1、生物制品学生物制品学艾滋病疫苗国家工程实验室艾滋病疫苗国家工程实验室 张海红张海红第三篇第三篇 基因工程疫苗基因工程疫苗n第一章第一章 基因工程基因工程n第二章第二章 基因工程疫苗基因工程疫苗n第三章第三章 基因工程疫苗质量控制基因工程疫苗质量控制第一章第一章 基因工程基因工程 第一节第一节 基因工程概述基因工程概述 第二节第二节 基因工程产品的生产过程基因工程产品的生产过程 第一节、第一节、 基因工程概述基因工程概述n一、基因工程的定义一、基因工程的定义n二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序n三、基因工程历史上的重要人物三、基因工程历史上的重要人物n四、四、 理论基础理论基础
2、一、基因工程定义一、基因工程定义 基因工程基因工程(Genetic engineering)是一种是一种DNA重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，重组技术，它是在分子水平上进行的遗传操作，即把即把供体细胞中的基因或基因组供体细胞中的基因或基因组提取出来，按提取出来，按照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者照预先设计的蓝图，经过体外加工重组，或者把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的把人工合成的基因转移到受体细胞并获得新的遗传特性的技术。由于被转移的基因必须与遗传特性的技术。由于被转移的基因必须与载载体体DNA重组后才能实现转移，所以基因工程重组后才能实现转移，所以基因工程也叫做重组也
3、叫做重组DNA技术。技术。二、基因工程的基本操作程序二、基因工程的基本操作程序n（1）目的基因的分离或合成；）目的基因的分离或合成；n（2）用工具酶对目的基因和载体（）用工具酶对目的基因和载体（Vector）进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组进行加工处理，把目的基因与载体结合成重组DNA分子；分子；n（3）把重组）把重组DNA分子引入受体细胞，并使目分子引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因得以表达；的基因和载体上其他基因得以表达；n（4）转化体细胞的扩增；）转化体细胞的扩增；n（5）重组体细胞的鉴定与筛选。）重组体细胞的鉴定与筛选。n三、基因工程历史上的重要人物三、基因工程历史上的
4、重要人物 不能忘记的人不能忘记的人 Paul Berg 伯格（美国生物化学家）伯格（美国生物化学家）通过把两个不同来源的通过把两个不同来源的DNADNA连结在一起并发挥其连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因了完全可以在体外对基因进行操作。他作为进行操作。他作为“重组重组DNADNA技术之父技术之父”于于19801980年年获诺贝尔化学奖。获诺贝尔化学奖。 不能忘记的人不能忘记的人Kary B Mullis 1985年穆利斯发明了年穆利斯发明了高效复制高效复制DNA片段的聚片段的聚和酶链式反应（和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从技术，利用该
5、技术可从极其微量的样品中大量极其微量的样品中大量生产生产DNA分子，使基因分子，使基因工程获得了革命性发展。工程获得了革命性发展。四、理论基础四、理论基础n不同基因具有相同的物质基础；不同基因具有相同的物质基础；n基因是可切割的；基因是可切割的；n基因是可以转移的；基因是可以转移的；n多肽和基因之间存在对应关系；多肽和基因之间存在对应关系；n遗传密码是通用的；遗传密码是通用的；n基因可以通过复制把遗传信息传给下基因可以通过复制把遗传信息传给下一代。一代。 第二节第二节 基因工程产品的生产过程基因工程产品的生产过程n一、构建过程示意图一、构建过程示意图n二、发酵的一般过程二、发酵的一般过程n三、
6、下游加工过程三、下游加工过程2. 生产过程生产过程上游构建上游构建（基因工程）（基因工程）发酵生产发酵生产（发酵工程）（发酵工程）纯化制备纯化制备 一、构建过程示意图一、构建过程示意图1.载体（载体（Vector）的选择）的选择种类种类：质粒质粒、噬菌体噬菌体和和动植物病毒动植物病毒。选择标准：选择标准： 能自主复制；能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选 和鉴定；和鉴定； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有多个单一酶切位点插入点），常具有多个单一酶切位点 （多克隆位点）；（多克隆位点）； 分子量小，以容纳较
