1、第一章 遗传的物质基础-DNA第一节第一节 遗传物质的本质遗传物质的本质第二节第二节 DNA的结构和性质的结构和性质第三节第三节 DNA变性和复性变性和复性第四节第四节 分子杂交分子杂交第一节 遗传物质的本质1 8 6 8 年 ， 瑞 士 的 内 科 医 生年 ， 瑞 士 的 内 科 医 生Friedrich Miescher从外科医院包从外科医院包扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取扎伤口的绷带上的脓细胞核中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，到一种富含磷元素的酸性化合物，将其称为核质或核素将其称为核质或核素(nuclein)；后后来他又从鲭鱼精子中分离出类似的来他又从鲭鱼精子中分离出类似的物质，并
2、指出它是由一种碱性蛋白物质，并指出它是由一种碱性蛋白质与一种酸性物质组成的，此酸性质与一种酸性物质组成的，此酸性物质即是现在所知的核酸物质即是现在所知的核酸(nucleic acid)。 Friedrich Miescher米歇尔（米歇尔（1844-1895） 一、 遗传物质的发现18891889年，年，奥尔特曼奥尔特曼(R. (R. Altmann)Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(nucleic acid)(nucleic acid)的名称。的名称。 1885-19011885-1901年，年，KosselKossel等等证实核酸由证实核酸由A A、G G、C C、U U四四种
3、碱基。种碱基。1911-19341911-1934年年LeveneLevene等等确确定了核酸有两种，一种是定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)，另，另一种是核糖核酸一种是核糖核酸(RNA)(RNA)。证实核酸由不同的碱基组证实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构成。其最简单的单体结构是碱基是碱基-核糖核糖-磷酸构成的磷酸构成的核苷酸。核苷酸。科赛尔（科赛尔（1853-1927） 列文列文(1869-1940) 核酸是遗传物质核酸是遗传物质遗传物质必须具备哪些特点？1) 在体细胞中含量稳定；2) 在生殖细胞中含量减半；3) 能携带遗传信息；4) 能精确地自我复
4、制；5) 能发生变异；核核 酸酸(nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大分是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。子，携带和传递遗传信息。1.1.遗传物质的主要载体遗传物质的主要载体- -染色体。染色体。 （通过对细胞有丝分裂、减数分裂和受精过程的研究，人们（通过对细胞有丝分裂、减数分裂和受精过程的研究，人们了解到染色体在生物的传宗接代过程中，能够保持一定的稳了解到染色体在生物的传宗接代过程中，能够保持一定的稳定性和连续性。因此，人们认为染色体在遗传上起着主要作定性和连续性。因此，人们认为染色体在遗传上起着主要作用。）用。）( (染色体的主要成分是染色体
5、的主要成分是DNADNA和组蛋白，虽然这两种成分都在基和组蛋白，虽然这两种成分都在基因功能上起着重要的作用，但多数证据证明，基因的主要特因功能上起着重要的作用，但多数证据证明，基因的主要特性由性由DNADNA决定，或者说遗传信息贮存在决定，或者说遗传信息贮存在DNADNA中中) )。3. 3. DNADNA是遗传物质的证据。是遗传物质的证据。 如果如果DNA确是遗传物质确是遗传物质, ,那么能不能把那么能不能把DNA和蛋白质分开，和蛋白质分开，单独观察单独观察DNA的作用呢？这些实验已在微生物中做了的作用呢？这些实验已在微生物中做了, ,证明证明遗传物质确是遗传物质确是DNA（或或RNA）。
6、证据：证据：6Frederick Griffith格里菲斯格里菲斯(1879-1941) 利用肺炎双球菌感染小利用肺炎双球菌感染小鼠的一系列生物学实验，鼠的一系列生物学实验，发现了一种可以在细菌发现了一种可以在细菌之间转移的遗传分子之间转移的遗传分子 ，即即转化因子转化因子格里菲斯实验格里菲斯实验n 1928年Frederick Griffith 转化实验7 1944年年Avery等人通过肺炎球等人通过肺炎球菌转化实验证明菌转化实验证明DNA是携带遗传是携带遗传信息的分子信息的分子Oswald Theodore Avery埃弗里（埃弗里（1877-1955）DNA分子中贮存着遗传信息分子中贮存
