1、.1实验目录.2 基本原理 1. 基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交及PCR 分离基因等。 2.不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。 3. 在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖多糖和酚类物质酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和除去多糖和酚类物质。酚类物质。.3 4.核酸是生物有机体
2、中的重要成分，在生物体中核酸通常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质和核仁里。在制备核酸时，在制备核酸时，通过研磨通过研磨破坏细胞壁破坏细胞壁和细胞膜，使和细胞膜，使核蛋白被释放出来。核蛋白被释放出来。5. 去除蛋白的方法，通常采用SDS/CTAB等去污剂去污剂使蛋白变性，与核酸分离，从而从材料中直接提使蛋白变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取取DNA.6. 酚是高效的蛋白质变性剂，氯仿氯仿除了进一步去除除了进一步去除蛋白蛋白，也可以去除，也可以去除残留的酚残留的酚。 本实验是通过SDS法提取拟南芥基因组D
3、NA。.4SDS是一种阴离子去污剂，能与细胞膜上的蛋白质结合，在65C高温下能有效裂解细胞膜，使基因组DNA释放出来。在用SDS-苯酚法提取基因组时，酚能够使SDS-蛋白质复合物中的蛋白质变性，从而使蛋白质和水溶性的DNA分离。（此法不适用于提取多糖含量较高的植物基因组DNA提取。）.5 1.掌握植物基因组DNA分离、纯化原理 2.通过SDS法提取拟南芥基因组DNA。二 实验目的.6仪器及耗材： 研钵、微量移液器及吸头、EP管、台式离心机。材 料： 拟南芥小苗试 剂： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70
4、%乙醇乙醇；酚；氯仿；异丙醇;RNase仪器、材料和试剂.7 实验步骤1. 取一定量的拟南芥组织;2. 加入600 l抽提缓冲液（0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5），室温下快速研磨;3. 把抽提液从研钵中移至1.5 ml 离心管中，混匀;4. 12,000 rpm, 离心10 min (RT)。取上清，加等体积的酚等体积的酚/氯仿氯仿混合液混合液，上下颠倒混匀；5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，弃上清，倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入1m
5、l的70%乙醇洗沉淀；7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，弃上清，倒置于纸巾上待其干燥； 加20 l ddH2O溶解沉淀; 通过分光光度计或电泳检测DNA的浓度和纯度。.8核酸DNA和RNA所含碱基的（嘌呤环和嘧啶环）的共轭双键具有，它们在 。因此，可以用260 nm波长进行核酸含量测定。 波长为260 nm时，DNA或RNA的光密度的大小不仅与总含量有关，也与它们的不同构型有关。标样：DNA浓度为1 g/mL时，OD260=0.02当OD260=1时，双链DNA含量约为50 g/mL 单链DNA含量约为37 g/mL RNA含量约为40 g/mL DNA浓度(g/L)计算：
6、50OD260读数 RNA浓度(g/L)计算：40OD260读数.9.10EDTAEDTA的作用的作用：抑制内外源抑制内外源DNaseDNase的活力的活力。 加螯合剂加螯合剂(EDTA)(EDTA)除去除去，使酶的活性丧失。使酶的活性丧失。思考题：思考题：在拟南芥基因组提取缓冲液中，在拟南芥基因组提取缓冲液中，EDTA和和SDS的的作用分别是什么？作用分别是什么？SDSSDS的作用的作用：SDSSDS能能溶解溶解细胞膜蛋白细胞膜蛋白和和核膜蛋白核膜蛋白，使，使核核蛋白解聚蛋白解聚，从而使，从而使DNADNA得以游离出来得以游离出来。 溶解度变小溶解度变小.11 PCR(Polymerase
7、Chain Reaction,聚合酶链式反应聚合酶链式反应)：是一种选择性体外扩增DNA 的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性变性(Denature):目的双链目的双链DNA 片段在片段在94下解链下解链; (2) 退火退火(Anneal):模板模板DNA经加热变性成单链后，温度降至经加热变性成单链后，温度降至56C左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列通过氢键配对单链的互补序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在在TaqDNA 聚合酶合成聚合酶合成DNA 的最适温度下的最适温度下,以目的以目的DNA 为模板进行合成。为模板进行合成。 由这三个基本步骤组成