7、大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。 质粒质粒（Plasmid） 是存在于细是存在于细菌染色体外的小菌染色体外的小型环状双链型环状双链DNADNA分子分子, ,大小约为大小约为数千碱基对。常数千碱基对。常有有1 31 3个抗药个抗药性基因，以利于性基因，以利于筛选。筛选。 原核表达体系：原核表达体系：如大肠杆菌（如大肠杆菌（ E. coli ）等）等2.表达体系的选择表达体系的选择 优点：优点： 强启动子强启动子, ,表达量大表达量大 翻译调控序列翻译调控序列 生产简单生产简单 不足：不足： 缺乏转录后加工机制缺乏转录后加工机制 缺乏翻译后加工机制缺乏翻译后加工机制 表达产物形成不
8、溶性包涵体表达产物形成不溶性包涵体 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白优点：优点：可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 一般具有天然活性一般具有天然活性表达产物分区积累表达产物分区积累真核表达体系真核表达体系如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞和植物细胞如酵母、昆虫及哺乳类动物细胞和植物细胞缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济酵母菌的结构酵母菌的结构二、发酵的一般过程二、发酵的一般过程 发酵工艺多种发酵工艺多种多样，但基本上包多样，但基本上包括以下三个过程括以下三个过程: 发酵罐的结构示意图发酵罐的结构示意图 1、菌种制备、菌种制备 2、种子扩大培养、种子扩大
9、培养 3、大规模罐批培养、大规模罐批培养三、下游加工过程三、下游加工过程 从发酵液中分离、精制有关产品的过从发酵液中分离、精制有关产品的过程称为发酵生产的下游加工过程。它是生程称为发酵生产的下游加工过程。它是生产过程中最重要、成本费用最高的环节。产过程中最重要、成本费用最高的环节。至今高效液相色谱仍是最常用的手段。至今高效液相色谱仍是最常用的手段。一般可分为四个阶段：一般可分为四个阶段：1、发酵液预处理和固液分离、发酵液预处理和固液分离2、提取、提取3、精制、精制4、成品加工、成品加工基因工程疫苗基因工程疫苗第一节第一节 基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗第二节第二节 基因工程载体疫苗基因工
10、程载体疫苗第三节第三节 核酸疫苗核酸疫苗第四节第四节 基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗第五节第五节 蛋白工程疫苗蛋白工程疫苗第六节第六节 转基因植物疫苗转基因植物疫苗第七节第七节 基因工程疫苗的优越性及其发展重点基因工程疫苗的优越性及其发展重点第一节第一节 基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗一、一、 定义定义二、二、 抗原基因的选择抗原基因的选择三、三、 表达系统表达系统一、定义：一、定义： 又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，主要指将病原微生物的苗，主要指将病原微生物的抗原基因抗原基因用分用分子生物学的方法分离，然后与子生物学的方法分离，然后与载体载体D
11、NA相相连接，在经载体将抗原基因带进受体进行连接，在经载体将抗原基因带进受体进行复制与表达，最后将基因工程表达的复制与表达，最后将基因工程表达的蛋白蛋白质抗原质抗原分离纯化后制成疫苗。分离纯化后制成疫苗。二、抗原基因的选择二、抗原基因的选择1、一般选择病原体表面糖蛋白编码基因、一般选择病原体表面糖蛋白编码基因2、对于易变异的病毒（如、对于易变异的病毒（如HA）则应选择各）则应选择各亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基亚型共有的核心蛋白的主要保护性抗原基因因3、一般选择两种以上的抗原基因构建重组体、一般选择两种以上的抗原基因构建重组体三、三、 表达系统表达系统n1、种类：、种类：大肠杆菌：大肠杆