7、着遗传信息人们仍不相信DNA是遗传物质,这是由于：（1）因认为蛋白分子量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。而DNA分子量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。1952年，年，Hershey 和和 Chase 完成噬菌体感染实噬菌体感染实验验10RNA也是遗传物质也是遗传物质1956年吉尔年吉尔(A.Gierer)和施拉姆和施拉姆(G.Schraman)发现烟发现
8、烟草花叶病毒草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）的遗传的遗传物质是物质是RNA1957年美国的弗伦克尔年美国的弗伦克尔-康拉特康拉特(Fraenkel-Conrat)和和B.Singre用病毒重建实验证实了这一结论用病毒重建实验证实了这一结论Heinz Ludwig Fraenkel-ConratAlfred Gierer 11 烟草花叶病毒是一种烟草花叶病毒是一种RNA病毒，不含病毒，不含DNA，它，它有一个圆筒状的蛋白质外有一个圆筒状的蛋白质外壳，由壳，由2130个相同的亚基组个相同的亚基组成，内有一条成，内有一条RNA分子，分子，沿着内壁在蛋白质亚基之沿着内壁在
9、蛋白质亚基之间盘旋间盘旋 18891889年，年，奥尔特曼奥尔特曼(R. (R. Altmann)Altmann)首次提出了核酸首次提出了核酸(nucleic acid)(nucleic acid)的名称。的名称。 1885-19011885-1901年，年，KosselKossel等等证实核酸由证实核酸由A A、G G、C C、U U四四种碱基。种碱基。1911-19341911-1934年年LeveneLevene等等确确定了核酸有两种，一种是定了核酸有两种，一种是脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)，另，另一种是核糖核酸一种是核糖核酸(RNA)(RNA)。证实核酸由不同的碱基组证
10、实核酸由不同的碱基组成。其最简单的单体结构成。其最简单的单体结构是碱基是碱基-核糖核糖-磷酸构成的磷酸构成的核苷酸。核苷酸。科赛尔（科赛尔（1853-1927） 列文列文(1869-1940) 二、 DNA和RNA的化学组成1929年Levene和London提出四核苷酸假说：“不同DNA的成分都是相同的”。1948年Alfred Mirsky，Hars RisR.Vendrely，A.Boivin两组学者分别发现不同的生物体细胞中DNA的含量都是其配子中的两倍。 1950英Chargaff对各种生物DNA的碱基组成进行了定律测定，发现DNA的“当量规律”即：嘌呤的总含量和嘧啶的总含量相等；且
11、不同生物DNA碱基组成有明显差异。否定了四核苷酸假说，提示了A-T、G-C 互补的可能性。 14核酸的分类及分布核酸的分类及分布 存在于细胞核和线粒体内。存在于细胞核和线粒体内。存在于胞核、胞液和线粒体。存在于胞核、胞液和线粒体。(deoxyribonucleic acid, DNA)(ribonucleic acid, RNA)脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸核糖核酸核糖核酸携带遗传信息，决定细胞和个携带遗传信息，决定细胞和个体的遗传型体的遗传型(genotype)。参与遗传信息的复制与表达。参与遗传信息的复制与表达。某些病毒某些病毒RNA也可作为遗传信也可作为遗传信息的载体。息的载体。核核 酸酸(
12、nucleic acid) 是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携是以核苷酸为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。带和传递遗传信息。15核酸的基本组成单位是核苷酸核酸的基本组成单位是核苷酸(nucleotide)碱基碱基戊糖戊糖磷酸磷酸核苷酸核苷酸核苷核苷核酸核酸DNA的基本组成单位是的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 。RNA的基本组成单位是的基本组成单位是核糖核苷酸核糖核苷酸 。元素组成：元素组成：C、H、O、N、PP元素的含量较多并且恒定，约占元素的含量较多并且恒定，约占911%。16嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 碱基碱基腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G）胞嘧啶（胞嘧啶
13、（C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T）尿嘧啶（尿嘧啶（U）DNA、RNA均有均有DNA有有RNA有有每种核酸都含有四种碱基每种核酸都含有四种碱基 。（一）碱（一）碱 基基17嘧啶嘧啶嘌呤嘌呤除了上述五类基本的碱基外，核酸中还有一些除了上述五类基本的碱基外，核酸中还有一些含量甚少的碱基，称为含量甚少的碱基，称为稀有碱基稀有碱基。稀有碱基种。稀有碱基种类极多，大多数都是甲基化碱基类极多，大多数都是甲基化碱基。tRNA中含有中含有较多的稀有碱基。较多的稀有碱基。18生物体内游离存在的嘌呤碱基生物体内游离存在的嘌呤碱基稀有碱基稀有碱基 五种碱基都能形成酮式五种碱基都能形成酮式-烯醇式或氨基烯醇式或氨基-亚氨基
