1、Chaper 12 核酸的酶促降解和核苷酸代谢核酸的酶促降解和核苷酸代谢1 核酸的消化和酶促降解2 核苷酸的分解代谢3 核苷酸的生物合成和调节4 核苷酸合成的抗代谢物1 核酸的消化和酶促降解核苷酸是DNA和RNA的前体, 是细胞内化学能流通领域中的载体（ATP， GTP）；是NAD、FAD和 CoA等的重要成份；在糖代谢中也有重要作用。1.1 核酸的消化蛋 白 质胰 核 酸 酶胰 肠 核 苷 酸 酶磷 酸碱 基戊 糖核 苷单 核 苷 酸核 酸 ( R N A 及 D N A )食 物 核 蛋 白核酸酶(nuclease) 是水解核苷酸之间磷酸二酯键的酶，在核酸降解和周转中起着重要作用，可分为按
2、照底物：脱氧核糖核酸酶(dexyribonuclease, DNase) 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) 核酸酶按照作用方式：核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease）1.2 核酸的酶促降解水解方向：35或5 3产物：3-磷酸产物或5-磷酸产物特异性：识别作用位点或二酯键两侧的碱基具有位点识别专一性的内切酶称限制性内切酶。 1.2.1.1 外切核酸酶作用于核酸链的一端，逐个水解核苷酸，非特异性DNA外切酶、RNA外切酶35外切酶：蛇毒磷酸二酯酶53外切酶：牛脾磷酸二酯酶1.2.1 核酸酶如蛇毒磷酸二酯酶、牛脾磷酸二酯酶作用方式如下：1.2
3、.1.2 内切核酸酶特异水解多核苷酸内部各键，如牛胰核酸酶作用如下：RNaseTl，专一水解鸟苷酸二酯键，作用如下：专一水解DNA，作用方式为内切酶，切断双链或单链，作为外切酶有53切割或35切割。例如：牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase)；牛脾脱氧核糖核酶(DNase) 。未发现有碱基专一性DNase，但有序列专一性，即限制性内切酶。1.2.2 脱氧核糖核酸酶1979年，W. Arber, H. Smith和D. Nathans等发现某些细菌细胞内存在一类能识别一定序列并水解外源双链DNA的内切核酸酶。限制性内切酶是细菌中产生的具有高度专一性的DNA内切酶，能识别双链DNA分子上特定的位点，将两
4、条链切断，形成粘性末端或平末端，又称为限制性内切酶或限制酶，是DNA分子操作中必不可少的工具酶。1.2.3 限制性内切酶细菌除具有限制酶外，还具有一种对自身DNA起修饰作用的甲基化酶，其识别与作用部位相同。甲基化酶使该部位上的碱基甲基化，从而使限制酶不再起作用。细菌细胞中，限制酶可降解外源侵入的DNA，但不降解经修饰酶甲基化保护的自身DNA。限制酶具有很强的专一性。它们对底物DNA有特异的识别位点(或称识别序列)。这些位点的长度一般在48bp范围内。通常具有回文结构(palindromic structure)。切割后形成粘性末端(cohesive end)或平齐末端(blunt end)。环
5、状或线状的双链DNA分子经限制酶作用后都形成线状双链DNA，每条单链的一端带有识别顺序中的几个互补碱基，这样的末端称为粘性末端。例如，大肠杆菌的EcoR I对DNA的作用如下：限制酶命名，以EcoRI为例，第1个大写字母E为大肠杆菌的属名(Escherichia)的第1个字母，第2、3两个小写字母c为它的种名(coli)的头两个字母。第4个字母用大写R，表示所用大肠杆菌的菌株。最后一个罗马字表示从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。限制酶是DNA的分子剪刀，是DNA体外重组技术和进行大分子DNA分析的重要工具，它的发现对基因工程研究有极大的促进作用。限制酶作为工具酶的几个应用限制酶图谱：基因组各