12、菌：BL21枯草杆菌枯草杆菌:酵母细胞酵母细胞: 毕赤酵母毕赤酵母昆虫细胞：昆虫细胞：SF9哺乳细胞：哺乳细胞：CHO、转基因植物转基因植物: 番茄、马铃薯、香蕉番茄、马铃薯、香蕉转基因动物转基因动物: 牛牛三、三、 表达系统表达系统n2、表达系统选择的依据、表达系统选择的依据n（1）表达抗原的免疫原性强弱）表达抗原的免疫原性强弱蛋白翻译后修饰蛋白翻译后修饰 哺乳细胞哺乳细胞 酵母细胞酵母细胞 大肠杆菌大肠杆菌n（2）表达效率的高低）表达效率的高低大肠杆菌大肠杆菌 酵母细胞酵母细胞 哺乳细胞哺乳细胞n（3）表达产物纯化的难易程度）表达产物纯化的难易程度表达量越大越容易纯化表达量越大越容易纯化带
13、标签的容易纯化带标签的容易纯化 基因工程亚单位疫苗的优缺点基因工程亚单位疫苗的优缺点n优点优点: 与传统疫苗相比，安全性较好与传统疫苗相比，安全性较好n缺点：免疫效果价差缺点：免疫效果价差n增强免疫原性的方法：增强免疫原性的方法：调整基因组合，使其表达成颗粒结构调整基因组合，使其表达成颗粒结构在体外将抗原聚团化，如包入脂质体或胶囊微球在体外将抗原聚团化，如包入脂质体或胶囊微球加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂第二节第二节 基因工程载体疫苗基因工程载体疫苗n一、定义：一、定义：利用微生物作载体，将保护性抗原基因重组到利用微生物作载体，将保护性抗原基因重组到微生体
14、中，利用这种能表达保护性抗原基因的微生体中，利用这种能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗，称载体疫苗。重组微生物制成的疫苗，称载体疫苗。n二、分类二、分类以细菌为载体的基因工程疫苗以细菌为载体的基因工程疫苗以病毒为载体的基因工程疫苗以病毒为载体的基因工程疫苗1、以细菌为载体的基因工程疫苗、以细菌为载体的基因工程疫苗n减毒的减毒的沙门氏菌沙门氏菌和和卡介苗卡介苗是最重要的和用途最广是最重要的和用途最广的载体；前者能诱导粘膜免疫反应，后者以诱导的载体；前者能诱导粘膜免疫反应，后者以诱导细胞免疫为主。细胞免疫为主。n减毒沙门氏菌载体减毒沙门氏菌载体伤寒沙门氏菌是一种肠道致病菌。美国伤寒沙门氏菌
15、是一种肠道致病菌。美国FDA批准用于批准用于临床的伤寒临床的伤寒Ty21a减毒活疫苗显示了很好的安全性和免减毒活疫苗显示了很好的安全性和免疫原性。疫原性。至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙肝、流感、和血吸至今已有结核杆菌、霍乱弧菌、乙肝、流感、和血吸虫等数十种病原微生物的外源基因在沙门氏菌的减毒虫等数十种病原微生物的外源基因在沙门氏菌的减毒活疫苗中获得了不同程度的表达。活疫苗中获得了不同程度的表达。n卡介苗载体：卡介苗载体：卡介苗的使用已有半个世纪，全世界已有卡介苗的使用已有半个世纪，全世界已有40多多亿人接种过卡介苗，诱导的反应可长达亿人接种过卡介苗，诱导的反应可长达5-50年。年。是理想的表达
16、载体。是理想的表达载体。但是临床试验结果并不理想，主要原因是卡介但是临床试验结果并不理想，主要原因是卡介苗本身会刺激接种者产生很强的针对分枝杆菌苗本身会刺激接种者产生很强的针对分枝杆菌的免疫反应。的免疫反应。2、以病毒为载体的基因工程疫苗、以病毒为载体的基因工程疫苗n可视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫可视为病毒减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合。苗的结合。n主要有：痘病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病主要有：痘病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、和单纯疱疹病毒。毒、和单纯疱疹病毒。1、痘病毒、痘病毒优点：优点：（1）安全性好，是人类使用了近）安全性好，是人类使用了近200年的最为安全的疫苗；年的最为安全的
17、疫苗；（2）宿主广泛，能感染多种类型的细胞；）宿主广泛，能感染多种类型的细胞；（3）插入外源基因的容量大，可插入）插入外源基因的容量大，可插入20kDa的外源基因。的外源基因。（4）易培养，病毒自身的耐热性强和容易获得高效价的）易培养，病毒自身的耐热性强和容易获得高效价的培养特点。培养特点。缺点：虽然已有很多牛痘基因工程疫苗进入临床试验缺点：虽然已有很多牛痘基因工程疫苗进入临床试验阶段，但还有很多问题需要克服，如不能口服，接阶段，但还有很多问题需要克服，如不能口服，接种过天花疫苗的人有预存免疫等问题。种过天花疫苗的人有预存免疫等问题。2、腺病毒、腺病毒n优点：优点：n缺点：预存免疫缺点：预存免
