1、过氧化物酶过氧化物酶( () )活性的测定活性的测定愈创木酚法愈创木酚法一、实验原理一、实验原理过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物。应，产物为醌类化合物。实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物。在此酶存在下，在此酶存在下，H H2 2O O2 2 将愈创木酚氧化生成将愈创木酚氧化生成茶褐色产物。此产物在茶褐色产物。此产物在470nm 470nm 有最大光吸有最大光吸收，故可通过收，故可通过470nm470nm处的吸光度变化测定过处的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。氧化物酶的活性。二、材料和设备二、材料和设备、材料
2、、材料 ：马铃薯块茎：马铃薯块茎 、仪器设备：、仪器设备：751 751 型分光光度计、离心机、研型分光光度计、离心机、研钵、钵、25ml 25ml 容量瓶、量筒、试管、吸量管。容量瓶、量筒、试管、吸量管。 、试剂：、试剂：0.05ml/L0.05ml/L愈创木酚溶液，愈创木酚溶液，0.05ml/L0.05ml/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液(pH5.5)(pH5.5)， 2%H2%H2 2O O2 2，0.1mol/L0.1mol/L儿茶酚溶液，儿茶酚溶液，20%20%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液三、实验步骤三、实验步骤、酶液的制备、酶液的制备取取5.0g5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放洗净去
3、皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀入研钵中。加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于浆。将匀浆液全部转入离心管中，于3000g3000g水中离心水中离心10min10min，上清液转入，上清液转入25ml 25ml 容量瓶容量瓶中。沉淀用中。沉淀用5ml5ml磷酸缓冲液再提取次，上磷酸缓冲液再提取次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。保存备用。、过氧化物酶活性的测定、过氧化物酶活性的测定 酶活性测定的反应体系包括酶活性测定的反应体系包括:2.9ml :2.9ml 0.05mol/L0.05mol/L磷
4、酸缓冲液、磷酸缓冲液、1.0ml 2%H1.0ml 2%H2 2O O2 2、1.0ml 0.05mol/L 1.0ml 0.05mol/L 愈创木酚和愈创木酚和0.1ml0.1ml酶液。酶液。 以在沸水中加热以在沸水中加热5min5min的酶液为对的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，立即于后，立即于3737水浴中保温水浴中保温15min15min，然后迅，然后迅速转入冰浴中，并加入速转入冰浴中，并加入2.0ml 20%2.0ml 20%三氯乙三氯乙酸终止反应。然后，过滤酸终止反应。然后，过滤( (或或5000g 5000g 离心离心10min
5、),10min),滤液适当稀释，用滤液适当稀释，用751751型分光光度型分光光度计在计在470nm470nm波长下测定反应体系的吸光度。波长下测定反应体系的吸光度。四、实验结果四、实验结果 以每以每minmin内内A A470470变化变化0.010.01为为1 1个过氧化物酶活力个过氧化物酶活力单位单位 酶活力酶活力=D D 酶的比活力酶的比活力=D D 式中，式中， A A为反应时间内吸光度的变化；为反应时间内吸光度的变化；W W为马铃为马铃薯鲜重（薯鲜重（g g）；）；t t为反应时间（为反应时间（minmin）；）；D D为稀释倍数，为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数即
6、提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数A0.01tA0.01WtCATCAT过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶活性测定方法 过氧化氢酶过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)(Hydrogen Peroxidase)又名触酶又名触酶(Catalase(Catalase，CAT)CAT)，是一类以铁卟，是一类以铁卟琳为辅基的结合酶，由琳为辅基的结合酶，由4 4个亚基组成，分子个亚基组成，分子量为量为240 000240 000。存在于动植物组织与细胞中。存在于动植物组织与细胞中的氧化还原酶类，它专一性地将细胞代谢的氧化还原酶类，它专一性地将细胞代谢产生的过氧化氢分解成产生的过氧化氢分解成H
7、 H2 2O O和和0 02 2，避免了，避免了H H2 20 02 2在体内积累，从而可维持体内正常的活性在体内积累，从而可维持体内正常的活性氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧水平。是最早发现的与种子活力有关的氧化酶类之一氧化酶类之一. .过氧化氢酶的应用：过氧化氢酶的应用：被用于食品包装，防止食物被氧化。被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。过氧化物的。它还被用在它还被用在隐形眼镜隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清
8、洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加酶和过氧化氢，目的是增加表皮表皮上层的细胞氧量。上层的细胞氧量。植物细胞中的过氧化物酶体参与了植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸光呼吸（利用氧气并生成（利用氧气并生成二氧化碳二氧化碳）和共生性氮固定（将和共生性氮固定（将氮气氮气(N2(N2）解离为活性氮原子）。细胞被）解离为活性氮原子）。细胞被病原体病原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗感染时，过