8、一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达待扩目的基因扩增放大几百万倍。.12PCR原理FLASH演示.13 Taq DNA Polymerase 1988年Saiki 等从水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取耐高温的Taq DNA多聚酶多聚酶(Taq DNA Polymerase) ， 此酶在93下反应2h后其残留活性是原来的60%。 缺点： Taq DNA Polymerase只有只有53 聚合酶活性聚合酶活性，但没有但没有3 5外切活性外切活性，无法消除突变和错配
9、无法消除突变和错配，碱基错误掺入率可达10-4/碱基/循环 .14 Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，来自于Pyrococcus furiosis 菌株，不仅具有掺入反应迅速及热稳定性高的优点，更是当前市场上所有DNA聚合酶中掺入出错率最低的一种。 优点：Pfu具有具有3 5校阅功能校阅功能，其错配率分别仅为10-7。 缺点：效率低，扩增片段较短效率低，扩增片段较短.15 Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA 聚合酶的混合物，与Taq DNA聚合酶相比，具有扩增长度增加（简单模板可有效扩增20kb,复杂模板
10、可有效扩增10kb), 保真度好的特点；与Pfu DNA 聚合酶相比，具有扩增速度快，反应效率高的优势。 .16PCR反应体系组成 模板 5引物和3引物 4 种dNTP DNA 聚合酶 Mg2+ 反应缓冲液.171. 模板 PCR 反应必须以DNA 为模板进行扩增, 模板模板DNA 可以可以是是单链分子单链分子,也可以是也可以是双链分子双链分子,可以是可以是线状分子线状分子,也也可以是可以是环状分子环状分子 就模板模板DNA 而言,影响PCR 的主要因素是数量数量和和纯度纯度 纯纯 度度 完整性完整性 浓浓 度度.182. 引物 PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物上下游引物所决定。引物的
11、好坏往往是PCR 成败的关键 引物影响因素：特异性：特异性： 长度适当、避免二级结构和二聚体长度适当、避免二级结构和二聚体完整性：完整性： 避免反复冻融避免反复冻融浓浓 度：度： 应适当应适当,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加,过低则过低则 扩增产物太少扩增产物太少.19引物设计原则引物设计原则(1) 引物长度： 约为16-30bp(2) G+C含量： G+C含量通常为40%-60%, 较短引物可粗略估计Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基随机分布随机分布，在在3端不存在连续端不存在连续3 个个G 或或C,因这样易导致错误引发。(4) 在引物内及两引物之间, 尤其在3端应不
12、存在二级结构。(5) 引物5端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点。 (6)引物不与模板结合位点以外的序列互补引物不与模板结合位点以外的序列互补.204 种 dNTP 浓度适当，避免反复冻融浓度适当，避免反复冻融 dNTP 原液配成10mM或者2.5mM分装,-20oC贮存。 dNTP应用应用NaOH调调pH为为7.0 理论上四种理论上四种dNTP各各20mM 一般反应中每种dNTP 的终浓度为20-200M。当dNTP 终浓度大于50mM 时可抑制Taq DNA 聚合酶的活性. 4 种dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP 的不足出现的错误掺入。.21Mg2+
13、 过高非特异性严重，过低无扩增产物过高非特异性严重，过低无扩增产物Mg2+浓度对DNA 聚合酶影响很大,它可影响酶的活性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-3mM。试剂公司通常会将Mg2+加入到DNA 聚合酶的反应缓冲液中： 10Reaction Buffer (including Mg2+) 10Reaction Buffer (without Mg2+).22DNA 聚合酶Taq DNA Polymerase活性半衰期为95 40min, 97 5min. Taq DNA 聚合酶的酶活性单位定义为聚合酶的酶活性单位定义为74下下