18、疫第三节第三节 核酸疫苗核酸疫苗n核酸疫苗的研究背景核酸疫苗的研究背景n构建核酸疫苗的基本要素构建核酸疫苗的基本要素目的基因和目的基因和载体载体n核酸疫苗的优缺点核酸疫苗的优缺点核酸疫苗的研究背景核酸疫苗的研究背景n1992年，年，Tang等给小鼠直接注射含有人生长素基等给小鼠直接注射含有人生长素基因的质粒因的质粒DNA，诱导小鼠产生了针对人生长激素，诱导小鼠产生了针对人生长激素的抗体，标志着核酸疫苗的出现。的抗体，标志着核酸疫苗的出现。n1994年，开始，美国年，开始，美国FDA已陆续批准了艾滋病、已陆续批准了艾滋病、流感、乙肝、单纯疱疹病毒、疟疾和癌胚抗原等流感、乙肝、单纯疱疹病毒、疟疾和
19、癌胚抗原等核酸疫苗进入临床。核酸疫苗进入临床。n1995年美国纽约科学院召开会议专门研讨年美国纽约科学院召开会议专门研讨DNA疫疫苗，称之为疫苗学的新纪元和疫苗的第三次革命苗，称之为疫苗学的新纪元和疫苗的第三次革命构建核酸疫苗的基本要素构建核酸疫苗的基本要素n1、目的基因、目的基因可以是针对某一抗原的单基因片段或基因的可以是针对某一抗原的单基因片段或基因的cDNA,也可以是一组基因、多个基因（多重抗也可以是一组基因、多个基因（多重抗原性基因）或嵌合型基因。原性基因）或嵌合型基因。是核酸疫苗设计的关键因素。是核酸疫苗设计的关键因素。构建核酸疫苗的基本要素构建核酸疫苗的基本要素n2、DNA疫苗的载
20、体疫苗的载体（1）可以克隆外源基因的多重限制性内切酶位点）可以克隆外源基因的多重限制性内切酶位点（2）具有真核细胞启动子）具有真核细胞启动子（3）具有）具有CpG核苷酸基序核苷酸基序（4）具有用于选择的标记）具有用于选择的标记 最好卡那霉素，氨卡青霉素有预存免疫最好卡那霉素，氨卡青霉素有预存免疫（5）具有能在大肠杆菌中复制的基因）具有能在大肠杆菌中复制的基因核酸疫苗的优点核酸疫苗的优点n（1）免疫保护力增强。）免疫保护力增强。CTL应答是机体杀死癌变细胞的有效清除途应答是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。肿瘤基因疫苗接种机体后，其表达的内源性抗原有利于径。肿瘤基因疫苗接种机体后，其表达的内源性抗
21、原有利于MHC-类分子的抗原提呈和类分子的抗原提呈和CTL的产生，从而产生强有力的细胞免疫，并促的产生，从而产生强有力的细胞免疫，并促进体液免疫功能的加强，从而预防和免疫治疗肿瘤。（进体液免疫功能的加强，从而预防和免疫治疗肿瘤。（2）产生持久）产生持久免疫应答，肿瘤免疫应答，肿瘤DNA疫苗可在体内长时间表达，持续的刺激免疫系统，疫苗可在体内长时间表达，持续的刺激免疫系统，使其抗瘤作用持久存在，在肿瘤的治疗和预防上均有着广阔的前景。使其抗瘤作用持久存在，在肿瘤的治疗和预防上均有着广阔的前景。（3）有很好的可控性，其诱生的免疫反应的强度和方向性，可通过）有很好的可控性，其诱生的免疫反应的强度和方向
22、性，可通过改变接种方法和部位、质粒中的免疫刺激序列以及细胞因子和共刺激改变接种方法和部位、质粒中的免疫刺激序列以及细胞因子和共刺激分子基因的同时使用等进行调整，可将多个抗原表位基因克隆在同一分子基因的同时使用等进行调整，可将多个抗原表位基因克隆在同一表达载体而制备成多价疫苗的特点，是常规疫苗无法比拟的。表达载体而制备成多价疫苗的特点，是常规疫苗无法比拟的。核酸疫苗的优点核酸疫苗的优点n（4）肿瘤）肿瘤DNA疫苗具有制备容易、生产成本低疫苗具有制备容易、生产成本低廉、可批量生产。（廉、可批量生产。（5）质粒）质粒DNA稳定性好，便稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏、使用方法简单，有利于贮存和运输
23、，无须冷藏、使用方法简单，有利于将来的推广应用。（于将来的推广应用。（6）安全性好，由于基因）安全性好，由于基因疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原表达，不与宿主染色体表达，不与宿主染色体DNA整合。因此与传统疫整合。因此与传统疫苗相比，基因疫苗的应用性和可操作性都大为增苗相比，基因疫苗的应用性和可操作性都大为增强。强。第四节第四节 基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗n就是应用基因操作技术，将病原微生物中就是应用基因操作技术，将病原微生物中与致病性有关的毒力序列除去或关闭，使与致病性有关的毒力序列除去或关闭，使之成为无毒株或弱毒株，但仍保持有良好之成为