9、氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物微生物试剂。试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的重要指标。重要指标。过氧化氢酶的测定：化学测定法：高锰酸钾滴定法，碘量法。光度法：紫外分光光度法，荧光分析法，化学发光法。电化学法：极谱氧电极法，电流测定法，电泳一染色法。放射化学测定法。简易气量测定法。高锰酸钾滴定法： 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系
10、统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 。即可求出消耗的H2O2的量。酶活性用每克鲜重样品酶活性用每克鲜重样品1min1min内分解内分解H H2 2O O2 2的毫克数的毫克数表示：表示： 酶活酶活(mgH(mgH2 2O O2 2/gFWmin)=/gFWmin)= 式中式中 A A对照对照KMnOKMnO4 4滴定毫升数；滴定毫升数； B B酶反应后酶反应后KMnOKMnO4 4滴定毫升数；滴定毫升数； V VT T酶液总量（酶液总量（mlml）；）； V V1 1反应所用酶液量（反应所用酶液量（mlml）; ; W
11、W样品鲜重（样品鲜重（g g）；）； 1.71ml 0.1mol/L 1.71ml 0.1mol/L的的KMnOKMnO4 4相当于相当于1.7mg H1.7mg H2 2O O2 2。 紫外分光光度法紫外分光光度法: :H H2 2O O2 2在在240nm240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度氢，使反应溶液吸光度(A(A240240) )随反应时间而降低。根据测随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 以以1min1min内内A A240240减少
12、减少0.10.1的酶量为的酶量为1 1个酶活单位（个酶活单位（u u）。）。 过氧化氢酶活性过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=(u/gFW/min)= 式中式中 A A240 240 = A= AS0S0 A AS0S0加入煮死酶液的对照管吸光值；加入煮死酶液的对照管吸光值； A AS1S1, A, AS2S2样品管吸光值；样品管吸光值； Vt Vt粗酶提取液总体积（粗酶提取液总体积（mlml）；）； V V1 1测定用粗酶液体积（测定用粗酶液体积（mlml）；）； FW FW样品鲜重（样品鲜重（g g）；）； 0.1A 0.1A240240每下降每下降0.10.1为为1 1个酶活单位（个
13、酶活单位（u u）；）； t t加过氧化氢到最后一次读数时间（加过氧化氢到最后一次读数时间（minmin）。）。方法比较：方法比较：研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量的样品测定。其优点是不需要任何特殊的仪器，适用性比较广泛。紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、快速、检测线相对较低得到优点。但是对于测定底物或产物改变量方面不太准确。 总结：综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时，影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、酸度、温度
14、及重金属的含量等；并且各种方法的准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定CAT活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择适合的测定的方法。抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定 在茶叶中实验原理 APX（抗坏血酸过氧化物酶）催化AsA与H2O2反应而使H2O2:2AsA+ H2O22MD-AsA( 单脱氢抗坏血酸)+2H2O。抗坏血酸过氧化物酶是以抗坏血酸为电子供体的，APX首先与H2O2形成中间复合物，中间复合物接着氧化AsA形成产物，当AsA未被复合物利用时，APX失活。只要AsA能够再生，APX就能充分进行催化反应，从而保护叶绿体维持正常的光合能力。APX酶液的制备 称取0.5g的茶树鲜叶
15、剪碎，加入适量的石英砂、PVPP和7.5mL酶提取液，在冰浴中充分研磨，离心（10000g、4、20min）取上层清夜1mL，分装于小离心管中置于4备用或-20保存。APX活性的测定提取液：50mmol/LPBS（磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液），pH7.8；2mmol/L AsA；5mmol/L EDTA。 反应液：50mmol/LPBS，pH7.0；0.5mmol/L AsA；0.1 mmol/L EDTA。在三个比色皿中各加入20L鲜叶APX粗酶液，再加入3mL反应液；1号比色皿中不加AsA和H2O2启动反应；每10s连续记录室温下290nm吸光值的变化X。室温下每一分钟氧化1molAsA
16、的酶量作为一个酶活性单位（U）。计算公式计算公式每克鲜叶每克鲜叶APXAPX的酶活性的酶活性U=U=（X X7.57.510001000606010001000）/ /（m m2.82.820201010）上式中，上式中，X X：ODOD值的变化；值的变化；7.57.5：每克材料：每克材料提取提取7.5mL7.5mL粗酶液；粗酶液；10001000：将：将mlml转化成转化成LL；6060：将：将1min1min转化成转化成60s60s；10001000：将：将mmolmmol转化转化成成molmol；m m：鲜叶的重量，单位为：鲜叶的重量，单位为g g；2.82.8：吸光系数吸光系数mmol
