1、 第八章 菌种的保藏第一节第一节 菌种的衰退和复壮菌种的衰退和复壮 一、菌种的衰退一、菌种的衰退 二、菌种的复壮二、菌种的复壮第二节第二节 菌种的保藏菌种的保藏 一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法三、菌种保藏的方法 l 性状稳定的菌种是微生物工作最性状稳定的菌种是微生物工作最重要的基本要求，否则生产或科研重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。都无法正常进行。l 影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素： a a）变异；）变异；b b）污染；）污染；c c）死亡）死亡第一节第一节 菌种的衰退和复壮菌种的衰退和复壮
2、在微生物的基础研究和应用研究中，选育在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌
3、种得以复壮。的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。一、菌种的衰退一、菌种的衰退 菌种衰退（菌种衰退（degenerationdegeneration）是指由于自）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。生物学性状发生量变或质变的现象。 纯菌种纯菌种自发突变自发突变突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体不纯菌种不纯菌种衰退菌种衰退菌种（一）菌种衰退的现象（一）菌种衰退的现象l 菌落和细胞形态改变菌落和细胞形态改变l 生长速度缓慢，产孢子越来越少生长速度缓慢，产孢子越来越少l 代谢产物生产能力下降，即出现负突变代谢产物生
4、产能力下降，即出现负突变l 致病菌对宿主侵染能力下降致病菌对宿主侵染能力下降l 对外界不良条件的抵抗能力下降等对外界不良条件的抵抗能力下降等（二）菌种衰退的原因（二）菌种衰退的原因l 基因突变基因突变主要原因主要原因 1 1、有关基因发生负突变导致菌种衰退、有关基因发生负突变导致菌种衰退 2 2、表型延迟造成菌种衰退、表型延迟造成菌种衰退 3 3、质粒脱落导致菌种衰退、质粒脱落导致菌种衰退l 连续传代连续传代加速衰退加速衰退l 不适宜的培养和保藏条件不适宜的培养和保藏条件加速衰退加速衰退（三）菌种衰退的防止（三）菌种衰退的防止l 控制传代次数控制传代次数l 创造良好的培养条件创造良好的培养条件
5、l 利用不易衰退的细胞移种传代利用不易衰退的细胞移种传代l 采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法l 讲究菌种选育技术讲究菌种选育技术l 定期进行分离纯化定期进行分离纯化二、菌种的复壮二、菌种的复壮n 狭义的复壮狭义的复壮消极的措施消极的措施 是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。到恢复原菌株固有性状的相应措施。n 广义的复壮广义的复壮积极的措施积极的措
6、施 是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。体。 菌种复壮的主要方法菌种复壮的主要方法 纯种分离法纯种分离法 菌落纯（菌落纯（“菌种纯菌种纯”）细胞纯（细胞纯（“菌株纯菌株纯”） 通过纯种分离通过纯种分离, ,可将衰退菌种细胞群体可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来出来, ,经扩大培养经扩大培养, ,就可恢复原菌株的典型性就可恢复原菌株的
7、典型性状。状。 宿主体内复壮法宿主体内复壮法 对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。毒性。 淘汰法淘汰法 将衰退菌种进行一定的处理（如药将衰退菌种进行一定的处理（如药物、低温、高温等），往往可以起到淘物、低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。汰已衰退个体而达到复壮的目的。 遗传育种法遗传育种法 把退化的菌种重新进行遗传育把退化的菌种重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。稳定性较好的生产菌种。 第二
8、节第二节 菌种的保藏菌种的保藏 菌种是重要的生物资源，研究和选择良菌种是重要的生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。好的菌种保藏方法具有重要的意义。一、菌种保藏的目的一、菌种保藏的目的n 菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。交换和使用等诸方面的需要。二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理 首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们
9、的休眠体，如分生孢保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。子、芽孢等。 其次应人为地创造环境条件（如：其次应人为地创造环境条件（如：干干燥、低温和缺氧燥、低温和缺氧），使微生物长期处），使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。眠状态。 尽可能多的采用不同的手段保藏尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株一些比较重要的微生物菌株三、菌种保藏方法三、菌种保藏方法 各种微生物由于遗传特性不同，各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，样。一种良好的有效保藏方法，首先
10、应能保持原菌种的优良性状首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的通用性、操作的简便性和设备的普及性。普及性。 斜面低温保藏法斜面低温保藏法 石蜡油封藏法石蜡油封藏法 砂土管保藏法砂土管保藏法 麸皮保藏法麸皮保藏法 甘油悬液保藏法甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 宿主保藏法宿主保藏法（一）斜面低温保藏法（一）斜面低温保藏法常用保藏法常用保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于后，置于44左右的冰箱中保藏
11、，每隔一定时间（保藏左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏 此法的主要保藏措施是低温。一般可保存此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1 16 6 个月左右。个月左右。 优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点优点是简便易行，容易推广，存活率高；缺点 是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期 短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污短，传代次数多，菌种较容
12、易发生变异和被污 染。染。（二）石蜡油封藏法（二）石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体 石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物） 上，石蜡油层高出斜面顶端上，石蜡油层高出斜面顶端1cm1cm，使培养物与空气隔绝，使培养物与空气隔绝， 加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或44冰箱内冰箱内 保藏。保藏。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。不适用于保