24、无毒株或弱毒株，但仍保持有良好的免疫原性，从而制成安全有效的疫苗。的免疫原性，从而制成安全有效的疫苗。n优点：与自然减毒株相比，基因缺失突变优点：与自然减毒株相比，基因缺失突变株具有株具有突变性状明确、稳定、不易返租突变性状明确、稳定、不易返租等等优点。优点。第五节第五节 蛋白质工程疫苗蛋白质工程疫苗n是指将抗原基因加以改造，使之发生点突是指将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、缺失等构型改变，甚至进行不变、插入、缺失等构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的人工组合，以增强同基因或部分结构域的人工组合，以增强其产物的免疫原性、扩大反应普、去除有其产物的免疫原性、扩大反应普、去除有害作用或
25、副反应的一类疫苗。害作用或副反应的一类疫苗。第六节第六节 转基因植物疫苗转基因植物疫苗n目的目的 ：通过导入特定的外源基因来获得转：通过导入特定的外源基因来获得转基因植物，以改良作物、研究植物基因功基因植物，以改良作物、研究植物基因功能、生产具有重要经济价值的蛋白质等。能、生产具有重要经济价值的蛋白质等。n研究的两个方面：研究的两个方面：1、与植物重要生命活动有关的基因或其、与植物重要生命活动有关的基因或其cDNA的克隆。的克隆。2、将外源基因导入并整合到植物基因组以获、将外源基因导入并整合到植物基因组以获得转基因植物。得转基因植物。一、生产疫苗用转基因植物的选择一、生产疫苗用转基因植物的选择
26、n作为生产疫苗用的转基因植物应有的特点：作为生产疫苗用的转基因植物应有的特点：该植物可以在世界上较多地区，特别是发展中该植物可以在世界上较多地区，特别是发展中国家种植，并能获得较高的产量；国家种植，并能获得较高的产量；容易该婴幼儿喂服，并能被家长们接受；容易该婴幼儿喂服，并能被家长们接受；作为疫苗的植物，其可食部分必须是可生食的作为疫苗的植物，其可食部分必须是可生食的含有较高的蛋白质含量。含有较高的蛋白质含量。1、 烟草烟草n优势：优势：是植物组织培养和遗传转化的模式生物，易获是植物组织培养和遗传转化的模式生物，易获得转基因植物；得转基因植物；蛋白质含量丰富，可通过纯化技术获得；蛋白质含量丰富
27、，可通过纯化技术获得；n劣势：劣势：但含有个尼古丁等有害物质但含有个尼古丁等有害物质2、马铃薯、马铃薯n优势：优势：马铃薯的遗传转化体系已经建立，在很短的时间内即马铃薯的遗传转化体系已经建立，在很短的时间内即可获得大量的转基因植物；可获得大量的转基因植物；马铃薯可使用的块茎组织特异性启动子已被克隆，可马铃薯可使用的块茎组织特异性启动子已被克隆，可使外源基因在块茎内特异的大量表达；使外源基因在块茎内特异的大量表达；马铃薯的组织培养快速繁殖系统业已成熟，可以供应马铃薯的组织培养快速繁殖系统业已成熟，可以供应大量遗传背景一致的种苗；大量遗传背景一致的种苗；马铃薯可以被很多动物食用，动物实验不成问题。
28、马铃薯可以被很多动物食用，动物实验不成问题。n劣势：劣势：马铃薯块茎蛋白质含量较低，马铃薯块茎蛋白质含量较低，人类无生食马铃薯的习惯。人类无生食马铃薯的习惯。3、香蕉、香蕉n优势：优势：在东南亚、非洲、印度次大陆、河南美等发展在东南亚、非洲、印度次大陆、河南美等发展中国家被大量种植，价格非常便宜；中国家被大量种植，价格非常便宜；香蕉的蛋白质含量较高，一个香蕉可以给香蕉的蛋白质含量较高，一个香蕉可以给10个个婴儿接种免疫婴儿接种免疫可以口服。可以口服。n劣势：劣势：香蕉的组织培养和遗传转化研究尚待进一步完香蕉的组织培养和遗传转化研究尚待进一步完善，至今还没有转基因香蕉种植成功的报道。善，至今还没
29、有转基因香蕉种植成功的报道。二、转基因植物的优越性二、转基因植物的优越性n1、植物具有全能性。、植物具有全能性。n2、植物细胞具有完整的真核细胞表达系统。表达产、植物细胞具有完整的真核细胞表达系统。表达产物可进行反以后修饰和加工，与高等等动物细胞表物可进行反以后修饰和加工，与高等等动物细胞表达的抗原具有一致的免疫原性及生物学活性。达的抗原具有一致的免疫原性及生物学活性。n3、可诱导黏膜免疫反应。黏膜免疫是人体的第一道、可诱导黏膜免疫反应。黏膜免疫是人体的第一道屏障。屏障。n4、生产简单，成本低廉。阳光和土地、生产简单，成本低廉。阳光和土地n5、接种简单。可口服、接种简单。可口服n6、安全。本质
