1、五五 高效液相色谱分析高效液相色谱分析 高效液相色谱法的高效液相色谱法的出现出现、仪器仪器及及特点特点 高效液相色谱仪器结构高效液相色谱仪器结构 高效液相色谱基本原理高效液相色谱基本原理 高效液相色谱固定相和流动相高效液相色谱固定相和流动相 高效液相色谱梯度洗脱技术高效液相色谱梯度洗脱技术 高效液相色谱类型简介高效液相色谱类型简介 高效液相色谱法的出现高效液相色谱法的出现 由于气相色谱只能分析由于气相色谱只能分析M1000、高沸点、难挥发、高沸点、难挥发、热稳定差的样品就无能为力了，随着工业生产的需热稳定差的样品就无能为力了，随着工业生产的需要，高效液相色谱的研究成为一个迫切课题。要，高效液相
2、色谱的研究成为一个迫切课题。 液相色谱法开始阶段是用液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱大直径的玻璃管柱在室温在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法法，此方法柱效低柱效低、时间长时间长（常有几个小时）。（常有几个小时）。 在经典液相色谱法的基础上，于在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期，气相年代后期，气相色谱理论迅速发展以及色谱理论迅速发展以及高压泵高压泵的研制成功，为高效的研制成功，为高效液相色谱的发展奠定了基础，高效液相色谱又称高液相色谱的发展奠定了基础，高效液相色谱又称高压液相色谱法压液相色谱法(HPLC)，也称现代
3、液相色谱。，也称现代液相色谱。 Stein和和Moore获得了获得了1972年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖 （研（研制出氨基酸分析仪制出氨基酸分析仪 ） 返回高效液相色谱仪举例高效液相色谱仪举例高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点与经典液相色谱比较与经典液相色谱比较（四高）（四高） ：高压高压： 压力可达压力可达150300Kg/cm2。高速高速： 流速为流速为 0.110.0 mL/min。高效高效： 可达可达5000块塔板块塔板/米。在一根柱中同时分离成份米。在一根柱中同时分离成份可达可达100种。种。高灵敏度高灵敏度：紫外检测器灵敏度可达：紫外检测器灵敏度可达0.01ng(1ng=
4、109g)。同时消耗样品少。同时消耗样品少。 如用如用LichrosorbODS色谱柱，采用梯度洗脱，可在不色谱柱，采用梯度洗脱，可在不到到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分个组分.与气相色谱相比与气相色谱相比 高沸点、热不稳定有机化合物及生化试样的高效分离分析高沸点、热不稳定有机化合物及生化试样的高效分离分析方法。方法。 （l)l)气相色谱法分析对象只限于分析气相色谱法分析对象只限于分析气体气体和沸点较低的化和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的合物，它们仅占有机物总数的2020。对于占有机物总数近。对于占有机物总数近8080的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采
5、的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)(2)气相色谱采用流动相是气相色谱采用流动相是惰性气体惰性气体，它对组分没有亲和，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用中流动相可选用不同极性的液体不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于流动相对分离起很大作用
6、，相当于增加了一个控制和改进分离增加了一个控制和改进分离条件的参数条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 （3 3）气相色谱一般都在）气相色谱一般都在较高温度较高温度下进行的，而高效液相色下进行的，而高效液相色谱法则经常可在谱法则经常可在室温条件室温条件下工作下工作。5-2高效液相色谱仪器结构高效液相色谱仪器结构 色谱仪器的流程由液体流动相的色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统输液系统、进进样系统样系统、分离系统分离系统、检测系统检测系统、信号放大记录系统信号放大记录系统组成，其中组成，其中高压泵高压泵、色谱柱色谱柱和和检测系统检测系统是高效液相
7、是高效液相色谱的主要部件。色谱的主要部件。 复 式 阀色 谱 控 制 室混 合 室回瓶收高 压 泵压 力 表梯 度 洗 脱检 测 器（ 计 算 机 ）记 录 仪柱水六 通 阀进 样 口醇甲图 2.4 高 效 液 相 色 谱 仪 流 程 图返回输液系统输液系统 包括流动相储液瓶、过滤器、包括流动相储液瓶、过滤器、脱气装置脱气装置、高压泵高压泵、压力脉动阻尼器、压力脉动阻尼器、梯度洗脱装置梯度洗脱装置等部件组成等部件组成 返回脱气装置脱气装置 脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体。脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体。(1)(1)脱气是为了防止脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测
