1、聚合酶链式反应(PCR)及引物设计Contentp 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR） 的技术原的技术原理及实验操作理及实验操作p PCR引物设计软件的使用（引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论5实验目的v了解了解PCR的基本原理的基本原理v掌握掌握PCR的基本操作技术的基本操作技术 v学习引物设计的原则及引物设计软件学习引物设计的原则及引物设计软件Primer5的使
2、用的使用聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论5实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用PCR技术原理v 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain (polymerase chain reaction,PCRreaction,PCR) )，是一种在是一种在体
3、外体外快速快速扩增扩增特定基因或特定基因或DNA序列的方法，序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。故又称为基因的体外扩增法。v PCR不仅可以用于基因的分离、不仅可以用于基因的分离、克隆克隆和核苷酸序列分和核苷酸序列分析，还可以用于析，还可以用于突变体突变体和和重组体重组体的构建，基因表达调的构建，基因表达调控的研究，控的研究，基因多态性基因多态性的分析，遗传病和传染病的的分析，遗传病和传染病的诊诊断断，肿瘤机制的探索，肿瘤机制的探索，法医鉴定法医鉴定等诸多方面。等诸多方面。 PCR技术原理 以拟扩增的以拟扩增的DNADNA分子为分子为模板模板，以一对分别与模，以一对分别与模板板55末端和末端
4、和33末端互补的寡核苷酸片段为末端互补的寡核苷酸片段为引物引物，在在DNADNA聚合酶聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链着模板链延伸延伸直至完成新的直至完成新的DNADNA合成，重复这一过合成，重复这一过程，即可使目的程，即可使目的DNADNA片段得到扩增。片段得到扩增。正义链正义链反义链反义链PCR技术原理模板与引物的复性,引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。Tm-5Tm-5C C在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA9494C C从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链7272
5、C C变性变性退火退火延伸延伸PCR技术原理 PCRPCR出现的问题：出现的问题： PCR PCR扩增未得到目的条带？扩增未得到目的条带？ 扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？扩增出目的条带之外的多条带（非特异性）？ 扩增的目的条带很弱？扩增的目的条带很弱？引物是否合引物是否合适适? ?引物设计是引物设计是PCR 技术中至关重要的一环技术中至关重要的一环实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用引物设计的原则 引物与模板的序列要引物与
6、模板的序列要紧密互补紧密互补 引物与引物之间引物与引物之间避免避免形成稳定的形成稳定的二聚体或发二聚体或发夹结构夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚合聚合反应反应( (即即错配错配) )。 基本原则：基本原则： 引物长度（引物长度（primer lengthprimer length） 产物长度（产物长度（product lengthproduct length） 序列序列Tm Tm 值值(melting temperature)(melting temperature) 形成引物二聚体形成引物二聚体(primer (primer dimerd
7、imer) )及发夹结构（及发夹结构（duplex duplex formation and hairpinformation and hairpin）的能值）的能值 在错配位点（在错配位点（false priming sitefalse priming site）的引发效率）的引发效率 引物及产物的引物及产物的GC GC 含量（含量（compositioncomposition）引物设计的原则具体因素：具体因素：引物设计的原则一般原则：一般原则：1. 引物的长度：配对引物的长度一般在引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。之间比较合适。v 尽可能使用两条引物的尽可能使用两
8、条引物的Tm值相同（最好相差不要超值相同（最好相差不要超过过 5） vTm值的计算值的计算：一般的公式：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 2. 引物的引物的GC%含量：一般为含量：一般为40%-60%。上下游上下游引物的引物的GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。引物设计的原则3. 引物序列在模板内应当引物序列在模板内应当没有相似性较高没有相似性较高，尤其，尤其是是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。端相似性较高的序列，否则容易导致错配。4. 引物引物3端的端的末位碱基末位碱基避开密码子的第避开密码子的第3位，且位，且最好不选择最好不选择A5. 引物的引物的5端可以
9、修饰，而端可以修饰，而3端不可修饰。端不可修饰。 引物设计的原则6. 引物引物无回文对称无回文对称结构，否则会形成发夹结构；结构，否则会形成发夹结构； 引物自身引物自身不能配对不能配对，否则易形成约两个引物长度，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；的引物二聚体； 发夹结构发夹结构引物二聚体引物二聚体实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用1. 缓冲液：缓冲液： 10 50 mM Tris- Cl (pH8.4) 维持维持 Taq 酶作