14、,30min,掺入掺入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量到核酸中所需的酶量.Taq DNA 聚合酶的一个致命弱点是它的出错率一个致命弱点是它的出错率,一般PCR 中出错率为210-4 核苷酸/每轮循环,100l PCR 反应中,1.5-2 单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30 轮循环. 反应结束后，如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA 聚合酶, 灭活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加热10min.目前已有直接纯化PCR 产物的K
15、it 可用。Taq /Pfu /Taq Plus DNA Polymerase.23 DNA 聚合酶单位定义：1个酶单位是指在74下，30min内，使10nmol的dNTP掺入到核酸中所需的酶。 不同公司提供的酶U的定义也不同。.24反应缓冲液 各种各种DNA聚合酶都有自己特定反应缓冲液；聚合酶都有自己特定反应缓冲液； Taq DNA Polymerase反应缓冲液一般含： 10-50mM TrisCl (20下pH8.3-8.8) 50mM KCl 适当浓度的Mg2+.25 缓冲液缓冲液 10 mmol/l Tris.Cl 提供适合反应的pH值（pH 8.4） 50 mmol/l KCl促进
16、引物退火 10 g/ml 明胶或血清白蛋白，二硫苏糖醇为Taq酶的保护剂，稳定酶的活性.26PCR反应反应主要参数：主要参数：1. 预变性：预变性：94C， 3-5min2. 变性：变性： 94C，30s-1min3. 复性：复性： 56 C，20s-2min4. 延伸：延伸： 72 C，30s-3min5. 总延伸：总延伸：72 C， 10min.27预变性和变性 在第一轮循环前,在在94下下变变性性35min 非非常常重重要要,它它可可使使模模板板DNA 完完全全解解链链 。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量. 一一般般变变性性温温度度与与时
17、时间间为为94 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。.28退火引物退火的温度和所需时间的长短取决于引引物的碱基组成物的碱基组成，引物的长度引物的长度、引物与模板的引物与模板的配对程度配对程度以及引物的浓度引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm 值约低5。通常退火温度和时间为55左右,1-2min。.29延伸延伸反应通常为72,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75.实际上。延伸反应时间的长短延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度目的序列的长度和浓度浓度。Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成2kb 长的DNA。
18、一般在扩增反应完成后,都需要一步都需要一步较长较长时间时间(10-30min)的延伸反应的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。.30循环次数 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30 轮循环已经足够。 循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。.311.通过PCR从拟南芥基因组中扩增目的基因片段2.学习PCR仪等仪器的使用实验目的.32材料：拟南芥基因组DNA器材：移液器及吸头，PCR 管， PCR仪，台式离心机。实验材料和器材.33所需试剂10PCR 反应缓冲液 dNTP Mix:每种10 mM 5和3引物：各10 pmol/l （1
19、0mmol/L） Taq DNA 聚合酶 5U/l 无菌去离子水；.34实验步骤1. 在PCR管中依次混匀下列试剂(总体积50l ) 5 l 10Buffer (Including MgCl2) 1l dNTP mix （各10 mM ） 1l 5上游引物 （ 10M ） 1l 3下游引物 （ 10M ） 模板DNA (200 ng) 1U Taq DNA聚合酶 补充dd H2O 至50l 混匀后短暂离心（点离）。.352. 将PCR管放置到PCR仪中，盖好盖子3. 用94oC预变性3-5分钟；94oC变性1分钟，58oC退火1 分钟, 72oC延伸2 分钟, 32个循环；最后一轮循环结束后,