8、流动相从高压柱内流出时，释放出气泡。这些气泡进入检测器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。器后会使噪声剧增，甚至不能正常检测。(2)(2)溶解氧会与某溶解氧会与某些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性些流动相与固定相作用，破坏它们的正常功能。对水及极性溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。溶剂的脱气尤为重要，因为氧在其中的溶解度较大。 常用的脱气方法有：常用的脱气方法有：低压脱气法低压脱气法：电磁搅拌、水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽电磁搅拌、水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成，此空或加热过程中可能引起
9、流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成，此法法不适于二元以上溶剂组成不适于二元以上溶剂组成的流动相脱气。的流动相脱气。吹氦脱气法吹氦脱气法：氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在：氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在0.50.5公斤厘米压公斤厘米压力下保持力下保持10151015分钟，氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出，此法分钟，氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出，此法简单方便，适用于所有冲洗剂脱气，但由于氦气价格昂贵，在国内尚难简单方便，适用于所有冲洗剂脱气，但由于氦气价格昂贵，在国内尚难于普及。于普及。超声波脱气法超声波脱气法：将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱：将溶剂储
10、液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。一般气。一般500ml500ml溶剂约需超声溶剂约需超声2030min2030min即可达到驱气目的。此法方便，不即可达到驱气目的。此法方便，不影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。返回高压泵高压泵 目前高效液相色谱使用的高压泵分为目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压恒压和和恒流泵恒流泵，恒，恒流泵使输出的液体流量稳定，而恒压泵则使输出的液体压力流泵使输出的液体流量稳定，而恒压泵则使输出的液体压力稳定。恒流泵中有稳定。恒流泵中有往复泵往复泵、累积型往复泵累积型往复泵、注射泵注射泵，
11、恒压泵恒压泵有有气动放大泵气动放大泵。各种高压泵均具有以下性能：。各种高压泵均具有以下性能：(1) 泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢普通耐酸不锈钢或或优质耐酸优质耐酸不锈钢不锈钢。(2) 能在高压下连续上作。通常要求耐压能在高压下连续上作。通常要求耐压4050MPacm-2，能在，能在824h连续上作，压力平稳。连续上作，压力平稳。(3) 输出流量范围宽。一般在输出流量范围宽。一般在0.0110mL/min。(4) 输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器，大多数对流输出流量稳定可调。高效液相色谱使用的检测器，大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无
12、脉冲流量。这样可以量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低降低基线噪声基线噪声并获较好的并获较好的检测下限检测下限，流量控制的精密度应，流量控制的精密度应小于小于1，最好为最好为0.5，重复性最好为，重复性最好为0.5。 返回往复泵往复泵往复泵有两类，一种是活塞式，另一种是隔膜式往复泵有两类，一种是活塞式，另一种是隔膜式 形形成成脉脉冲冲式式供供液液 返回累积型往复泵累积型往复泵 累积型往复泵有两个泵头，以串联方式连接在一起，这累积型往复泵有两个泵头，以串联方式连接在一起，这样可以提供平稳的液流。所以如此是因为两级泵腔排液体积样可以提供平稳的液流。所以如此是因为两级泵腔排液体积不同