14、的互变异构。这两亚氨基的互变异构。这两种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。种异构体的平衡关系受介质酸碱环境的影响。 19HNHNCNH2+O+HNNH2NNH2亚亚氨氨基基氨氨基基+ H+NCOHNCO-+ H+酮酮式式烯烯醇醇式式20 一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取一些合成的嘌呤和嘧啶具有临床应用价值，它们可以取代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如代某些酶活性部位中的天然嘧啶和嘌呤底物。例如5-氟尿嘧氟尿嘧啶啶和和6-巯基嘌呤巯基嘌呤就常用于治疗某些类型的癌症。就常用于治疗某些类型的癌症。5-氟尿嘧啶氟尿嘧啶相应的核苷酸类似于胸苷酸，是一种潜在的胸苷酸合成酶的相
15、应的核苷酸类似于胸苷酸，是一种潜在的胸苷酸合成酶的抑制剂，胸苷酸合成酶是抑制剂，胸苷酸合成酶是DNA合成所必需的酶。合成所必需的酶。次黄嘌呤次黄嘌呤21（二）戊（二）戊 糖糖（构成（构成RNA）核糖核糖(ribose)（构成（构成DNA）脱氧核糖脱氧核糖(deoxyribose)12453OOHOHHHHCH2OHHOHOHOHHHHCH2OHHOH12345-D-呋喃核糖呋喃核糖-D-2-脱氧呋喃核糖脱氧呋喃核糖22碱基和核糖（或脱氧核糖）通过碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键糖苷键连连接形成接形成核苷核苷（或脱氧核苷）。（或脱氧核苷）。（三）核（三）核 苷（苷（nucleoside）RNA
16、 腺苷、鸟苷腺苷、鸟苷 尿苷、胞苷尿苷、胞苷 DNA 脱氧腺苷、脱氧鸟苷脱氧腺苷、脱氧鸟苷 脱氧胸苷、脱氧胞苷脱氧胸苷、脱氧胞苷 23（四）核苷酸（四）核苷酸（nucleotide） 核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖核苷酸就是核苷的磷酸酯。是核苷中的戊糖上上C5相连的羟基被磷酸分子酯化所形成的。相连的羟基被磷酸分子酯化所形成的。糖苷键酯键腺苷酸NNNN9NH2OOHOHHHHCH2H12OPO- -HOO524一个核苷酸一个核苷酸3 的的羟基羟基与另一个核苷酸与另一个核苷酸5 的的-磷酸磷酸基团缩合形成基团缩合形成磷酸二酯键磷酸二酯键(phosphodiester bond) 多个脱氧核
17、苷酸通过磷酸二酯键构多个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键构成了具有成了具有方向性方向性的线性分子，称为的线性分子，称为多聚多聚核苷酸，核苷酸，即即DNA链或链或RNA链链（四）核苷酸之间通过（四）核苷酸之间通过3 , 5 -磷酸二酯键连接磷酸二酯键连接25交替的磷酸基团交替的磷酸基团和戊糖构成了和戊糖构成了DNA的骨架的骨架(backbone)。DNA链的方向是链的方向是5 3 26脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较脱氧核糖核酸和核糖核酸的比较分类分类核糖核酸核糖核酸 （ribonucleic acid，RNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸 （deoxyribonucleic acid，DNA）组组成成戊糖戊糖
18、核糖核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基A,G,CA,G,CUT磷酸磷酸Pi（磷酸二酯键）（磷酸二酯键）Pi（磷酸二酯键）（磷酸二酯键）结构结构单链，部分碱基互补，局部双单链，部分碱基互补，局部双螺旋，三叶草形等螺旋，三叶草形等双链，碱基互补，双螺旋形双链，碱基互补，双螺旋形分布分布细胞核（核仁），细胞核（核仁）， 细胞质（线细胞质（线粒体、核蛋白体、胞液）粒体、核蛋白体、胞液）细胞核（染色质），细胞质细胞核（染色质），细胞质（线粒体）（线粒体）生物功能生物功能主要参与遗传信息的传递和表主要参与遗传信息的传递和表达过程，在蛋白质的生物合成达过程，在蛋白质的生物合成中起重要作用中起重要作用是基因遗传与表