20、 于72oC下保温10 分钟，4. 终止反应，从PCR仪取出PCR管，放置4oC存.36 1.PCR 非常灵敏, 尽可能避免污染避免污染。吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂； 2.加试剂前, 应短促离心10 秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面； 3.应设含除模板DNA 所有其它成分的负对照。注意事项.37思考题简述PCR克隆的主要原理PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应聚合酶链式反应)：是一种选择性体外扩增DNA 的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性变性(Denature):目的双链目的
21、双链DNA 片段在片段在94下解链下解链; (2) 退火退火(Anneal):模板模板DNA经加热变性成单链后，温度经加热变性成单链后，温度降至降至56C左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补序列通过单链的互补序列通过氢键配对氢键配对; (3) 延伸(Extension):在在TaqDNA 聚合酶合成聚合酶合成DNA 的最适的最适温度下温度下,以目的以目的DNA 为模板进行合成。为模板进行合成。.38配置常规PCR反应体系，对其组成及其各个组分应该注意哪些事项？（1 1）模板）模板 （2 2）引物）引物（3 3）4 4种种dNTP dNTP 浓度适当，避免反复冻融浓度适当，避免反复冻
22、融（4 4）MgMg2+ 2+ 过高非特异性严重，过低无扩增产物过高非特异性严重，过低无扩增产物 纯纯 度度: 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应反应 完整性完整性: 模板降解会导致模板降解会导致PCR扩增无产物扩增无产物 浓浓 度度: 加量过多导致非特异性扩增增加加量过多导致非特异性扩增增加特异性：特异性： 长度适当、避免二级结构和二聚体长度适当、避免二级结构和二聚体完整性：完整性： 避免反复冻融避免反复冻融浓浓 度：度： 应适当应适当,过高导致非特异性增加过高导致非特异性增加,过低则过低则 扩增产物太少扩增产物太少.39.40一、实验原理一、实验原理琼脂糖是
23、一种琼脂糖是一种天然聚合长链状分子天然聚合长链状分子，琼脂糖是从琼脂琼脂糖是从琼脂中分离得到，由中分离得到，由1,31,3连接的吡喃型连接的吡喃型b-D-b-D-半乳糖和半乳糖和1,41,4连接的连接的3,63,6脱水吡喃型阿脱水吡喃型阿a-L-a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为半乳糖组成，形成相对分子量为104104105105的长链的长链。琼脂糖琼脂糖加热溶解后加热溶解后分子呈分子呈随机线团状随机线团状分布，当分布，当温度降低温度降低时时链间糖分子上的羟基链间糖分子上的羟基通过通过氢键作用氢键作用相连接，形成相连接，形成刚性孔刚性孔径结构径结构，而，而随着随着琼脂糖浓度琼脂糖浓度不同不同
24、形成形成不同大小的孔径不同大小的孔径。.41DNA分子在分子在碱性缓冲液碱性缓冲液中带中带负电荷负电荷，在外，在外加电场作用下向加电场作用下向正极泳动正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷电荷效应效应与与分子筛效应分子筛效应。不同不同DNA的的分子量大小及构型分子量大小及构型不同，电泳不同，电泳时的时的泳动率泳动率就不同，从而分出不同的就不同，从而分出不同的区带区带。.42影响DNA 迁移速率因素DNA分子泳动主要的因素分两方面：DNA分子特性和电泳条件。1.1.DNA DNA 的分子大小的分子大小: :双链双链DNADNA分子迁移的速率分子迁移的速率与D
25、NADNA分子分子量对数量对数成反比反比。分子量越大，迁移率越小；2.DNA 2.DNA 分子的构象分子的构象：超螺旋超螺旋（最快）（最快） 开环开环 线状线状（最慢）（最慢）；3.琼脂糖浓度琼脂糖浓度：浓度越低浓度越低，相同核酸分子迁移越快迁移越快，一般常用的凝胶浓度凝胶浓度为1%1%2%2%；4.4.电场强度电场强度：电场强度越大电场强度越大DNA分子泳动速率越快，但是凝胶的有效分离范围有效分离范围随着电场强度的增大电场强度的增大而减小减小，所以电泳时一般采用低压(一般5V/cm5V/cm);5.嵌入染料的存在：嵌入染料的存在：染料会嵌入到堆积的碱基对之间染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长
26、线装和带缺口的环状并拉长线装和带缺口的环状DNADNA，使其刚性更强，还会，使其刚性更强，还会使线状使线状DNADNA的电泳迁移率降低的电泳迁移率降低15%15%6.离子强度影响离子强度影响(电泳缓冲液)：常见的有，TAE、TBE、TPE.43核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液有三种Tris-乙酸(TAE) 、Tris-硼酸(TBE)和 Tris-磷酸(TPE). .44DNA电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液 DNA Loading Buffer作用 1.螯合Mg2，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10 mM EDTA。2.增加样品密度以保证DNA沉入加样孔，一般上样缓冲液中加入一定浓度的
