在肺腺癌阳性率约75%，而在肺鳞癌阳性率约25% 不同癌种的突变谱差异巨大 组织样本的肿瘤细胞占比 病理切片评估有局限性 ctDNA释放过低：1、全身肿瘤负荷：是否存在远处转移（M1a患者的ctDNA丰度显著低于M1b患者）；2、是否持续治疗：即药物持续治疗3、PD的具体情况：缓慢进展或寡病灶进展？4、特殊转移部位：单纯脑转移的患者5、肿瘤
15、DNA释放也存在个体差异性，燃石的整体数据显示，晚期患者血检阳性率超过80%。无基因异常质控合格时，进行全阴分析敏感基因突变 如：EGFR基因第19外显子缺失、EGFR基因21外显子L858R突变、EML4-ALK融合变异耐药基因突变 如： EGFR基因第20外显子T790M突变低频罕见基因突变 如：RET重排、ERBB2基因扩增下游信号通路基因突变 如：肺腺癌中检测到KRAS，PIK3CA基因突变临床意义不明的突变单基因异常分析典型基因变异患者临床信息：病理诊断：IV期肺腺癌传统分子诊断：EGFR-， ALK-，ROS1-一线治疗：AP方案化疗1周期，疗效评价PD燃石检测报告: MET ex
16、on 14 skipping丰度：0.83%二线治疗：克唑替尼克唑替尼治疗前、治疗3周、治疗2个月CT对照单基因异常分析MET exon 14 skipping 单基因异常分析罕见耐药突变EGFR L747P患者基本信息：61岁男性患者，吸烟史30年，120支/年；病理诊断：腺癌；IV期，多处肋骨及脊柱转移。燃石NGS液体活检结果提示为EGFR L747P治疗方案：一线， 六个周期的培美曲塞+顺铂化疗，PD。二线，EGFR-TKI（厄洛替尼）1个月，PD。带有EGFR-L747P突变的NSCLC对于TKI不敏感患者基因信息：l ZW，53岁男性患者，吸烟史10年，200支/年，腺癌，C-T2a
17、Nm1b，IV期l 转移：右肺门，纵膈内多发肿大淋巴结，右侧肱骨头，右侧第四肋，左侧第三肋，双侧髋骨及坐骨，脊柱转移。l 分子诊断结果：ARMS组织检测，结果是EGFR-L858R阳性。l 一线， 2016.09.20及2016.10.12行AP方案化疗（培美曲塞0.9DDP 120mg） 疗效：PD。l 二线，EGFR-TKI（厄洛替尼）1个月后疾病再次进展燃石检测: EGFR L858R ERBB2扩增 MET扩增三线，厄洛替尼+克唑替尼（250mg bid po），PR 多基因异常分析L858R突变伴ERBB2扩增和MET扩增0.01%0.5%0.2%0.1%0.05%晚期患者一线用药伴
18、随诊断II/III期围术期MRD检测监控晚期患者动态监控及耐药机制探索I期围术期MRD检测监控早诊早筛ctDNA丰度基于深度测序的ctDNA突变检测多组学方法，尤其是表观遗传学维度FDA EAP:Foundation LiquidPersonal Genome Diag.Guardant 360UMI-basedCAPP-seq5000X 40000X不同类型患者应匹配不同灵敏度与测序深度靠谱的NGS报告：清晰明了的检测信息+详细的质控信息临床送检样本面临的主要挑战异种基因组DNA污染样本错配人源DNA污染送检临床样本，却出现质控不过关的情况？石蜡组织中3.14%的样本人源DNA回帖比例占比小
19、于95%1.75%的样本人源DNA回帖比例小于90%异种基因组DNA污染主要发生于石蜡组织燃石内部数据不够规范的NGS报告1：包含大量化疗预测基因（肺癌）不够规范的NGS报告2：变异结果分级混乱质控质控不详细-1质控质控不详细-2或者缺少质控页！不够规范的NGS报告3：质控永远合格或没有质控NGS检测中的假阳性当仅有一份孤立的NGS检测报告，要准确评估其中的假阳性非常困难，因为并没有标准结果或者第三方的独立验证但可以根据一些现有的科学常识、对肿瘤基因组学的认知来判断这个报告是否存在明显的错误 科学认知一：肺癌的主要驱动基因互斥（特别是初治） 科学认知二：肿瘤组织与ctDNA存在异质性，但主要驱
20、动突变应一致 科学认知三：明确Driver Mutation患者，TMB一般不会太高科学认知一：肺癌主要驱动基因互斥 非小细胞肺癌的主要驱动基因EGFR、ALK、ROS1、KRAS、BRAF、MET、ERBB2、RET 之间互斥，即一人仅携带一个驱动基因突变 仅在二线耐药后的病人和极少数一线病人中可能携带2-3个驱动基因突变 如果经常检出携带大量本应该互斥的驱动基因突变，则是假阳性的可能性非常大（初治）科学认知一：肺癌主要驱动基因互斥 同一个样本检出了4个肺癌驱动基因的8个突变从肿瘤生物学上这几乎是不可能发生的6个ALK/BRAF/ERBB2突变丰度都很低（0.5%-2%）男，44岁，肺腺癌报
21、告示例该样本在32个基因检出56个突变其中仅有EGFR等3个突变丰度在5%以上其余均为0.5% 3%的低丰度突变（包括另外3个驱动基因ALK/BRAF/ERBB2的6个突变）报告示例一：大量低丰度突变实为假阳性女性，66岁，EGFR M+，先后经历化疗、一代TKI、三代TKI，确认PD充分结合临床信息！充分结合临床信息！多线治疗多线治疗多线治疗患者则可能出现复杂克隆进化科学认知二：组织与血液ctDNA不一致过高前述样本检出共56个突变ctDNA 32个肿瘤组织 30个一致的仅有6个然而最高丰度的EGFR突变却仅在组织中检出，血浆未检出男，44岁，肺腺癌报告示例科学认知二：肿瘤组织与ctDNA存在异质性，但主要驱动突变应一致 ctDNA检测来自于肿瘤组织的突变，因此二者的一致性是很高的 但由于肿瘤存在异质性，所以二者可能存在少量分支突变的不一致，但肿瘤的主干突变（trunk mutation）应该是一致的 如果肿瘤组织和ctDNA的不一致远远超过预期，则是假阳性的可能性非常大科学认知三：明确Driver Mutation患者，TMB一般不会太高2016 ASCO#AbstractTake home MessageNGSNGS报告报告信息信息患者患者详细临床详细临床情况情况最佳治疗最佳治疗决策决策