17、/L cmmmol/L cm；2020：用：用20L20L酶液进行酶液进行活性测定；活性测定；1010：每：每10s10s记录吸光值的变化。记录吸光值的变化。测定茶树鲜叶测定茶树鲜叶APXAPX活性的最佳条件活性的最佳条件 PVPP PVPP的加入量为鲜叶重的的加入量为鲜叶重的1.51.5倍，提取液倍，提取液pHpH为为7.87.8，反应液，反应液pHpH为为7.07.0，底物，底物AsAAsA浓度为浓度为0.5mmol/L0.5mmol/L。注意事项：注意事项：（1 1）由于测定反应是通过测定反应底物）由于测定反应是通过测定反应底物AsAAsA的降的降低来计算低来计算APXAPX活性，因此所
18、加的酶量一般不宜过大活性，因此所加的酶量一般不宜过大，应使加液量控制在，应使加液量控制在60s60s内，使产生的内，使产生的A A290290光值下光值下降呈良好的线性关系。降呈良好的线性关系。（2 2）由于此反应中）由于此反应中AsAAsA和和H H2 2O O2 2量都很少，可以将量都很少，可以将30%30%的的H H2 2O O2 2稀释稀释500500倍，在测定时直接吸取倍，在测定时直接吸取15L15L的的H H2 2O O2 2与与3mL3mL反应液将加入到比色皿中，启动反应。反应液将加入到比色皿中，启动反应。（3 3）H H2 2O O2 2由于本身对由于本身对AsAAsA的氧化作
19、用在测定时间的氧化作用在测定时间内可以忽略不计。内可以忽略不计。超氧化物歧化酶（SOD）的活性测定黄嘌呤氧化酶法黄嘌呤氧化酶法原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（生超氧阴离子自由基（O O2 2- -），后者氧化羟胺形成），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SODSOD时时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度使
20、形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的被测样品中的SODSOD活力。活力。实验试剂： 硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌呤氧化酶，醋酸等。实验步骤：实验步骤：计算方法：每毫升反应液中每毫升反应液中SOD SOD 抑止率达抑止率达5050时对应时对应的的SOD SOD 量为一个量为一个SOD SOD 活力单位（活力单位（U U），待测），待测样品中的样品中的SOD SOD 活力由下式计算：活力由下式计算：SODSOD抑制率（）（抑制率（）（A2-A1A2-A1）/A2/A2100% 100% SO
21、D SOD 活力（活力（U/mlU/ml）（）（A2-A1A2-A1）/A2/A2100%100%5050反应体系的稀释倍数反应体系的稀释倍数样本测试前的稀释倍数样本测试前的稀释倍数 式中：式中：A1:A1:测定管的吸光值；测定管的吸光值；A2:A2:空白管的空白管的吸光值。吸光值。邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法原理：原理： 在碱性条件下在碱性条件下, , 邻苯三酚迅速氧邻苯三酚迅速氧化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间化释放出超氧化物阴离子，生成有色中间产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反产物，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。应时间呈良好的线性关系。 SOD SOD
22、加入邻苯加入邻苯三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴三酚自氧化反应体系后，催化超氧化物阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧成受阻，导致吸光值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定化速率降低，可作为测定 SOD SOD 活性的理论活性的理论依据。依据。1.1.试剂：试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液缓冲液(pH8.2(pH8.2内含内含 2mmol/L EDTA) 2mmol/L EDTA)0.2mol/L 0.2mol/L （TrisTris）三羟甲基氨基甲烷）三羟甲
23、基氨基甲烷( (内含内含 4mmol/L 4mmol/L 乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸EDTA )100ml EDTA )100ml 与与 0.2mol/L 0.2mol/L HCl44.76ml HCl44.76ml 混合加双蒸水至混合加双蒸水至 200ml 200ml调调 pH8.2pH8.20.01;0.01;邻苯三酚邻苯三酚(45mmol/L)(45mmol/L)以以 10mmol/LHCl 10mmol/LHCl 配制成配制成 6mmol/L 6mmol/L溶液存放于冰溶液存放于冰箱备用。箱备用。 2.2.仪器仪器: : 紫外分光光度计，酸度计，恒温紫外分光光度计，酸度计，恒温水浴锅水浴
24、锅实验步骤：实验步骤：（1 1）. .邻苯三酚自氧化速率测定：邻苯三酚自氧化速率测定：在试管中加入在试管中加入4.5ml 50mmol/LTris4.5ml 50mmol/LTris缓冲溶液，于缓冲溶液，于2525保温保温20min,20min,加入加入101020ul 30mmol/L20ul 30mmol/L邻苯三邻苯三酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于酚，立即计时并摇匀，倾于比色杯内，于325nm325nm下，每隔下，每隔1min1min测吸光值一次，空白以测吸光值一次，空白以10mmol/L 10mmol/L HClHCl代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在代替邻苯三酚，要求自氧化速率控制在0.070 0.070 OD/minOD/min左右。左右。 . .SODSOD活性测定：活性测定： 将样液加入到将样液加入到TrisTris缓冲溶液中，其余步骤同自缓冲溶液中，其余步骤同自氧化速率测定方法。氧化速率测定方法。 活力单位定义：将一定条活力单位定义：将一定条件下使每毫升反应液自氧化速率抑制件下使每毫升反应液自氧化速率抑制50%50%的酶量的酶量定义为一个单位（定义为一个单位（u u）。）。