27、甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 3.指示剂监测电泳的行进过程指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300 bp的线状双链DNA相同。.45DNA电泳的标准分子量电泳的标准分子量 目前各厂商开发了各种类型的标准分子量，有广泛用于PCR产物鉴定的小分子Marker，也有常规用的大分子Marker。常用的DNA标准分子量电泳图 .46二、实验目的二、实验目的 1 掌握琼脂糖凝胶电泳分离掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法的原理和方法2 通过琼脂糖凝胶电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳检测PCRPCR扩增的目的基因扩增的目的基因.47仪器及耗材：天平、电泳
28、设备、台式离心机、称量纸、药勺、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、三角瓶、微波炉、凝胶成像系统。材 料： PCR产物试 剂： 琼脂糖，1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液、SuprtRed、6Loading buffer、无菌去离子水、DNA Marker；三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂.48四、实验步骤四、实验步骤1. 称取称取1 g 琼脂糖加入琼脂糖加入100 mL 0.5TAE电泳缓冲电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中（或电炉上）加热至琼液中，摇匀。在微波炉中（或电炉上）加热至琼脂糖完全溶解；脂糖完全溶解；2. 将制胶板放好，插入适当梳子，将溶解的琼脂将制胶板放好，插入适当梳子，将
29、溶解的琼脂糖（约糖（约50）倒入，室温冷却凝固；）倒入，室温冷却凝固；3. 充分凝固后将胶板取出，小心垂直向上拔出梳充分凝固后将胶板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入电泳槽中，加子，置入电泳槽中，加0.5TAE电泳缓冲液至电泳缓冲液至液面覆盖凝胶液面覆盖凝胶1-2 mm。.494. 用移液器吸取用移液器吸取 3L 6loading buffer于一新于一新PCR管中，管中，再加入再加入5 L PCR产物，混匀后，小心加入点样孔。产物，混匀后，小心加入点样孔。（尤其要注意不能破坏点样孔！尤其要注意不能破坏点样孔！） 由于由于2 Taq Mix中已含有中已含有loading buffer，故可以直接
30、，故可以直接将将PCR产物加入点样孔中。产物加入点样孔中。用移液器吸取用移液器吸取 适量的适量的DNA Marker加入加入第一个或者最第一个或者最后一个后一个点样孔中。点样孔中。打开电源开关，打开电源开关，一般红色为正极红色为正极黑色为负极黑色为负极，调节电调节电压至压至3-5V/cm，可见到，可见到溴酚蓝条溴酚蓝条带由带由负极向正极负极向正极移动，移动，电泳约电泳约30 min-60 min。7. 电泳结束后电泳结束后将凝胶置于凝胶成像仪内，再紫外灯下检将凝胶置于凝胶成像仪内，再紫外灯下检测测PCRPCR产物的产物的DNADNA条带。条带。.50注意事项注意事项1.1.倒凝胶时倒凝胶时，琼
31、脂糖凝胶温度，琼脂糖凝胶温度不能太高或太不能太高或太低低；2.2.点样时，枪头要点样时，枪头要探入点样孔探入点样孔，不要戳穿凝不要戳穿凝胶胶；.51.52一、实验原理一、实验原理目的基因与载体连接目的基因与载体连接 平末端连接平末端连接 粘性末端连接粘性末端连接 T载体策略连接载体策略连接.53平末端连接平末端连接 Taq DNA 聚合酶往往在在PCR PCR 产物产物3 3端加上多余端加上多余的非模板依赖碱基的非模板依赖碱基，在用平末端连接克隆PCR 产物前，可用Klenow 片段或T4 DNA 聚合酶处理补平末端。 有些DNA聚合酶（pfu DNA 聚合酶聚合酶）扩增的PCR产物为平端平端