13、，第一级泵腔是第二级泵控的一倍不同，第一级泵腔是第二级泵控的一倍1-高压流动相出口；高压流动相出口；2-二级活塞；二级活塞；3-一级活塞；一级活塞；4-流动相流动相 返回注射泵注射泵 注射泵类似于注射器，用一台步进电机驱动注射泵的活塞注射泵类似于注射器，用一台步进电机驱动注射泵的活塞把液流从泵腔中挤出泵腔体积较大把液流从泵腔中挤出泵腔体积较大(250500mL)，密封性好的，密封性好的活塞把泵腔中的液体等速流出活塞把泵腔中的液体等速流出. 1-电机；电机；2-涡轮；涡轮；3-螺旋；螺旋；4-螺杆；螺杆；5-活塞；活塞；6-至色谱柱至色谱柱返回气动放大泵气动放大泵 气动放大泵是利用气体为动力源气
14、动放大泵是利用气体为动力源 。适合于液相。适合于液相色谱柱的装填，近代的液相色谱仪不用这种泵。色谱柱的装填，近代的液相色谱仪不用这种泵。 1-接色谱柱；接色谱柱；2-流动相入口；流动相入口；3-高压气入口；高压气入口；4-气体放空气体放空 返回梯度洗脱装置梯度洗脱装置外梯度外梯度: 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合室，用高压输液泵混合液输入色谱柱。室，用高压输液泵混合液输入色谱柱。内梯度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过比例调节阀，将两种或多种不通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。同极性的溶剂按一定的比例抽
15、入高压泵中混合。进样系统进样系统 通常使用耐高压的通常使用耐高压的六通阀进样装置六通阀进样装置和和自动自动进样系统进样系统。分。分部分进样部分进样和和整体进样整体进样。返回自动进样系统自动进样系统分离系统分离系统- -色谱柱色谱柱 柱材料及规格柱材料及规格 柱连接方式柱连接方式 柱温控制柱温控制 柱填充技术柱填充技术 返回柱材料及规格柱材料及规格 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16mm，柱长，柱长1050cm。发展趋势是。发展趋势是减小填减小填料粒度料粒度和和柱径提高柱效柱径提高柱效。 采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为采用直形柱管，标准填充柱柱管内径为4.6mm或或3.9m
16、m，长，长1050cm，填料粒度填料粒度510m时，柱效达时，柱效达500010000块块/m理论塔板数。理论塔板数。返回柱连接方式柱连接方式 柱接头通过柱接头通过过滤片过滤片与色谱柱管连接。在色谱柱管与色谱柱管连接。在色谱柱管的上下的上下两端两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料，此烧结片上的孔径烧结材料，此烧结片上的孔径小于小于填料颗粒直径，却填料颗粒直径，却可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小的机可让流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以保护色谱柱。械杂质以保护色谱柱。 返回柱温控制柱温控制 以下几种情况需精确控制柱温：以下
17、几种情况需精确控制柱温：（1）在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有）在一些法定标准分析方法中，要求保留时间具有再现性再现性。（2）必须通过改变）必须通过改变柱温柱温来提高分离效率。来提高分离效率。（3）对）对高分子化合物高分子化合物或或粘度大粘度大的样品，柱温必须的样品，柱温必须高于高于室温。室温。（4）具有）具有生物活性生物活性的生物分子，要求分析时柱温应的生物分子，要求分析时柱温应低于低于室温。室温。（5）对某些组成）对某些组成复杂复杂的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，的样品，在单一色谱柱不能实现完全分离，需要使用需要使用二维色谱技术二维色谱技术，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱
18、温，利用柱切换，使两根色谱柱在不同柱温下操作，以实现多组分的完全分离。下操作，以实现多组分的完全分离。返回柱填充技术柱填充技术 填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小填充色谱柱的方法，根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种。微粒大于有干法和湿法两种。微粒大于20m的可用的可用干法填充，要边填充边敲打和震动，要填得干法填充，要边填充边敲打和震动，要填得均匀扎实。直径均匀扎实。直径10m以下的微粒，不能用以下的微粒，不能用干法填充，必须采用湿法。干法填充，必须采用湿法。 干法装柱与气相色谱法相似。干法装柱与气相色谱法相似。 湿法装柱湿法装柱又称等密度匀桨装填法。又称等密度匀桨装填法。 返回湿法装柱湿