19、达的载体，是是基因遗传与表达的载体，是生物的主要遗传物质生物的主要遗传物质27DNA的一级结构是指脱氧核苷酸之间的连接方式和排列顺序。的一级结构是指脱氧核苷酸之间的连接方式和排列顺序。由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列碱基序列。 5533一、一、DNA的一级结构的一级结构第二节第二节 DNA的结构和性质的结构和性质28化学式化学式PAPCPGPT或 PA-C-G-T ACGT多聚核苷酸链具有方向性，若不特别注多聚核苷酸链具有方向性，若不特别注明，明，一般规定从一般规定从5端书写至端书写至3端端。线条式线条式文字式文字式双链双链DNA
20、的两条链为反向平行，必须注的两条链为反向平行，必须注明各条链的走向。明各条链的走向。核酸的表示方式核酸的表示方式29生物的遗传信息贮存于生物的遗传信息贮存于DNA碱基序列中，碱基序列中，生物界的多样性即寓于生物界的多样性即寓于DNA分子中的分子中的4种种脱氧核苷酸千变万化的精确排列顺序中。脱氧核苷酸千变万化的精确排列顺序中。基因的遗传信息的物质基础就是基因的遗传信息的物质基础就是4种碱基种碱基的精确排列顺序。的精确排列顺序。可以通过测定可以通过测定DNA序列来研究序列来研究DNA所载的所载的信息及其功能。信息及其功能。DNA一级结构的意义：一级结构的意义：30 根据碱基配对原则，当一条多核苷酸
21、链的序列被确定根据碱基配对原则，当一条多核苷酸链的序列被确定后，即可决定另一条互补链的序列。这就表明，遗传信息后，即可决定另一条互补链的序列。这就表明，遗传信息由碱基的序列所携带。由碱基的序列所携带。DNA碱基配对示意图碱基配对示意图（一）（一）DNA双螺旋模型的诞生双螺旋模型的诞生Watson & Crick建立双螺旋模型主要是受到建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：个方面的影响：（1）1938年年W.T.Astbury & Bell用用x衍射技术研究衍射技术研究DNA。1947年拍年拍摄了第一张摄了第一张DNA的衍射照片，并推断的衍射照片，并推断DNA分子的结构是：分子的结构是： 柱状
22、；柱状； 多核苷酸是一叠扁平的核苷酸；多核苷酸是一叠扁平的核苷酸； 核酸残基取向核酸残基取向和分子长轴垂直，间距为和分子长轴垂直，间距为3.4nm。（2）1951年年Pauling和和Corey运用化学的定律来推理，而不做具体运用化学的定律来推理，而不做具体的实验，建立了蛋白质的的实验，建立了蛋白质的-螺旋模型。螺旋模型。（3）晶体学者）晶体学者美美J. Donohue & Chargaff 的指点纠正起初的同类的指点纠正起初的同类碱基配对的错误构想，而提出互补配对的正确构型。碱基配对的错误构想，而提出互补配对的正确构型。（4）R.Franklin & Wilkins在在1952年底拍得了年底
23、拍得了DNA结晶结晶X衍射照片。衍射照片。二、二、 DNA的二级结构的二级结构 双螺旋结构双螺旋结构（二）双螺旋模型 (double helix model)双螺旋模型有以下特点双螺旋模型有以下特点：（要求）（要求）(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链组成，形成右手双螺旋。 (2)两条链反向平行其5和3方向相反。(3)双螺旋直径2nm；螺距3.4nm；上下相邻碱基的垂直距离0.34nm，交角为36 ；每个螺旋有10个碱基对。(4)糖一磷酸链是在双螺旋的外侧，碱基对与轴线垂直。(5)糖与附着在糖上的碱基近于垂直。(6)碱基配对时，必须一个是嘌呤，另一个是嘧啶。(7) DNA双螺旋有大沟(m
24、ajor or wide groove)和小沟(minor or narrow groove)的存在。模型中的碱基配对有何重要性？（要求）A-T,G-C配对可形成很好的线性氢键；A-T对和G-C对的几何形状一样，使双链中两侧脱氧核糖之间的距离相近，使双螺旋保持均一；碱基对处在同一平面内垂直于对称轴，沿对称轴旋转180仍保持原对称性，不论核苷酸的顺序如何，都不影响双螺旋的结构，其外形都是光滑均匀的圆柱体；模型中碱基对处于同一平面，但实际其存在一个小角度的扭转，称螺旋桨式扭转，使相邻碱基间的重叠面积大，增加了碱基间的堆集力，增强了双螺旋的稳定性；为DNA半保留复制奠定了基础。34（三）（三）DNA
25、二级结构的稳定因素二级结构的稳定因素（要求）（要求）DNA二级结构的稳定因素(1)碱基对之间的氢键。(2)碱基的堆集力。 它包括： 疏水作用； 范德华力； 磷酸基的负电荷斥力； (3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷1. 两条两条DNA链之间碱基对形成的链之间碱基对形成的氢键氢键（hydrogen bond）：）：使四种碱基形成特异配对关系，使四种碱基形成特异配对关系，G-C间可形成间可形成3对氢键，对氢键，A-T之间有两对氢键之间有两对氢键 。虽然氢键是一种弱键，但。虽然氢键是一种弱键，但DNA中氢键中氢键数量多，所以氢键是比较重要的因素。数量多，所以氢键是比较重要的因素。2. 碱基堆积力碱基