30、即食物，安全可靠。、安全。本质即食物，安全可靠。三、目前在研的几种主要的转基因三、目前在研的几种主要的转基因植物疫苗植物疫苗n主要研究方向：主要研究方向：利用植物作为工厂来生产大量的蛋白质抗原，利用植物作为工厂来生产大量的蛋白质抗原，然后经过分离和提纯，在制备成疫苗；然后经过分离和提纯，在制备成疫苗；不需要分离提纯，将植物或其某部分作为可以不需要分离提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。直接口服的疫苗。1、非直接口服的转基因植物疫苗、非直接口服的转基因植物疫苗n1） 乙肝表面抗原转基因植物疫苗乙肝表面抗原转基因植物疫苗基因插入质粒载体，转入农杆菌后在转入烟草，颗粒基因插入质粒载体，转入
31、农杆菌后在转入烟草，颗粒为为22nm，与人血清中的类似，而酵母表达的颗粒为，与人血清中的类似，而酵母表达的颗粒为17nm。n2） 诺瓦克病毒衣壳蛋白转基因植物疫苗诺瓦克病毒衣壳蛋白转基因植物疫苗诺瓦克病毒是能引起腹泻的病原体，每年造成诺瓦克病毒是能引起腹泻的病原体，每年造成300万儿万儿童死亡。用烟草表达量可达烟草的童死亡。用烟草表达量可达烟草的0.23%n3） 狂犬病毒糖蛋白转基因植物疫苗狂犬病毒糖蛋白转基因植物疫苗McGarvey等在番茄中表达的狂犬病毒表面糖蛋白，能等在番茄中表达的狂犬病毒表面糖蛋白，能与病毒天然蛋白质产生的抗体形成免疫沉淀，并在小与病毒天然蛋白质产生的抗体形成免疫沉淀，
32、并在小鼠中测到了中和抗体。鼠中测到了中和抗体。2、直接口服的转基因植物疫苗、直接口服的转基因植物疫苗n大肠杆菌肠毒素植物疫苗大肠杆菌肠毒素植物疫苗n结核转基因植物疫苗结核转基因植物疫苗把结核杆菌分泌性蛋白质把结核杆菌分泌性蛋白质MPT-64和和ESET-6的基因导的基因导入烟草、黄瓜、番茄和胡萝卜的研究正在进行中。其入烟草、黄瓜、番茄和胡萝卜的研究正在进行中。其中中MPT-64蛋白质的基因已经在番茄中获得了表达。蛋白质的基因已经在番茄中获得了表达。n动物传染病的转基因植物疫苗动物传染病的转基因植物疫苗Carrillo等报道了将编码家畜口蹄疫病单独结构基因等报道了将编码家畜口蹄疫病单独结构基因V
33、P1的基因转入到植物拟南芥中，转基因植物叶子的的基因转入到植物拟南芥中，转基因植物叶子的提取物能诱导小鼠产生特异性的抗体，能保护小鼠地提取物能诱导小鼠产生特异性的抗体，能保护小鼠地抵抗口蹄疫病毒的袭侵袭。抵抗口蹄疫病毒的袭侵袭。四、转基因植物存在的问题四、转基因植物存在的问题n1、产生免疫保护所需的具体剂量不清楚、产生免疫保护所需的具体剂量不清楚n2、如何去除转基因植物带中的抗生素、如何去除转基因植物带中的抗生素n3、植物细胞壁的天然生物胶囊作用虽然能、植物细胞壁的天然生物胶囊作用虽然能避免植物疫苗在消化道中过早被降解，但避免植物疫苗在消化道中过早被降解，但如果久久不能被释放也是致命的缺点。寻
34、如果久久不能被释放也是致命的缺点。寻找一个最佳平衡点，是植物疫苗在最适合找一个最佳平衡点，是植物疫苗在最适合的部位发挥作用也是今后研究的方向。的部位发挥作用也是今后研究的方向。第七节第七节 基因工程疫苗的优越性及其基因工程疫苗的优越性及其发展重点发展重点n一、基因疫苗的优越性一、基因疫苗的优越性n二、基因工程疫苗发展的重点二、基因工程疫苗发展的重点一、基因疫苗的优越性一、基因疫苗的优越性n1、安全性、安全性n2、经济效益、经济效益二、基因工程疫苗发展的重点二、基因工程疫苗发展的重点n1、主要研究常规技术不能决绝或很难解决、主要研究常规技术不能决绝或很难解决的新疫苗的新疫苗n2、积极进行传统疫苗
35、的改造、积极进行传统疫苗的改造n3、加强治疗性疫苗的研究、加强治疗性疫苗的研究n4、发展多价疫苗、发展多价疫苗 第三章第三章 基因工程产品的质量控制基因工程产品的质量控制n第一节第一节 原材料的质量控制原材料的质量控制n第二节第二节 培养过程的质量控制培养过程的质量控制n第三节第三节 纯化工艺过程的质量控制纯化工艺过程的质量控制n第四节第四节 目标产品的质量控制目标产品的质量控制意义意义 利用活细胞作为表达系统，产物利用活细胞作为表达系统，产物的分子量较大，并有复杂的结构，的分子量较大，并有复杂的结构，还参与生理功能的调节，用量极还参与生理功能的调节，用量极微，任何质和量的偏差都可贻误微，任何
36、质和量的偏差都可贻误病情造成严重危害。病情造成严重危害。 宿主细胞中表达的外源基因，宿主细胞中表达的外源基因，在转录翻译精制工艺放大过程在转录翻译精制工艺放大过程中都可能发生变化，故从原料中都可能发生变化，故从原料以及制备全过程都必须严格控以及制备全过程都必须严格控制条件和鉴定质量。制条件和鉴定质量。第一节第一节 原材料的质量控制原材料的质量控制 原材料的质量控制是确保编码原材料的质量控制是确保编码药品的药品的DNA序列的正确性，重组微序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产品质量的安全性和稳定，以保证产品质量的安全性和一致性。一致性。 根