19、法装柱 常用常用对二氧六环对二氧六环和和四氯化碳四氯化碳，或叫氯乙烯和四溴乙，或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶剂，根据固定相的密度不同，采用不同的溶烷等溶剂，根据固定相的密度不同，采用不同的溶剂比例，配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂。剂比例，配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂。 1-顶替液槽；顶替液槽；2-高压泵；高压泵；3-压力表；压力表；4-三通阀；三通阀；5-匀浆罐；匀浆罐；6-色色谱柱；谱柱；7-废液槽废液槽 返回检测系统检测系统 高效液相色谱检测器按适用性分为高效液相色谱检测器按适用性分为选择选择性检测器性检测器和和通用型检测器通用型检测器。 紫外和紫外紫外和紫外- -可见分光光度检测
20、器可见分光光度检测器 示差折光检测器示差折光检测器 荧光检测器荧光检测器 电化学检测器电化学检测器 返回紫外和紫外紫外和紫外-可见分光光度检测器可见分光光度检测器 检测原理：检测原理： 紫外及紫外紫外及紫外可见光吸收光度检测器相当于一台吸收可见光吸收光度检测器相当于一台吸收光度计，在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与光度计，在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与吸光度的关系遵循吸光度的关系遵循Beer定律：定律：A=log(I0/I)=bc 式中：式中：A为吸光度，为吸光度，I0为入射光强度，为入射光强度，I为透射光强度，为透射光强度，是样品的摩尔吸光度，是样品的摩尔吸光度，b为流通池的光程
21、长度，为流通池的光程长度，c为为样品浓度。样品浓度。 示差折光检测器示差折光检测器 检测器原理：检测器原理：示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变化来测定样品的浓度。各种物质都具有不同的折射率化来测定样品的浓度。各种物质都具有不同的折射率,溶液的折射率是溶剂溶液的折射率是溶剂(洗脱剂洗脱剂)和溶质和溶质(待测组分待测组分)各自的各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和。设溶液的折射率为折射率乘以各自的摩尔浓度之和。设溶液的折射率为n，则，则:式中式中c1和和c2为溶剂和溶质的为溶剂和溶质的摩尔分数摩尔分数，c1+c2=1；n1和和n2为溶剂和溶质
22、的折光指数。为溶剂和溶质的折光指数。2211ncncn2121212122122211)()()1 (cnnnnncnnnncncncncn 荧光检测器荧光检测器 检测原理：检测原理： 当某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光当某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光线而处于不稳定的激发状态，紧接着线而处于不稳定的激发状态，紧接着辐射出辐射出比紫外光波更长的光线，即荧光。在被测溶比紫外光波更长的光线，即荧光。在被测溶质浓度较低时，溶质受激发而发生的质浓度较低时，溶质受激发而发生的荧光强荧光强度度与被测溶质的与被测溶质的浓度成正比浓度成正比关系。关系。 仪器结构仪器结构 高灵敏度、高选高灵敏度、高选择
23、性；择性； 对多环芳烃，维对多环芳烃，维生素生素B、黄曲霉素、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；类化合物等有响应；返回电化学检测器电化学检测器 电化学检测器是根据电化学分析方法而设计电化学检测器是根据电化学分析方法而设计的检测器。主要有两种类型：一种是根据溶的检测器。主要有两种类型：一种是根据溶液的液的导电导电性质，通过测定流经检测器的离子性质，通过测定流经检测器的离子溶液电导率的大小来测量离子浓度，此类检溶液电导率的大小来测量离子浓度，此类检测器是测器是高效离子色谱高效离子色谱采用的主要检测器；另采用的主要检测器；另一类是根据
24、化合物在一类是根据化合物在电解池中工作电极上电解池中工作电极上发发生的生的氧化氧化-还原反应还原反应，通过测量，通过测量电位电位、电流电流和和电量电量来确定化合物在溶液中的来确定化合物在溶液中的浓度浓度。 返回5-3高效液相色谱基本原理高效液相色谱基本原理表征液相色谱柱填充性能的重要参数表征液相色谱柱填充性能的重要参数 总孔率总孔率、柱压力降柱压力降和和柱渗透率柱渗透率高效液相色谱塔板理论高效液相色谱塔板理论高效液相色谱的速率理论高效液相色谱的速率理论 返回总孔率总孔率式中：式中：F F流动相的体积流速，流动相的体积流速，cmcm3 3s s； u u流动相的平均线速，流动相的平均线速，cm/
25、s;cm/s; r r一柱内径的半径，一柱内径的半径，cm;cm; t tM M柱的死时间；柱的死时间； L L柱长，柱长，cmcm； V V色谱柱的空体积，色谱柱的空体积，cmcm3 3。 T T表达了色谱柱填料的多孔性能，当使用全多孔硅胶固定相表达了色谱柱填料的多孔性能，当使用全多孔硅胶固定相时，时，T T约为约为0.850.85，使用非多孔的玻璃微珠，使用非多孔的玻璃微珠( (或硅胶或硅胶) )固定相时，固定相时，T T约为约为0.400.40，可认为是柱中颗粒之间的孔率，用，可认为是柱中颗粒之间的孔率，用表示。表示。返回柱压力降柱压力降式中式中 一流动相的粘度，一流动相的粘度，MPaM