32、，可以直接用于平端连接直接用于平端连接.54粘性末端连接粘性末端连接利用引物中附加在附加在5 5端的限制酶位点，端的限制酶位点，直接将PCR 产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接，产生重组DNA。如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点经酶切后定向克隆到载体中。.55T-载体连接载体连接（TATA克隆）克隆）TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3末端加一个非模板依赖碱基(A或T)，所加碱基多为A。利用这一特点，可以经限制酶可以经限制酶(如EcoRV)切割载体，使其产生平末端，再利用再利用Taq DNATaq DNA聚合酶向载体聚合酶向载体双链双链DNADNA的的33末端加上末端
33、加上T T，使载体与，使载体与PCRPCR产物末端互产物末端互补并进行连接。补并进行连接。 .56pMD18-T Vector pMD18-T Vector是一种高效克隆高效克隆PCR产物产物（TA Cloning）的专用载体专用载体。用EcoR V进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。，本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，大大方便了实验操作。.57DNADNA连接酶的特性连接酶的特性DNADNA连接酶主要有两种：连接酶主要有两种：大肠杆菌大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶和和大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体DNADNA连接酶连接酶。
34、大肠杆菌DNA连接酶：需要NAD+作为辅助因子参与催化， 一般指催化粘性末端的连接， 在PEG下也能进行平端的连接。T4噬菌体DNA连接酶：需要ATP作为辅助因子参与催化。不需要PEG也能进行平端的连接，绝大多数情况下使用绝大多数情况下使用T4噬菌体DNA连接酶.58DNADNA连接的影响因素连接的影响因素温度与时间温度与时间 理论上理论上连接反应的连接反应的最佳温度是最佳温度是37C，此时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，此时粘性末端分子形成的氢键配对结构极不稳定，因此找了另一个最适温度即因此找了另一个最适温度即1216C酶量酶量 在实际反应中，酶量是过量的在实际反应中，酶量是过量的
35、缓冲体系缓冲体系 不同公司的连接酶缓冲液大部分含有不同公司的连接酶缓冲液大部分含有Tris-HCL(pH7.5)，提供连接反应所需的合适，提供连接反应所需的合适pH。另外在。另外在缓冲液中还有缓冲液中还有DTT(二硫苏糖醇二硫苏糖醇)和和ATP，也非常重要。，也非常重要。DTT提供一定的还原力提供一定的还原力，而，而ATP能促进连接反应的有效能促进连接反应的有效进行。进行。（缓冲液使用时的反复冻融反复冻融会引起引起ATP的分解的分解）DNADNA浓度浓度 为了降低载体分子间的环化，载体为了降低载体分子间的环化，载体DNADNA的浓度不宜过高的浓度不宜过高.59克隆载体克隆载体是相对于表达载体而
36、言的，是相对于表达载体而言的，是指可携带插入的是指可携带插入的外源外源DNADNA片段并可转入受体细胞中大量扩增的片段并可转入受体细胞中大量扩增的DNADNA分子。分子。该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选该分子中含有能够在受体细胞中自主复制的序列和筛选标记。常见的载体有：标记。常见的载体有：质粒质粒、噬菌体噬菌体、酵母人工染色体酵母人工染色体。对克隆载体有以下几点要求：对克隆载体有以下几点要求：1）能在宿主细胞中复制繁殖。）能在宿主细胞中复制繁殖。2）容易进入宿主细胞，）容易进入宿主细胞，3）容易插入外来核苷酸片段，插入后不影响其复制功能。）容易插入外来核苷酸片段，插入后不影响其
37、复制功能。4）容易从宿主细胞中分离出来。）容易从宿主细胞中分离出来。5）有容易被筛选识别的标志。）有容易被筛选识别的标志。.60二、实验目的二、实验目的 通过通过T T载体策略进行目的基因与载体的连接载体策略进行目的基因与载体的连接.61仪器及耗材：台式离心机、微量移液器及吸头、EP管、封口膜、水浴锅。材 料： PCR产物试 剂： 无水乙醇，70%乙醇、3M NaAc（pH5.2）、无菌去离子水；pMD18-T 三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂.62四、实验步骤四、实验步骤1. 将PCR产物中加入等体积的酚/氯仿（1：1）混合液，上下颠倒混匀，12,000 rpm, 4，离心5
38、 min; 2. 取上清，加入1/10倍体积的3 M NaAc 和2.5倍体积的无水乙醇，混匀，20放置10 min;3. 12,000 rpm, 4，离心5 min；4. 弃上清， 倒置于吸水纸上待壁上液体流尽后加入500 L 70%乙醇洗沉淀，12,000 rpm, 4，离心5 min；5. 去上清，倒置吸水纸上，晾干，加入20 L去离子水溶DNA沉淀。.63 6. 测定DNA的浓度； 7. 沉淀的目的基因DNA与载体连接： 取一新的PCR管，加入下列反应成分(总体积10l) ： 目的 DNA 4.5 l (0.1 pmol0.3 pmol) pMD18-T Vector 0.5 l 加入