26、堆积力（base stacking force）：双螺旋结构内部碱）：双螺旋结构内部碱基层层堆积，形成了一个强大的疏水区，消除了介质中水基层层堆积，形成了一个强大的疏水区，消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。分子对碱基之间氢键的影响。这是维持这是维持DNA双螺旋稳定的双螺旋稳定的主要因素。主要因素。3. 介质中的阳离子（如介质中的阳离子（如Na+、K+和和Mg2+）可与磷酸基团上）可与磷酸基团上的负电荷形成的负电荷形成离子键离子键，降低了，降低了DNA链之间的排斥力、范德链之间的排斥力、范德华引力等，有利于双螺旋的稳定。华引力等，有利于双螺旋的稳定。36DNA二级结构的稳定因素与二级结构的
27、稳定因素与Tm值值(1)碱基对之间的氢键碱基对数越多双链越稳定（Tm越大），在设计PCR引物时，最少16nt，最好为20-24nt(2)碱基堆集力碱基间相互作用强度与相邻碱基之间的环面积成正比，即：嘌呤与嘌呤嘌呤与嘧啶嘧啶与嘧啶即DNA链中嘧啶越多Tm值越低，反之嘌呤越多Tm越高，链越稳定。(3)核苷酸的磷酸基团上都带有负电荷与介质中盐离子结合屏蔽静电排斥作用，使链稳定盐离子浓度降低，屏蔽减弱，Tm降低盐离子浓度大于生理盐水，随浓度增加，Tm增加 Watson和和Crick所描述的双螺旋结构所描述的双螺旋结构是是B型型DNA，是在生理条件下（低，是在生理条件下（低浓度盐溶液中）的构型，其浓度盐
28、溶液中）的构型，其仅仅是仅仅是众多众多DNA双螺旋构象中的一种。在双螺旋构象中的一种。在外界条件的改变下，双螺旋的构象外界条件的改变下，双螺旋的构象也会改变。也会改变。三、双螺旋结构的构象变异（一） DNA构象的类型DNA的构象现已知有：A，B，C，D，E，T，Z 7种。 引起DNA双链构象改变有以下因素：（1）核苷酸顺序；（2）碱基组成；（3）盐的种类；（4）相对湿度。目前已知目前已知DNADNA双螺旋双螺旋结构可分为结构可分为A A、B B、C C、D D及及Z Z型等数种，除型等数种，除Z Z型为左手双螺旋外，型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺其余均为右手双螺旋。旋。 Z-DNA B-D
29、NA 40A，B，Z型型DNA构象的比较构象的比较B型结构：型结构：右手双股螺旋；碱基在右手双股螺旋；碱基在内，戊糖在外，碱基平面垂直内，戊糖在外，碱基平面垂直于螺旋轴；螺旋轴穿过碱基对；于螺旋轴；螺旋轴穿过碱基对；双螺旋每转一周为双螺旋每转一周为10个碱基对；个碱基对；大沟宽而深，小沟窄而浅。大沟宽而深，小沟窄而浅。A型结构：型结构：右手双股螺旋，每圈右手双股螺旋，每圈11个碱基对；碱基平面倾斜个碱基对；碱基平面倾斜20，螺旋轴位于大沟，小沟宽而浅，螺旋轴位于大沟，小沟宽而浅，大沟极深；螺旋变粗变短，螺大沟极深；螺旋变粗变短，螺距距23nm。Z型结构：型结构：左手螺旋，每圈左手螺旋，每圈12
30、个碱个碱基对；碱基平面倾斜基对；碱基平面倾斜9，螺旋轴，螺旋轴位于小沟，没有大沟，小沟窄位于小沟，没有大沟，小沟窄而深。而深。 在生理溶液中，在生理溶液中，B-DNA与与Z-DNA可以互变。可以互变。421. 右手螺旋右手螺旋B-DNA: 相对湿度相对湿度92%，钠盐，钠盐细胞内主要的存细胞内主要的存 在形式在形式A-DNA: 相对湿度相对湿度75%，钠盐，钠盐转录时转录时DNA-RNA 杂交杂交C-DNA: 相对湿度相对湿度66%，锂盐，锂盐染色体及某些病染色体及某些病 毒的毒的DNA中中2. 左手螺旋左手螺旋Z-DNA：常存在于基因的调控区域，可能与基因：常存在于基因的调控区域，可能与基因
31、 的表达调控有关。的表达调控有关。 DNA双螺旋结构的多样性双螺旋结构的多样性431972年 Pohl et al 发现 poly(dG-dC)在高盐下旋光性发生改变；1979年 Wang A.H-J(王惠君), A.Rich对 d(CGCGCG)单晶作X衍射分析提出ZDNA模型（二）（二）Z型型DNA构象构象 u1. Z-DNA的发现：的发现：（1）糖磷骨架呈“之”字形（Zigzag）走向。（2）左旋。（3）G的糖苷键呈顺式，使G残基位于分子表面。（4）分子外形呈波形。（5）无大小沟区分，沟窄而深。（6）每个螺旋有12bp。u2. Z-DNA的结构特点的结构特点(要求要求)u3. ZDNA存
32、在的条件： (1) 高盐：NaCl2Mol/L, MgCl20.7 Mol/L (2) 嘌呤-嘧啶相间排列：现认为在适当的离子存在条件下，任何不少于6个bp的嘌呤-嘧啶交替排列序列都能形成Z-DNA (3)在活细胞中如果m5C（甲基化胞嘧啶）存在，则无需嘌呤-嘧啶相间排列，在生理盐水的浓度下即可产生Z型。 (4)在体内多胺化合物，如和亚胺及亚精胺和阳离 子一样， 可和磷酸基因结合，减少负电荷的静电排斥作用，使B-DNA转变成 Z-DNA。 (5)某些蛋白质如Z-DNA结合蛋白带有正电荷，可使DNA周围形成局部的高盐浓度和微环境，也是活细胞中形成Z-DNA的原因之一。 (6)负超螺旋的存在u4.