37、据质量控制要求应了解以下根据质量控制要求应了解以下 特性：特性： 明确目的基因的来源、克隆经过，明确目的基因的来源、克隆经过，并以限制性内切酶酶切图谱并以限制性内切酶酶切图谱 和核苷酸序列予以确证；和核苷酸序列予以确证； 应提供表达载体的名称、结构、应提供表达载体的名称、结构、遗传特性及各组成部分（如复制子、遗传特性及各组成部分（如复制子、启动子）的来源与功能，构建中所启动子）的来源与功能，构建中所用位点的酶切图谱，抗生素抗性标用位点的酶切图谱，抗生素抗性标记物；记物； 应提供宿主细胞的名称、来源、应提供宿主细胞的名称、来源、传代历史、检定结果及其生物学特传代历史、检定结果及其生物学特性；性；
38、 须阐明载体引入宿主细胞的方法须阐明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞与载体结合后的及载体在宿主细胞与载体结合后的遗传稳定性；遗传稳定性； 提供插入基因与表达载体两侧端提供插入基因与表达载体两侧端控制区内的核苷酸序列，详细叙述控制区内的核苷酸序列，详细叙述在生产过程中启动与控制基因在宿在生产过程中启动与控制基因在宿主细胞中表达的方法及水平等。主细胞中表达的方法及水平等。第二节第二节 培养过程的质量控制培养过程的质量控制 在工程菌的贮存中，要求种子在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；克隆纯而稳定； 在培养过程中，要求工程菌所在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定，始终无突变；含的质粒稳定
39、，始终无突变； 在重复生产发酵中，工程菌表在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；达稳定； 始终能排除外源微生物污染。始终能排除外源微生物污染。 生产基因工程产品应有种子生产基因工程产品应有种子批系统，并证明种子批不含有致批系统，并证明种子批不含有致癌因子，无细菌、病毒、真菌和癌因子，无细菌、病毒、真菌和支原体等污染，并由原始种子批支原体等污染，并由原始种子批建立生产用工作细胞库。建立生产用工作细胞库。 原始种子批须确证克隆基因原始种子批须确证克隆基因DNADNA序列，详细叙述种子批来源、序列，详细叙述种子批来源、方式、保存及预计使用期，保存方式、保存及预计使用期，保存与复苏时宿主载体表达系统的稳与
40、复苏时宿主载体表达系统的稳定性。定性。 对生产种子，应详细叙述细对生产种子，应详细叙述细胞生长与产品生成的方法和材料，胞生长与产品生成的方法和材料，并控制微生物污染；提供培养生并控制微生物污染；提供培养生产浓度与产量恒定性数据，依据产浓度与产量恒定性数据，依据宿主细胞宿主细胞- -载体系统稳定性，确定载体系统稳定性，确定最高允许传种代数；最高允许传种代数； 在培养过程中，应测定被表在培养过程中，应测定被表达基因分子的完整性及宿主细达基因分子的完整性及宿主细胞长期培养后的基因型特征；胞长期培养后的基因型特征；依宿主细胞依宿主细胞- -载体稳定性与产品载体稳定性与产品恒定性，规定持续培养时间，恒定
41、性，规定持续培养时间，并定期评价细胞系统和产品。并定期评价细胞系统和产品。 培养周期结束时，应监测培养周期结束时，应监测宿主细胞宿主细胞- -载体系统的特性，载体系统的特性，如质粒拷贝数、宿主细胞中如质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度，含插入表达载体存留程度，含插入基因载体的酶切图谱等。基因载体的酶切图谱等。 第三节第三节 纯化工艺过程的质量控制纯化工艺过程的质量控制 产品要有足够的生理和生产品要有足够的生理和生物学试验数据，确证提纯物分物学试验数据，确证提纯物分子批间保持一致性；外源蛋白子批间保持一致性；外源蛋白质、质、DNA与热源质控制在规定与热源质控制在规定限度以下。限度以下。 在精
42、制过程中能清除宿主在精制过程中能清除宿主细胞蛋白质、核酸、糖类、病细胞蛋白质、核酸、糖类、病毒、培养基成分及精制工序本毒、培养基成分及精制工序本身引入的化学物质，并有检测身引入的化学物质，并有检测方法。方法。第四节第四节 目标产品的质量控制目标产品的质量控制 基因工程药物的质量控制主要基因工程药物的质量控制主要包括以下几项要求包括以下几项要求:产品的产品的鉴别、纯鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致度、活性、安全性、稳定性和一致性性。它需要利用生物化学、免疫学、。它需要利用生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物微生物学、细胞生物学和分子生物学等多学科的理论与技术所建立的学等多学科的