13、藏某些能分解烃类的菌种。 此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保此法的主要保藏措施是低温、阻氧。一般可保 存存1 12 2年左右。年左右。（三）砂土管保藏法（三）砂土管保藏法 一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的 微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的 细菌及酵母则不适用。细菌及酵母则不适用。n砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等 诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物 移接方便，经济简便。它的保藏期约移接
14、方便，经济简便。它的保藏期约1 11010年。年。n 该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分该法是将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约装于小试管中，砂土的高度约1cm1cm，121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌1 11.5h1.5h，间歇灭菌，间歇灭菌3 3次。次。5050烘干后经检查无误后备用。将烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约中抽真空约2 24h4h，用火
15、焰熔封管口，用火焰熔封管口( (或用石蜡封口或用石蜡封口) )，置，置于干燥器中，在室温或于干燥器中，在室温或44冰箱内保藏。冰箱内保藏。 （四）麸皮保藏法（四）麸皮保藏法 又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然又称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然 后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水后在低温干燥条件下保存。其制作方法是，将麸皮与水 以一定的比例拌匀，装量为试管体积以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/52/5，湿热灭菌后经，湿热灭菌后经 冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将 试管置于盛有氯化钙等干燥剂
16、的干燥器中，于室温下干试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干 燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔 封，再保藏，则效果更好。封，再保藏，则效果更好。 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在期在1 1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。多采用。（五）甘油悬液保藏法（五）甘油悬液保藏法 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温保藏，本法较简便，但需置备
17、低温冰箱。保藏温度若采用度若采用2020，保藏期约为，保藏期约为0.50.51 1年，而采用年，而采用7070，保藏期可达，保藏期可达1010年。年。 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121121蒸汽灭菌蒸汽灭菌20min20min的甘油混合，并使的甘油混合，并使甘油的终浓度在甘油的终浓度在10101515，再分装于，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。小离心管中，置低温冰箱中保藏。 基因工程菌常采用本法保藏。基因工程菌常采用本法保藏。（六）冷冻真空干燥保藏法（六）冷冻真空干燥保藏法 又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂又称冷冻干燥保藏法，简称
18、冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，条件下立即熔封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。n 此法适用于各大类微生物。此法适用于各大类微生物。n 此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有此法的主要保藏措
19、施是低温、干燥、缺氧、有 保护剂，保藏期一般长达保护剂，保藏期一般长达5 51515年，存活率高，年，存活率高， 变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的 保藏方法。保藏方法。n 该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻 干机等设备。干机等设备。（七）液氮超低温保藏法（七）液氮超低温保藏法 简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（作为保护剂，在液氮超低温（196196）下保藏的方法。）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温
20、，并在降到低其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。 此法适用于各种微生物菌种的保藏。此法适用于各种微生物菌种的保藏。 此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保此法的主要保藏措施是超低温、有保护剂，保藏期一般可达到藏期一般可达到1515年以上，是目前公认的最有年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。效的菌种长期保藏技术之一。 此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种此法的优点是操作简便、高效，且可使用各种培养形
21、式的微生物进行保藏。其缺点是需购置培养形式的微生物进行保藏。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。较高。（八）宿主保藏法（八）宿主保藏法 此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。立克次氏体等）。 植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。冷冻或干燥保存。 噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。混合直接保存。 动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏
22、器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。液，然后分装于试管中密封，低温保存。 在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保 藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简 便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬便；砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬 液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和 液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效 果最好。应用时，可根据实际需要选用。果最好。应用时，可根据实际需要选用。 美国美国ATCCATCC采用冷冻干燥保藏法和采用冷冻干燥保藏法和 液氮保藏法来保藏所有菌种。液氮保藏法来保藏所有菌种。 我国我国CCCCMCCCCM采用斜面低温保藏法、采用斜面低温保藏法、 冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进 行菌种保藏。行菌种保藏。ATCCATCC采用的两种保藏方法的优点示意图采用的两种保藏方法的优点示意图