33、Z-DNA的生物学意义（要求）(1) 可能提供某些调节蛋白的识别位点。啮齿类动物病毒的复制起始部位有d（GC）有交替顺序的存在。(2) 在SV40的增强子中有三段8bp的Z-DNA存在。(3) 原生动物纤毛虫，它有大、小两个核，大核大核有转录活性，小核小核和繁殖有关。Z-DNA抗体以萤光标记后，显示仅和大核DNA结合，而不和小核的DNA结合，说明大核DNA有Z-DNA的存在，可能和转录有关。471957年年G. Felsenfeld等发现在基因的调控区或染等发现在基因的调控区或染色质的重组部位有色质的重组部位有DNA的三螺旋结构的三螺旋结构（三）其它（三）其它DNA二级结构二级结构 u1.三链
34、三链DNA48u三链三链DNA（triple-stranded DNA） 是DNA的一种特殊结构，由第三条寡核苷酸链通过Hoogsteen碱基配对和双螺旋中的一条链以特殊的氢键相连，形成三螺旋结构，又称三链体DNA（triplex DNA）。uHoogsteen碱基配对：1963年K. Hoogsteen发现三链DNA中的碱基能以不同于Watson-Crick配对的构象连接，即A的6-NH2和N-7分别与T的4-O和H-1形成氢键，G与C的配对要求C的N-1是质子化的，G的6-O和N-7分别与C的4-NH2和质子化的N-1形成氢键。u应用：三螺旋DNA的形成可能伴随于DNA转录、复制和重组等过
35、程。如在E. coli重组酶RecA作用中产生三链中间体，又称R-DNA。50u生物学功能：生物学功能：可能参与端粒可能参与端粒DNA的复制的复制 （三）其它（三）其它DNA二级结构二级结构 u2. 四链体四链体DNA 是富含是富含G序列的四链序列的四链DNA所形成的一种结构。所形成的一种结构。端粒的单链富含端粒的单链富含G的的3突出端即能形成鸟嘌呤四连体。突出端即能形成鸟嘌呤四连体。u发现：发现：1989年年J. R. Williamson等用等用X射线在体射线在体外分析了哺乳动物端粒序列末端的一段外分析了哺乳动物端粒序列末端的一段150-200nt的单链富含的单链富含G重复序列的晶体，发现
36、其可重复序列的晶体，发现其可形成特殊的四链结构，特别是在具有形成特殊的四链结构，特别是在具有Na+和和K+ 存在的情况下。存在的情况下。 所谓所谓DNA的三级结构，是指在一二结构基础上的三级结构，是指在一二结构基础上的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上，的多聚核苷酸链上的卷曲。在一定意义上， DNA双螺旋进一步扭曲盘绕则形成其三级结构。双螺旋进一步扭曲盘绕则形成其三级结构。u三级结构包括三级结构包括链的扭结链的扭结和和超螺旋超螺旋或者是单链形或者是单链形成的环或是环状成的环或是环状DNA中的中的连环体。连环体。u超螺旋超螺旋是是DNA三级结构的主要形式。三级结构的主要形式。 四、四、DNA的三
37、级结构的三级结构 u超螺旋的发现：超螺旋的发现：1965年年J. Vinograd等人在离心分离多瘤病毒的环等人在离心分离多瘤病毒的环形形DNA时，意外发现出现两条带，他认为一条时，意外发现出现两条带，他认为一条是松弛性是松弛性DNA，另一条可能是超螺旋，另一条可能是超螺旋DNA，从，从而发现了而发现了DNA的超螺旋。的超螺旋。 slide 53u各种生物DNA的超螺旋 现已知道绝大多数原核生物都是现已知道绝大多数原核生物都是共价封闭环状共价封闭环状(covalently closed circle,CCC)DNA分子，这种双分子，这种双螺 旋 环 状 分 子 再 度 螺 旋 化 成 为螺 旋
38、 环 状 分 子 再 度 螺 旋 化 成 为 超 螺 旋 结 构超 螺 旋 结 构 (superhelix或或supercoil)。有些有些单链环形单链环形DNA(如如174)或或双链线形双链线形DNA(如如噬菌体噬菌体)，在其生活周期的某一阶段，也必将其，在其生活周期的某一阶段，也必将其变为变为超螺旋形式超螺旋形式。对于真核生物来说，虽然其染色体多为对于真核生物来说，虽然其染色体多为线形分子线形分子但其但其DNA均与蛋白质相结合，两个结合点之间的均与蛋白质相结合，两个结合点之间的DNA形成一个突环形成一个突环(loop)结构，类似于结构，类似于CCC分子，分子，同样具有超螺旋形式同样具有超螺