6、DNA分子的若干限制酶切位点标识图。DNA重组子的构建：具相同粘性末端的两个DNA片段之间，可通过粘性末端的互补，在连接酶作用下连接为一个DNA分子。酶切位点的保护：识别位点的碱基甲基化，限制酶不能识别和作用。2 核苷酸分解代谢由核苷酸酶（磷酸单酯酶）催化，产生核苷及Pi。非特异性核苷酸酶能作用于一切核苷酸，特异性核苷酸酶只能水解3-核苷酸或5-核苷酸。2.1 核苷酸的降解核苷经核苷酶作用分解为嘌呤碱或嘧啶碱和戊糖。分解核苷的酶有两类核苷磷酸化酶：催化核苷分解成含氮碱基和戊糖的磷酸酯。核苷水解酶 ，只作用于核糖核苷，催化反应不可逆。 对脱氧核糖核苷不起作用。嘌呤经脱氨氧化转变为黄嘌呤再进行降解
7、，不同生物分解嘌呤碱的酶系不同，最终产物也不同。2.2 嘌呤核苷酸的降解生物进化程度愈高，分解嘌吟的能力愈差。人灵长鸟爬哺乳部分硬骨鱼多数鱼、两栖甲壳嘌呤的分解还可在核苷或核苷酸水平上进行嘧啶核苷酸的分解主要在肝内进行，有氨基首先脱氨基。胞嘧啶首先水解脱氨基，转化为尿嘧啶，尿嘧啶和胸腺嘧啶经还原打破环内双键后，水解开环成链状化合物，再水解成CO2、NH3、-丙氨酸、-氨基异丁酸，后者脱氨基后进入有机酸代谢或直接排出体外。2.3 嘧啶核苷酸的分解不同种类的生物对嘧啶的分解过程不同，在某些生物体内，脱氨基作用也可在核苷酸、核苷或碱基水平上进行。 3 核苷酸的生物合成合成途径有从头合成和救补途径：从
8、头合成(de nove synthesis)：利用氨基酸、磷酸戊糖、CO2、NH3等简单的化合物合成核苷酸。救补途径(salvage pathway)：利用核酸降解或从外界补充的含氮碱基或核苷合成新的核苷酸。3.1 核糖核苷酸的合成20世纪50年代，利用同位素标记，以鸽肝为材料证实合成嘌呤的前身物为：氨基酸(甘氨酸、天门冬氨酸、和谷氨酰胺)、CO2和一碳单位(N10-甲酰FH4，N5,N10-甲炔FH4)，是在磷酸核糖的基础上逐步合成嘌呤核苷酸。其生物合成途径：先合成次黄嘌呤核苷酸(IMP)，再由IMP分别生成AMP和GMP。3.1.1 嘌呤核苷酸的生物合成嘌呤环上不同部位的N和C分别如下：I
9、MP的生物合成次黄嘌呤核苷酸合成过程从5-磷酸核糖开始到IMP生成为止，共11个反应步骤：嘌呤核苷酸的合成是先形成次黄嘌呤核苷酸，然后生成核苷酸。5-磷酸核糖-1-焦磷酸(5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate，PRPP)是核苷酸中核糖磷酸部分的供体。1、获得嘌呤的获得嘌呤的N9原子：原子：由磷酸核糖由磷酸核糖酰胺转移酶催化，谷氨酰胺提供酰胺转移酶催化，谷氨酰胺提供酰胺基取代酰胺基取代PRPP的焦磷酸基团，的焦磷酸基团，形成形成-5-磷酸核糖胺，限速步骤。磷酸核糖胺，限速步骤。酰胺转移酶为限速酶，受嘌呤核酰胺转移酶为限速酶，受嘌呤核苷酸的反馈抑制。苷酸的反馈抑制。 2
10、、获得嘌呤获得嘌呤C4、C5和和N7原子：原子：由甘由甘氨酰胺核苷酸合成酶催化甘氨酸氨酰胺核苷酸合成酶催化甘氨酸与与PRA缩合，生成甘氨酰胺核苷缩合，生成甘氨酰胺核苷酸酸(GAR)，ATP水解供能。水解供能。 3、获得嘌呤C8原子：GAR的自由-氨基甲酰化生成甲酰甘氨酰胺核苷酸(FGAR)。由N10-甲酰-FH4提供甲酰基，为GAR甲酰转移酶催化。4、获得嘌呤的N3原子：第二个谷氨酰胺的酰胺基转移到正在生成的嘌呤环上，生成甲酰甘氨脒核苷酸(FGAM)，ATP供能。5、嘌呤咪唑环的形成：FGAM经过耗能的分子内重排，环化生成5氨基咪唑核苷酸(AIR)。6、获得嘌呤C6原子：C6原子由CO2提供，
11、由AIR羧化酶催化生成羧基氨基咪唑核苷酸(CAIR)。7、8、获得N1原子：由天门冬氨酸与AIR缩合反应，生成5-氨基咪唑-4-(N-琥珀酰胺)核苷酸(SACAIR)。此反应与(3)步相似，ATP水解供能。9、去除延胡索酸：SACAIR在SACAIR甲酰转移酶催化下脱去延胡索酸生成5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸（AICAR)。(8)、(9)两步反应与尿素循环中精氨酸生成鸟氨酸的反应相似。 10、获得C2：嘌呤环的最后一个C原子由N10-甲酰-FH4提供，由AICAR甲酰转移酶催化AICAR甲酰化生成5-甲酰胺基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(FAICAR)。11、环化生成IMP：FAICAR脱水环化生