26、Pas s; ; k k0 0色谱柱的比渗透系数；色谱柱的比渗透系数； d dp p固定相颗较直径，固定相颗较直径，m m； 色谱柱的阻抗因子；色谱柱的阻抗因子； P P1 1、P P0 0色谱柱的入口压力和出口压力，色谱柱的入口压力和出口压力，MPaMPa。 返回柱渗透率柱渗透率 柱渗透率柱渗透率KF ：表示流动相通过柱子的难易程度。在：表示流动相通过柱子的难易程度。在高效液相色谱法中，由于使用液体流动相，其高效液相色谱法中，由于使用液体流动相，其粘度粘度大大于气体流动相，且固定相粒度又小，为保证柱子在较于气体流动相，且固定相粒度又小，为保证柱子在较低压力下正常操作，总希望柱渗透率要大。低压
27、力下正常操作，总希望柱渗透率要大。 返回高效液相色谱的速率理论高效液相色谱的速率理论 其中：其中：Cd为填充系数，为一常数；为填充系数，为一常数； Cm是容量因子是容量因子k的函数，为一常数，其值取决于柱的函数，为一常数，其值取决于柱直径、形状和填充状况，当柱填充均匀紧密时，其直径、形状和填充状况，当柱填充均匀紧密时，其值下降；值下降； Csm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子分数以及容量因子k有关，为一常数；有关，为一常数； Cs是与容量因子是与容量因子k有关的常数；有关的常数； Dm为组分在流动相中的扩散系数，比气相扩散系数为组
28、分在流动相中的扩散系数，比气相扩散系数小小45个数量级；个数量级； Ds为组分分子在固定液内的扩散系数；为组分分子在固定液内的扩散系数； uDdCDdCDdCuDCdCuuBAHsfsmpsmmpmmdp)(2222返回5-4 高效液相色谱流动相高效液相色谱流动相 一、液相色谱的流动相一、液相色谱的流动相 流动相特性流动相特性 流动相类别流动相类别 流动相选择流动相选择 选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题返回 （1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况。动相组成改变，极性改变，
29、可显著改变组分分离状况。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性极性小于小于固定相的极性，称为固定相的极性，称为正相液正相液-液色谱法液色谱法，极性柱，极性柱也称正相柱。也称正相柱。 （3）若流动相的极性）若流动相的极性大于大于固定液的极性，则称为固定液的极性，则称为反相反相液液-液色谱液色谱，非极性柱也称为反相柱。，非极性柱也称为反相柱。 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 流动相的特性流动相的特性返回流动相类别流动相类别 按流动相按流动相组成组成分：单组分和多组分；分：单组分和多组分； 按按
30、极性极性分：极性、弱极性、非极性；分：极性、弱极性、非极性； 按按使用方式使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗。分：等度淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。间。流动相选择流动相选择 在选择溶剂时，溶剂的在选择溶剂时，溶剂的极性极性是选择的重要依据。是选择的重要依据。 采用正相液采用正相液-液分配分离时：首先选择中等
31、极性溶剂，液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序：常用溶剂的极性顺序： 水水(最大最大) 甲酰胺甲酰胺 乙腈乙腈 甲醇甲醇 乙醇乙醇 丙醇丙醇 丙酮丙酮 二氧六环二氧六环 四氢呋喃四氢呋喃 甲乙酮甲乙酮 正丁醇正丁醇 乙酸乙酯乙酸乙酯 乙醚乙醚 异丙醚异丙醚 二氯甲烷二氯甲烷氯仿氯仿溴乙烷溴乙烷苯苯四氯化碳四氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最
32、小)返回选择流动相时应注意的几个问题选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用）尽量使用高纯度试剂作流动相高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免）避免流动相与固定相流动相与固定相发生发生作用作用而使柱效下降或损坏而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀，防止产生沉淀并在柱中沉积。并在柱中沉积。（4）流动相同时还应）流动相同时还应满足检测器