39、5 l（等量）的 Solution I；8. 16C水浴中反应30分钟。.64实验五 大肠杆菌感受态细胞制备.65一 实验原理 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内。 人工构建的质粒载体不能凭自己的能力进入细菌人工构建的质粒载体不能凭自己的能力进入细菌。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态短暂的感受态以以摄取外源摄取外源DNA。 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态感受态。.66感受态细胞制备方法化学法: CaCl2 处理后细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞；物理法: 大肠杆菌暴
40、露在电荷中时，其细胞膜会不稳定而诱导形成孔洞，于是DNA分子可由该孔进入细胞。.67感受态细胞制备中应注意因素细胞生长状态和密度 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从最好从7070或或- -2020甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。试剂的质量 所用的试剂,如CaClCaCl2 2 等均需较高纯度等均需较高纯
41、度，冰箱保存。3. 防止杂菌和杂DNA 的污染 整个操作过程均应在无菌条件无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA 酶或杂DNA所污染。.68二 实验目的1.学习以 E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于为感受态；2. 制备大肠杆菌感受态细胞，为转化实验作准备。.69仪器及耗材：培养皿、细菌投布器、三角瓶、牙签、恒温摇床、电热恒温培养箱、分光光度计、冷冻离心机、50mL离心管、无菌工作台材 料： E. coli DH5菌株试 剂： LB 固体和液体培养基、 1
42、00 mM CaCl2、甘油（保护细菌的细胞膜）。三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂.70LB 液体培养基(Luria-Bertani)配方： 蛋白胨(Tryptone) 1 g 酵母提取物(Yeast extract) 0.5 g NaCl 1 g 加去离子水至总体积100 mL，用NaOH 调pH 至7.0,高压灭菌LB 固体培养基配方：每100mL LB液体培养基中加1.2g 琼脂粉,高压灭菌。.71四 实验步骤实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时；2挑取一个单菌落，转到10 ml LB培养基中，于37培养35
43、小时；3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD600 0.45-0.55.72感受态细胞制备4. 将30ml菌液转入离心管中，冰上10 min; 4oC，5,000 rpm，离心5 min；6. 去上清，将沉淀重悬于10 ml用冰预冷的100 mM CaCl2中，置于冰上30 min；7. 4oC，5,000 rpm，离心5 min；8. 去上清，将沉淀重悬于1 mL用冰预冷的100 mM CaCl2溶液中，再加入70%甘油至终浓度为15-20% (0.4ml),混匀；9. 按每管100 l分装，冰上放置几分钟,即成感受态细胞，-70oC冰箱中保存.73实验六 连接产物转化
44、大肠杆菌.74一 实验原理 转化是转化是将外源将外源DNA 分子引入受体细胞分子引入受体细胞,使之使之获得新的遗传性状的一种手段获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。（考点）.75（1）热激法转化 大肠杆菌感受态细胞与重组质粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。 转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经突然热激（42oC）处理，更有利于细胞对DNA复合物的摄取。外源DNA分子通过吸附、转入、自稳吸附、转入、自稳而进入细胞内，并且开始进行复制和表达。(考点).76 将细菌放置在非选择