39、旋形式。 原核生物原核生物DNADNA的三的三级结构：级结构：绝大多数原核生绝大多数原核生物的物的DNADNA都是共价都是共价封闭的封闭的环状环状双螺双螺旋。如果再进一旋。如果再进一步盘绕则形成麻步盘绕则形成麻花状的超螺旋三花状的超螺旋三级结构。级结构。 u 超螺旋结构的类型松驰型DNA（relax form DNA）超螺旋（Supercoiled DNA）超螺旋结构：正超螺旋 拧紧状态 负超螺旋 拧松状态（天然DNA主要以负超螺旋结构存在，以利于基因的表达） 负超螺旋（负超螺旋（Negative Supercoiled）：是指顺时针右手螺旋的DNA双螺旋以相反方向绕它的轴扭转而成，通过这种方
40、式，调节了DNA双螺旋本身的结构，松解了扭曲压力，使每个碱基对的旋转减少，甚至可打乱碱基配对。 slide 56松驰结构松驰结构 正超螺旋正超螺旋 负超螺旋负超螺旋57 向左捻向左捻向右捻向右捻松弛型松弛型正超螺旋正超螺旋负超螺旋负超螺旋 slide 58u超螺旋概念的基本要点是：超螺旋概念的基本要点是：（）初级螺旋处于（）初级螺旋处于松缠或紧缠松缠或紧缠状态；状态；（）与松弛形式相比具有额外的自由能。（）与松弛形式相比具有额外的自由能。l 这两点实际上是一种物理状态的两种表现。这两点实际上是一种物理状态的两种表现。所有的生物的所有的生物的DNA都具有负超螺旋，都具有负超螺旋，它与许多生命过程
41、密切相关。它与许多生命过程密切相关。l在溶液中和细胞内负超螺旋会部分地转变为在溶液中和细胞内负超螺旋会部分地转变为单链泡状结构单链泡状结构(下下图图)，这种单链泡状结构也是解除松缠作用造成的胁变的一种，这种单链泡状结构也是解除松缠作用造成的胁变的一种途径。途径。 slide 59单链泡状结单链泡状结构构 slide 60uDNA超螺旋的产生机制超螺旋的产生机制p在原核生物中，负超螺旋主要由在原核生物中，负超螺旋主要由DNA旋转酶旋转酶(DNA gyrase )引入到已存在的双链封闭环状分子中，此酶引入到已存在的双链封闭环状分子中，此酶沿拓扑异构复制叉进行移动，靠沿拓扑异构复制叉进行移动，靠解旋
42、酶解旋酶切断配对碱切断配对碱基，逐步解开基，逐步解开DNA聚合酶前面的双螺旋。这一过程聚合酶前面的双螺旋。这一过程需要水解需要水解ATP以提供能量。以提供能量。 在缺乏在缺乏ATP时，时，DNA旋转酶旋转酶也可使负超螺旋松弛，也可使负超螺旋松弛，但是这个作用与超螺旋化作用比较起来要低但是这个作用与超螺旋化作用比较起来要低10倍以倍以上。原核细胞中，这一过程是由上。原核细胞中，这一过程是由拓扑异构酶拓扑异构酶I和其他和其他的的拓扑异构酶拓扑异构酶II来负责的。来负责的。 slide 61在真核生物中，染色體在真核生物中，染色體DNADNA負超螺旋結構被組蛋白負超螺旋結構被組蛋白所固定，細菌染色體
43、所固定，細菌染色體DNADNA負超螺旋結構被類組蛋白負超螺旋結構被類組蛋白（HUHU，HDHD，NS1NS1，NS2 or DNA binding protein NS2 or DNA binding protein ）固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合固定；真核生物和細菌染色體未被蛋白結合的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌的區域可分爲鬆弛與不完全鬆弛狀態，嗜熱古菌染色體染色體DNADNA大部份爲鬆弛狀態，但它與大部份爲鬆弛狀態，但它與DNADNA結合蛋結合蛋白作用卻可使白作用卻可使DNADNA裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱裸露區呈超螺旋狀態。極端嗜熱古菌已經找出多種分子量爲古菌已經
44、找出多種分子量爲7 7、8 8、1010kDakDa的的DNADNA結結合蛋白。合蛋白。 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase) : 拓扑拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。持物体不变的性质。拓扑异构酶拓扑异构酶：是一类可改变：是一类可改变DNA拓扑性质拓扑性质的酶。对的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。能连接磷酸二酯键。可松弛可松弛DNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNA解链。解链。 slide 62 拓扑异构酶拓扑异构酶I（topo I）:又称切刻又称切刻-封闭酶封闭酶 (en