33、的要求满足检测器的要求。当使用紫外检。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。测器时，流动相不应有紫外吸收。返回5-5 高效液相色谱梯度洗脱技术高效液相色谱梯度洗脱技术一、单一洗脱剂：一、单一洗脱剂：二、二、等度洗脱等度洗脱：流动相的：流动相的k值恒定值恒定三、梯度洗脱：改变流动相的三、梯度洗脱：改变流动相的k值值 梯度变化速率梯度变化速率 梯度范围梯度范围返回等度洗脱等度洗脱返回梯度变化速率梯度变化速率返回梯度范围梯度范围 是指两种流动相起止百分比之差。 如（起）80%水：20%甲醇20%水：80%甲醇（止） 初始的试探性实验可进行一次全范围梯度(即5100B)。B是指甲醇或乙腈等。 返回
34、5-6 高效液相色谱类型简介高效液相色谱类型简介 液液-固吸附色谱固吸附色谱 液液-液分配色谱液分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 离子色谱离子色谱 排阻色谱排阻色谱 亲和色谱亲和色谱 高效液相色谱分离方法的选择高效液相色谱分离方法的选择返回液液-固吸附色谱固吸附色谱 固定相固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。返回液液-液分配色谱液分
35、配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相色谱正相色谱），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相色谱反相色谱）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失较多，较少采用； 化学键合固定相化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。返回正相高效液相色谱正相高效液相色谱 正相高效液相色谱是指以亲水性的填料作固定相(如在硅胶上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相)，以疏水性溶剂或混
36、合物作流动相(如己烷)的液相色谱。在液相色谱发展的早期，类似于气相色谱把含羟基、氨基或氰基的极性固定相涂渍在硅胶上这样容易被流动相冲洗掉，现在几乎都使用键合固定相了。 固定相极性固定相极性大大 硅胶硅胶-OH(或双或双-OH)，硅胶硅胶-CN 流动相极性流动相极性小小 烃类烃类+适量极性溶剂适量极性溶剂(CHCl3，CH3OH，CH3CN) 正正相键合色谱法相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于极性或中等极性化合物的分离。多用于极性或中等极性化合物的分离。还可用于分离还可用于分离异构体、异构体、极性不同的化合物以及不同类型的化合物。极性不同的化合物以及不同类型的化合物。 返回反相高效液相色谱反
37、相高效液相色谱 反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。如在硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相，以极性强的水、甲醇、乙腈作流动相的高效液相色谱。 固定相极性小固定相极性小 如硅胶如硅胶-C18，硅胶硅胶-苯基；苯基； 流动相极性大流动相极性大 甲醇甲醇-水、乙腈水、乙腈-水、水和无机盐的缓冲液。水、水和无机盐的缓冲液。 反相键合色谱法反相键合色谱法 分析对象分析对象 多用于多环芳烃多用于多环芳烃(PAHs)等低极性化合物分离；改变流等低极性化合物分离；改变流动相配比，动相配比，也可分离极性化合物；缓冲液可用于易离也可分离极性化合物；缓冲液
38、可用于易离解的化合物，如有机解的化合物，如有机有机酸、有机酸、有有机机碱和酚碱和酚类类。 返回时间，时间，min固定相：固定相：C1固定相：固定相：C8固定相：固定相：C18硅胶硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；尿嘧啶；2-苯酚；苯酚；3-乙酰苯；乙酰苯；4-硝基苯；硝基苯；5-苯甲酸甲酯；苯甲酸甲酯；6-甲苯甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。返回正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系正相色谱正相色谱低极性流动相低极性流动相反相
39、色谱反相色谱高极性流动相高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间时间时间时间时间待测物极性：待测物极性：ABC返回 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数
40、键合相来说，以分配机理为主。定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。 通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于 以不含水或醇的流动相。以不含水或醇的流动相。Si-R(或或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格氏反应不方便。使 用水溶液作流动相时，其用水溶液作流动相时，其pH应在应在4-8之间。之间。Si-O-Si-R：不水