12、成 IMP，无需ATP供能。获得嘌呤的N9原子 获得嘌呤C4、C5和N7原子获得嘌呤C8原子获得嘌呤的N3原子嘌呤咪唑环的形成 获得嘌呤C6原子去除延胡索酸获得C2生成腺苷酸代琥珀酸 环化生成IMP7）、8）获得N1原子氧化生成黄嘌呤核苷酸谷氨酰胺提供酰胺基取代XMP中C2上的氧生成GMP脱去延胡索酸生成AMPGMP和AMP的合成IMP由天冬氨酸提供氨基转移到C6位上生成AMP。IMP经过脱氢酶催化的脱氢反应，由NAD+接受脱下的氢，IMP生成黄嘌呤核苷酸(XMP)，再由谷氨酰胺提供酰胺上的氨，ATP供能，XMP转变成GMP。嘌呤核苷酸生物合成过程的阐明对于临床医学及生产实践有重要意义。如甲基
13、氨基蝶呤和四氢叶酸的结构很相像，对嘌呤核苷酸合成过程中第(4)、(10)两反应中的酶起竞争性抑制作用，使反应速度减慢或停止。尿嘧啶核苷酸的生物合成嘧啶核苷酸是由天门冬酰胺、 PRPP和氨基甲酰磷酸等形成的。嘧啶从头合成途径，首先合成嘧啶环，再与核糖-5-磷酸结合为乳清酸，然后生成尿嘧啶核苷酸。3.1.2 嘧啶核苷酸的生物合成同位素标记实验证明：嘧啶环上的N3来自NH3，C2来源于CO2，其余4个原子来源于天冬氨酸。合成甲酰天冬氨酸脱羧生成UMP闭环生成二氢乳清酸二氢乳清酸的氧化获得磷酸核糖胞嘧啶核苷酸的合成尿嘧啶核苷酸转变为胞嘧啶核苷酸是在核苷三磷酸的水平上进行的。在细菌中UTP直接与NH3作
14、用产生CTP。动物组织中由Gln提供NH3，反应要有ATP供能，由CTP合成酶催化反应。胸腺嘧啶核苷酸的合成胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)，它由dUMP在dTMP合成酶的催化下甲基化生成。由叶酸衍生物作为一碳单位的供体和还原剂。3.1.3 核苷酸合成的补救途径哺乳动物和微生物中存在许多催化嘌呤碱基和嘧啶碱基合成单核苷酸的酶，可直接利用核酸降解产物或外源补充的碱基。嘌呤碱的直接利用嘌呤直接转化成核苷酸主要有两种反应：嘌呤磷酸核糖转移酶在人类嘌呤核苷酸代谢中非常重要。正常的情况下嘌呤核苷酸的从头合成和补救途径之间存在平衡，缺少补救途径会引起嘌呤核苷酸合成的增加，嘌呤代谢严重紊乱，尿酸为正常值的6倍
15、。过多的尿酸导致肾结石和痛风。这些症状可通过别嘌呤醇对嘌呤氧化酶的抑制而得到缓解。嘧啶碱的直接利用在尿嘧啶磷酸核糖转移酶的催化下，尿嘧啶转变成尿苷酸。在UMP的生物合成途径中，有乳清酸磷酸核糖转移酶催化乳清酸生成乳苷酸的反应。核苷的直接利用生物体内的核苷可直接转变成核苷酸加以利用。碱基也可以通过核苷磷酸化酶生成核苷，再转变成核苷酸。生物体内存在各种核苷激酶、如腺苷激酶、肌苷激酶、假尿苷激酶、尿苷-胞苷激酶，催化各种核苷生成核苷酸。3.1.4 核苷二磷酸、核苷三磷酸的合成生物体内，核苷酸常以核苷二磷酸(d)NDP 、核苷三磷酸(d)NTP的形式参与合成反应。核苷二磷酸激酶使核苷二磷酸和核苷三磷酸
16、相互转变。2-脱氧核糖核苷酸是由相应的核苷酸通过以氢代替2-OH基团还原得来，核糖核苷酸还原酶在某些微生物、动植物中通常是在核苷二磷酸水平上发生还原反应，而在另一些微生物如乳酸杆菌、枯草杆菌等以核苷三磷酸为还原底物。3.2 脱氧核苷酸合成催化核糖环的还原作用的有两种类型核糖核苷还原酶：存在于哺乳动物细胞中的一类酶含有非正铁血红素；第二类酶在某些微生物中，只含有一种多肽链，需要钴胺素(维生素B12)作为辅酶，不含非正铁血红素。来自大肠杆菌的第一种类型的酶系包括四种蛋白质：硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶以及蛋白质B1和B2。蛋白质B1和B2是核糖核酸还原酶的不同亚基，B1上有底物结合部位和变构部位，B2上有催化部位。在大肠杆菌中，发现催化核糖核苷酸还原反应的另一套电子传递系统。3.3 核苷酸合成的调节3.3.1 嘌呤核苷酸生物合成的调控3.3.1 嘧啶核苷酸生物合成的调控