43、理论与技术所建立的鉴定方法。鉴定方法。 产品的鉴别 常用的鉴定方法常用的鉴定方法: 电泳方法电泳方法: SDS-PAGE、等电聚焦、免疫电泳、等电聚焦、免疫电泳 免疫学方法免疫学方法: 放射免疫放射免疫(RIA)、酶联免疫、酶联免疫(ELISA) 受体结合试验受体结合试验 高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)、肽图分析法、末端序列、肽图分析法、末端序列分析、圆二色谱、核磁共振分析、圆二色谱、核磁共振 肽图分析肽图分析 肽图分析是用酶法或化学法降解肽图分析是用酶法或化学法降解目的蛋白质目的蛋白质,对生成的肽段进行分离分对生成的肽段进行分离分析。它是检测蛋白质一级结构最有效析。它是检测蛋白质一级结
44、构最有效的方法，该技术灵敏高效是对基因工的方法，该技术灵敏高效是对基因工程药物的分子结构和遗传稳定性进行程药物的分子结构和遗传稳定性进行评价和验证的首选方法。常用评价和验证的首选方法。常用HPLC、毛细管电泳。毛细管电泳。 氨基酸成分分析氨基酸成分分析 50个氨基酸较理想个氨基酸较理想 部分氨基酸序列分析部分氨基酸序列分析 N端端15个氨基酸可作为重个氨基酸可作为重 组蛋白质和多肽的重要鉴组蛋白质和多肽的重要鉴 定指标。定指标。 重组蛋白质浓度测定和相对分重组蛋白质浓度测定和相对分子量的测定子量的测定 蛋白质浓度测定方法有蛋白质浓度测定方法有: :福林福林- -酚酚法、双缩脲法法、双缩脲法 蛋
45、白相对分子量的测定蛋白相对分子量的测定:凝胶过滤凝胶过滤法、法、SD-SPAGE法法 蛋白质二硫键分析蛋白质二硫键分析 测定方法有测定方法有: : 对氯汞苯甲酸法等对氯汞苯甲酸法等 5 5，5 5- -二硫基双二硫基双-2-2-硝基苯甲酸法硝基苯甲酸法 纯度分析纯度分析 蛋白质含量测定蛋白质含量测定 SDS-PAGESDS-PAGE、等电聚焦、各种、等电聚焦、各种HPLCHPLC、 毛细管电泳毛细管电泳 杂质杂质 蛋白类杂质蛋白类杂质 残留宿主细胞蛋白残留宿主细胞蛋白 采采用免疫分析的方法用免疫分析的方法 非蛋白类杂质非蛋白类杂质 非蛋白类杂质非蛋白类杂质非蛋白类杂质主要有非蛋白类杂质主要有:
46、 :病毒、细菌等微生物、热原、病毒、细菌等微生物、热原、内毒素、致敏源及内毒素、致敏源及DNADNA。常用检测方法：常用检测方法：杂质和污染物杂质和污染物 检检 测测 方方 法法内毒素内毒素 鲎试剂、家兔热原法鲎试剂、家兔热原法宿主细胞蛋白宿主细胞蛋白 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、CECE其它蛋白杂质其它蛋白杂质 免疫分析、免疫分析、SDS-PAGESDS-PAGE、 HPLCHPLC、CECE残余残余DNA DNADNA DNA杂交、紫外光谱、蛋白结合杂交、紫外光谱、蛋白结合蛋白变异蛋白变异 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE甲酰蛋氨酸甲酰蛋氨
47、酸 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 IEFIEF、 CECE蛋氨酸氧化蛋氨酸氧化 肽谱、肽谱、HPLCHPLC、 质谱、氨基酸分析质谱、氨基酸分析产物变性或聚和脱氨基产物变性或聚和脱氨基 SDS-PAGESDS-PAGE、IEFIEF、HPLCHPLC、 CECE、质谱、质谱、 凝胶过滤凝胶过滤杂质和污染物杂质和污染物 检检 测测 方方 法法单克隆抗体单克隆抗体 SDS-PAGESDS-PAGE、免疫分析、免疫分析氨基酸取代氨基酸取代 氨基酸分析、肽谱、质氨基酸分析、肽谱、质 谱、谱、CECE微生物微生物 微生物学检查微生物学检查支原体支原体 微生物学检查微生物学检查病毒病毒 微生物学检查微生物学检查 生物学活性测定生物学活性测定 需通过动物体内试验和通过细胞培养需通过动物体内试验和通过细胞培养 进行体外效价测定。进行体外效价测定。稳定性考查稳定性考查 是药品有效性安全性的重要指标，是药是药品有效性安全性的重要指标，是药品贮藏条件和使用期限的主要依据。品贮藏条件和使用期限的主要依据。产品一致性的保证产品一致性的保证五、产品的保存五、产品的保存液态保存液态保存低温保存低温保存在稳定的下保存在稳定的下保存高浓度保存高浓度保存加保护剂保存加保护剂保存固态保存固态保存