41、解，热稳定性好，在不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。范围内对水稳定。HClSiROSiiClSROHSi)(RSiClSiOHSi)(ROSiOHROHSi)(33RMgClRLiSOClSOCl22 硅硅烷烷化化方方法法三三先先氯氯化化方方法法二二硅硅酯酯化化方方法法一一或或化学键合固定相化学键合固定相返回离子交换色谱离子交换色谱 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与
42、离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 应用应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。返回固定相固定相按固定相制作方法可分为：按固定相制作方法可分为： 多孔型离子交换树脂多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型包括微孔型和大孔型)； 表面多孔型表面多孔型(包括薄膜型包括薄膜型)离子交换树脂；离子交换树脂； 离子交换键合型。离子交换键合型。 类型类型 官官能能团团 强强阳阳离离子子交换交换剂剂 -SO3- 阳阳离离子子交换交换剂剂 弱弱阳阳离离子子交换交换
43、剂剂 -CO2- 强强阴阴离离子子交换交换剂剂 -NR3+ 阴阴离离子子交换交换剂剂 弱弱阴阴离离子子交换交换剂剂 -NH2+ 流动相流动相 离子交换色谱流动相为离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液盐类缓冲溶液(有一定有一定pH和离子和离子强度强度) ，通过改变，通过改变pH、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试、缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比剂和配位剂等条件来控制分配比k，改变交换剂的选择性，改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。进而影响样品待测物的分离。返回离子色谱离子色谱 离子色谱(IC)是70年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各
44、种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高2个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。 为解决此问题，1975年Small 提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。 该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。返回排阻色谱排阻色谱固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布) 原理原理：按分子大小分离。小
45、分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100105范围内的化合物按质量分离。 返回固定相固定相类型类型 材料材料 型号型号 特点特点 流动相流动相 葡萄糖凝胶葡萄糖凝胶 Sephadax 水水 软性凝胶软性凝胶 聚苯乙烯聚苯乙烯 Bio-head-S 溶胀溶胀,小分小分子分离子分离 有机溶剂有机溶剂 聚苯乙烯聚苯乙烯 Styragel 有机溶剂有机溶剂 半刚性凝胶半刚性凝胶 聚乙酸酯聚乙酸酯 Emgel(OR) 溶胀溶胀较小较小流速较小流速较小 有机
46、溶剂有机溶剂 玻璃珠玻璃珠 CPG-10 有机溶剂和水有机溶剂和水 刚性凝胶刚性凝胶 多孔硅胶多孔硅胶 Porasil 刚性大、刚性大、高高流速分离流速分离 有机溶剂和水有机溶剂和水 返回亲和色谱亲和色谱 原理原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。返回高效液相色谱分离方法的选择高效液相色谱分离方法的选择分子量分子量 水溶水溶性性 方方 法法 流动相流动相 可溶可溶 排阻色谱排阻色谱 水水 2000 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱 水水 分配色谱分配色谱(同系物同系物) 各种各种 吸附色谱吸附色谱(异构物异构物) 各种各种 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱(分子大小分子大小) 各种各种 反相液液色谱反相液液色谱 各种各种 可溶但不解离可溶但不解离 排阻色谱排阻色谱 水水 阳离子交换色谱阳离子交换色谱(碱碱) 缓冲液缓冲液 可溶且不解离可溶且不解离 阴离子交换色谱阴离子交换色谱(酸酸) 缓冲液缓冲液 2000 可溶离子或非离子可溶离子或非离子 反相离子色谱反相离子色谱 缓冲液缓冲液 返回