10、用环境酶作用环境 25 50 mM KCl 促进引物退火促进引物退火 100g / ml 牛血清白蛋白牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性对酶有一定的保护性 0.5 2.5 mM MgCl2 Taq 酶具有酶具有 Mg2+依赖性依赖性2. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP底物底物 0.5 2.5 M PCR的成分和作用 3. 引物引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性特异性。 0.1 1 M 4. 模板模板DNA (Template): 最低最低102 105 DNA片段，实际用量远远片段，实际
11、用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。超过此量，用量需在实验中摸索。1 5 lPCR的成分和作用5. 5. Taq DNA 聚合酶聚合酶 耐高热耐高热 0.5 5 U / 100 l 1U / 25 50l6. 6. 水：水： 去离子水，补足整个反应体积。去离子水，补足整个反应体积。PCR的成分和作用实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用常用常用30l 各种成分的实际用量应根据实验者选用各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终
12、浓度及所拥有的储备液浓度进的该成分的终浓度及所拥有的储备液浓度进行核算。行核算。PCR反应体系 操作： 5份标本 总体积 30l 6 = 180l 1. 取一 0.5 ml Ep 管，加入下列试剂： 10buffer： 3l 6 = 18l dNTPs: 1.0l6 = 6.0l 引物P1： 1.0l 6 = 6.0l 引物P2： 1.0l 6 = 6.0l Taq 酶 (5U/l)： 0.2l 6 = 1.2l 水： 22.8l 6 = 136.8l 共174l，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。PCR反应体系冰上操作！冰上操作！2. 另取另取 5 支支0
13、.2ml PCR管，分别加入上述液体管，分别加入上述液体29l。3. 分别取标本模板各分别取标本模板各1l，加入上述，加入上述5支支PCR 管中，混匀，离管中，混匀，离心机瞬时离心，备用。心机瞬时离心，备用。4. 反应条件：反应条件：PCR扩增仪扩增仪 PCR反应体系 945 945 94 30 94 30 60 30 60 30 72 1 72 13030个循环个循环 72 572 5实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用 变性温度
14、和时间：变性温度和时间： 保证模板保证模板DNA解链完全是保证整个解链完全是保证整个PCR扩增成功扩增成功的关键的关键。 加热加热9095，30 60 s，再复杂的，再复杂的DNA分子也分子也可变性为单链。可变性为单链。根据模板根据模板DNA复杂程度，可以调整变复杂程度，可以调整变性温度和时间。性温度和时间。一般情况下选择一般情况下选择94 30 ，可使各种，可使各种复杂的复杂的DNA分子完全变性。分子完全变性。 PCR反应条件优化 退火温度和时间：退火温度和时间： PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板扩增特异性取决于复性过程中引物与模板 的结合。的结合。 退火温度的选择，可根据引物的长
15、度和退火温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确含量确定，一般位于定，一般位于40 60，30 60 s。 退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，退火温度越高，产物特异性越高。退火温度越低，产物特异性越低。产物特异性越低。 设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！设置退火温度梯度，摸索最佳退火温度！ PCR反应条件优化 延伸温度和时间：延伸温度和时间： 延伸温度一般位于延伸温度一般位于Taq酶最适作用温度酶最适作用温度70 75 之之间，常用间，常用72 延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的延伸时间，可根据待扩增片段的长度和使用的Taq酶酶而定，一般而定，一般taq酶的扩增效率是酶的扩
16、增效率是1kb/1min 延伸时间延伸时间过长过长可出现可出现非特异扩增。非特异扩增。 PCR反应条件优化 循环数：循环数： 其他参数选定后，其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于循环次数主要取决于模板模板DNA的浓度的浓度。 理论上说理论上说20 25次循环后，次循环后，PCR产物的积累即可产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到到100%，因此不管模板浓度是多少，因此不管模板浓度是多少，20 30次是比较次是比较合理的循环次数。合理的循环次数。 循环次数循环次数越多越多，非特异扩增非特异扩增增加。增加。PCR反应条件
17、优化实验原理 PCRPCR技术原理技术原理 引物设计的原则引物设计的原则 PCRPCR的成分和作用的成分和作用 PCRPCR反应体系反应体系 PCRPCR反应条件优化反应条件优化 PCRPCR的应用的应用1、目的基因的克隆：、目的基因的克隆： PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变：、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR的应用3、DNA和和RNA的微量分析：的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是DNA和NA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满
18、足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR的应用聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论5实验仪器、试剂及耗材v实验仪器及耗材实验仪器及耗材 PCR仪、移液器、仪、移液器、0.2 mL PCR管、各种规格的管、各种规格的吸头。吸头。实验仪
19、器、试剂及耗材v 实验试剂实验试剂 10PCR buffer (Mg2+ Plus) ； dNTP mix (2.5 mM each) ； Taq DNA Polymerase (2U / L) ； 引物：引物：CKB-F/CKB-R，引物溶液浓度为，引物溶液浓度为10 M； CKB基因模板质粒基因模板质粒: （购自（购自YRBIO基因库基因库）；）； 无菌超纯水；无菌超纯水； 琼脂糖。琼脂糖。聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论5实