45、icking-closing nzyme) 。n在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。n 主要作用是切开主要作用是切开DNA双链中的双链中的单链单链(每次只作用每次只作用一条链一条链)，使，使DNA解链旋转中不打结，解链旋转中不打结，DNA变为松变为松弛状态再封闭切口，不需能量因子弛状态再封闭切口，不需能量因子ATP或或NAD。拓扑异构酶拓扑异构酶IIII（ topo II topo II）: : n在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶( (gyrase)gyrase)。n能切断能切断DNADNA双链双链，使螺旋松弛。在，使螺旋松弛。在ATPATP参与下，参与下，松弛的松弛的D
46、NADNA进入负超螺旋，再连接进入负超螺旋，再连接双链双链断端。断端。 slide 63uDNA超螺旋的产生机制超螺旋的产生机制p在真核细胞中，在真核细胞中，DNA的负超螺旋则主要是染色质的负超螺旋则主要是染色质的的 结构造成的。因为结构造成的。因为DNA在组蛋白八聚体外面在组蛋白八聚体外面缠绕的方向有利于缠绕的方向有利于DNA向松缠方向转变。在核小向松缠方向转变。在核小体组装过程中，也肯定有体组装过程中，也肯定有DNA拓扑异构酶参加。拓扑异构酶参加。在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶在许多真核生物中部发现了拓扑异构酶和拓扑和拓扑异构酶异构酶II。 slide 65常见的DNA分子形式一般以相
47、同核苷酸的线形双螺旋一般以相同核苷酸的线形双螺旋DNA分子的沉降常分子的沉降常数作为数作为1，其他各种分子取相对值。，其他各种分子取相对值。沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。沉降常数与电泳迁移率之间并不完全一致。I形形DNA：具有负超螺旋或正超螺旋的具有负超螺旋或正超螺旋的双链封闭环状双链封闭环状分子分子。相对沉降常数。相对沉降常数1.4l。I0形形DNA：没有超螺旋的双链封闭环状分子，也就是没有超螺旋的双链封闭环状分子，也就是松弛形式松弛形式(relaxed form )，相对沉降常数相对沉降常数1.14。II形形DNA：在一条链上或两条链上有一个或几个切刻在一条链上或两条链上有一个或几
48、个切刻的双链环状分子，又称为的双链环状分子，又称为切刻环切刻环(nicked cirle )，相对相对沉降常数沉降常数1.14。 形形DNA：线形双螺旋分子。相对沉降常数线形双螺旋分子。相对沉降常数1.00。坍缩坍缩DNA(collapsed DNA)：当当I形成形成I0形形DNA在碱变在碱变性或热变性时，其氢键断裂，而两条链无法分离，性或热变性时，其氢键断裂，而两条链无法分离，结果生成两条链紧密缠结的分子。坍缩结果生成两条链紧密缠结的分子。坍缩DNA具有异具有异常高的沉降常数，相对沉降常数约常高的沉降常数，相对沉降常数约3.0。单链环状单链环状DNA：相对沉降常数大约为相对沉降常数大约为1.
49、14。 线性单链线性单链DNA：相对沉降常数为相对沉降常数为1.30。环连环连DNA(catenated DNA catenane ):这是在这是在DNA复复制过程中的产物或由制过程中的产物或由DNA旋转酶催化生成，由两个旋转酶催化生成，由两个以上以上T形形DNA分子环连而成。分子环连而成。 以上八种以上八种DNA分子形式的转变表示于下图，其中前分子形式的转变表示于下图，其中前四种仍标以四种仍标以I、I0、II、后四种则分别以后四种则分别以(5)、(6)、(7)、(8)表示。表示。 slide 67表 9-2 不同类型 DNA 的三级结构及性质类 型形态拓扑结构沉 淀 系数电泳迁移率闭合环超螺
50、旋1.41最快闭合环松弛形1.41最慢开环松弛形1.14同型线形松弛形1.00中等速度第三节 DNA的变性与复性变性变性（denaturation）或解链解链（melting） 将双链DNA缓慢地加温，使其氢键断裂，双链解开，产生单链DNA分子的过程。复性复性（renaturation）或退火退火（annealing） 核酸分子在变性后，分开的互补链缓慢冷却，重新形成互补双连的过程。1.下列因素可导致DNA变性：高温、酸、碱、尿素、甲酰胺 常用的方法是热变性法和碱变性法。常用的方法是热变性法和碱变性法。2.DNA变性后物理性质发生的变化：（1）流体力学的性质发生改变：粘度下降，而沉降速度增加；