45、性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素氨苄青霉素的选择性培养基上。（考点） .77（2）电击法转化电击法制备的大肠杆菌感受态细胞用于电击法制备的大肠杆菌感受态细胞用于电击转电击转化化。当感受态细胞受到瞬时的高压脉冲，细胞。当感受态细胞受到瞬时的高压脉冲，细胞膜形成小凹陷，并形成数纳米的疏水性孔洞，膜形成小凹陷，并形成数纳米的疏水性孔洞，后部分转变为后部分转变为亲水型孔洞亲水型孔洞。在孔洞开放的时候，在孔洞开放的时候，DNADNA就很容易通过孔洞进就很容易通过孔洞进入细胞，实现大肠杆菌的转化。入细胞，实现大肠杆菌的转化
46、。.78分子转化分以下几步:吸附-双链分子吸附于受体菌表面；转入-双链分子解链。一条链进入受体菌，另 一条降解；自稳-外源质粒分子在细胞内复制成双链；表达-供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。（考点）.79二 实验目的 将目的基因与质粒的连接产物转入大肠杆菌（重组载体的筛选最准备.80仪器及耗材：培养皿、细菌投布器、三角瓶、恒温摇床、电热恒温培养箱、水浴锅、无菌工作台材 料： 目的基因与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞试 剂： LB 固体和液体培养基、氨苄青霉素(100 mg/mL)、IPTG (200 mg/mL) 、X-gal (20mg/mL)。三、实验仪器、材料和试剂三、实
47、验仪器、材料和试剂.81氨苄青霉素(Amp)配置： 无菌水配制氨苄青霉素成100 mg/mL 溶液，过滤除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置： 将X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20 mg/mL浓度的溶液，装于玻璃或聚丙烯管中，以锡铂纸包裹避光保存于-20oC， X-gal不需要过滤除菌；IPTG配置： 将2 g IPTG溶于8 mL水中，用水调节体积到10 mL, 过滤除菌， -20oC冰箱保存。.82固体LB平板的准备1. 固体LB培养基的配置：每100 mL液体LB培养基加入1.2 g琼脂粉，pH 7.0，高温灭菌；2. 固体LB培养基融化后，冷却到50oC，加入氨苄青霉素（100
48、g/mL），再倒入灭菌的平板内；3.在LB固体培养基表面均匀投布4L IPTG (200 mg/mL)和40L x-gal (20mg/mL),吹干;四 实验步骤.834. 从-70oC冰箱中取出感受态细胞,置冰上解冻；5. 在超净台上，取5 l 连接产物加入到感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30 min；6. 42oC热激处理90 sec，热击后迅速置于冰上冷却3-5 分钟； 7.加入600800 l无抗生素的LB液体培养基，37oC，5060 rpm温育45 min，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因； 8.菌液均匀涂布到含有抗生素（Amp 100 g/ml,并均匀的涂
49、布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，将培养皿倒置于37oC，培养16 h； .84影响转化效率的因素有哪些？细菌生长的状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。 所有操作均应该在无菌条件和冰上进行。经过CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定时间内的转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率下降。化合物及无机离子的影响所用器皿必须干净，微量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。质粒的大小及构型的影响：用于转化的主要是超螺旋的DNA。一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度成正比。.85实验七实验七 阳性克隆的筛选鉴定阳性克隆的筛选鉴定.86 将目的基因与载体进行
50、连接形成重组子并转化后，在连接产物中既有载体和目的基因的连接，也有载体的自连和目的基因的自连，更多的是未发生连接反应的载体和目的DNA片断。 这就需要我们对阳性克隆进行鉴定和筛选，将和不含外源DNA的宿主细胞分开，将含有正确重组子的宿主细胞和分开。一 实验原理.87 在实验中，目的基因与T载体(pMD18-T)连接产物,转化E. coli DH5菌株。由于pMD18-T 上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选首先采用Amp 抗性筛选与-互补现象筛选相结合的方法。.88 因pMD18带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pMD18 的转化子才能在含有Amp 的