20、验步骤v准备准备PCR反应溶液，取反应溶液，取0.2 mL PCR管，按以下顺管，按以下顺序加入各试剂：序加入各试剂： PCR反应体系反应体系 无菌超纯水无菌超纯水 38 L 10buffer 5.0 L dNTP mix 2.5 L 引物引物CKB-F 1 L 引物引物CKB-R 1 L 模板模板 2 L Taq酶酶 0.5 L 合计合计 50 L实验步骤v 调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。仪上，执行扩增。v 反应程序：反应程序：94 5 min；94 30 sec；60 30 sec；721min 10 sec；
21、30个循环，最后个循环，最后72延伸延伸10 min。v 每人做一管，反应完毕后，各取每人做一管，反应完毕后，各取3 L进行琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶（1.0%）电泳检测。）电泳检测。聚合酶链式反应（PCR） 实验目的实验目的1 实验原理（实验原理（PCRPCR及引物设计）及引物设计）2 实验仪器、试剂及耗材实验仪器、试剂及耗材3 实验步骤实验步骤4 实验结果及讨论实验结果及讨论5实验结果及讨论PCR结果。12、PCR产物（3ul样品）1. 1. 无扩增产物无扩增产物 模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适对样品不合适 引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发
22、生降解 退火温度太高退火温度太高2. 2. 非特异性扩增非特异性扩增 引物特异性差引物特异性差 模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 酶量过多酶量过多 退火温度偏低退火温度偏低 循环次数过多循环次数过多3. 3. 拖尾拖尾产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 2模板不纯或降解模板不纯或降解BufferBuffer不合适不合适退火温度偏低退火温度偏低酶量过多酶量过多dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高循环次数过多循环次数过多4. 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况)交叉污染交叉污染 对策对策 操作时防止将靶序列吸入加样枪内或操
23、作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；溅出离心管外； 除不能耐高温的物质外，所有试剂器除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。性使用。 各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。 设置阳性和阴性对照，重复实验设置阳性和阴性对照，重复实验Contentp 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR） 的技术原的技术原理及实验操作理及实验操作p PCR引物设计软件的使用（引物设计软件的使用（ Primer Premier 5.0 ）常用的引物设计软件vPrimer Premier 5.0（自动搜索）（自动搜索）*v
24、Oligo 6 （引物评价）（引物评价）*vVector NTI SuitvDnasisvOmigavDnastarPrimer Premier 5.0 简介主要功能主要功能:1 1、引物设计引物设计2 2、限制性内切酶位点分析、限制性内切酶位点分析3 3、DNA DNA 基元基元(motif)(motif)查找查找4 4、同源性分析、同源性分析Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍Preimer Premier 启动界面Load sequenceSequence nameOriginal sequenceUse these two butto
25、n to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DNA seq 8种密码子偏好Choose a function 引物设计界面引物设计界面First you can design the primer manuallySense strand or anti-sense strandUseful information of the primer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物评分100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口
26、引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer引物编辑引物编辑编辑引物分析引物结果确认编辑的引物引物设计实例v扩增扩增CKB基因基因CDS区片段（区片段（1.2KB）v亚克隆到亚克隆到pEGFP-N1载体，构建真核表达载体载体，构建真核表达载体pEGFP-N1-CKB引物设计实例查找查找CKB基因基因(NM_001823)序列及序列及CDS区序列区序列分析待扩增片段和载体的酶切位点，选择合适分析待扩增片段和载体的酶切位点，选择合适的克隆位点的克隆位点Primer5.0 软件设计引物软件设计引物酶切位点分析酶切位点分析CKB CDS
27、Non-cutting enzymes: BamHI, BglII, BsaI, EcoRI, EcoRV, HindIII, KpnI, MluI, NheI, NotI, PacI, PmeI, SalI, SpeI, SphI, XbaI, XhoI使用软件：使用软件：DNAstar载体图谱载体图谱基因的终止密码基因的终止密码子必须去除！子必须去除！保持插入基因和保持插入基因和载体的读码框一载体的读码框一致！致！CKB(EcoRI-BamHI)：CKB-f：5-ATGCCCTTCTCCAACAGCCA-3-Kozak序列：序列：GCC ACC-EcoRI：G GAATTC-final primer：5-G GAATTC GCC ACC ATGCCCTTCTCCAACAGCCA-3 Length=33CKB-r：5-TTTCTGGGCAGGCATGAGGT-3-保持读码框完整性：保持读码框完整性：CG-BamHI：CG GGATCC-final primer：5-CG GGATCC CG TTTCTGGGCAGGCATGAGGT-3 Length=30product：Length=1.2kb，GC%=64.1，Ta=60.6
