1、常规分子生物学操作要点植物病毒研究所杨 靓2011年12月5日重组重组DNA技术的原理技术的原理o重组重组DNA技术是指将一种生物体技术是指将一种生物体（供体）（供体）的基的基因与因与载体载体在在体外体外进行拼接重组，然后转入另一进行拼接重组，然后转入另一种生物体种生物体（受体）（受体）内，使之内，使之按照人们的意愿按照人们的意愿稳稳定遗传并表达出新产物或新性状的定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操体外操作程序作程序o也称为也称为分子克隆技术分子克隆技术, 基因克隆或基因工程基因克隆或基因工程o供体、受体、载体是重组供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本技术的三大基本元件元件3DNA
2、的体外重组的体外重组4EcoR5 33 5 回文序列 palindromic seq限制性核酸内切酶Sma ICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC 粘性末端 cohensive end 平末端 blunt end6DNA连接酶（连接酶（DNA ligase）oDNA连接酶催化双链连接酶催化双链DNA一端一端3-OH与另与另一双链一双链DNA的的5端磷酸根端磷酸根形成形成35磷酸磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA两端连接起来。两端连接起来。 限制性内切酶识别的靶序列与限制性内切酶识别的靶序列与DNA的来源的来源无关无关，任何不同来源的，任何
3、不同来源的DNA，经过适当限，经过适当限制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐制酶处理后，都能通过它们的粘性或平齐末端连接起来，这是末端连接起来，这是DNA重组技术的基础重组技术的基础8重组重组DNA分子的转化分子的转化o转化是指将质粒或转化是指将质粒或其他外源其他外源DNA导入导入处于感受态的宿主处于感受态的宿主细胞，并使其获得细胞，并使其获得新的表型的过程。新的表型的过程。o转化常用的宿主细转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。胞是大肠杆菌。o增殖转化细胞，使增殖转化细胞，使得有足够数量的转得有足够数量的转化细胞用于筛选程化细胞用于筛选程序序9阳性克隆的筛选和检测阳性克隆的筛选和检测目的基因载体限制
4、性内切酶限制性内切酶DNA连接酶载体自连目的基因自连重组体10阳性克隆的检测方法阳性克隆的检测方法o抗药性标记选择抗药性标记选择o蓝白斑筛选蓝白斑筛选o分子杂交法分子杂交法o插入片段大小的鉴定（酶切，插入片段大小的鉴定（酶切，PCR）o测序测序o- - -4 实验设计v 所需的各种DNA片段及其排列次序v ORFv 酶切位点4 实验方法和操作DNA体外重组技术 基因工程的操作过程基因工程的操作过程酶切酶切连接连接转化转化扩增扩增检测检测目的基因的获取目的基因的获取 克隆载体的构建克隆载体的构建外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接（体外重组）（体外重组）重组重组DNA导入受体菌导入受体菌转化
5、子的筛选和鉴定转化子的筛选和鉴定克隆基因的表达克隆基因的表达13目的基因的克隆基因的克隆o基因工程或基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体重组技术的前提条件是从生物体中分离克隆目的基因。中分离克隆目的基因。o一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；组克隆； 另一类是利用另一类是利用PCR扩增
6、技术甚至化学合成法体外扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因直接合成目的基因，然后将之克隆表达。，然后将之克隆表达。14 核酸的提取及检测核酸的提取及检测n 就基因工程而言，核酸就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的与提取是研究中很重要的基本技术。基本技术。n 核酸样品的质量将直接核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。关系到实验的成败。15基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化oDNA主要存在于细胞核的染色体中。主要存在于细胞核的染色体中。o核外也有少量核外也有少量DNA，如线粒体，如线粒体DN
7、A（mtDNA），叶绿体），叶绿体DNA（cpDNA），）， 质粒质粒DNA。o总的原则总的原则 保证一级结构的完整性保证一级结构的完整性 排除其它分子的污染排除其它分子的污染16一般步骤一般步骤(1) 破碎细胞，裂解细胞壁破碎细胞，裂解细胞壁 机械方法机械方法: 超声波处理、研磨、超声波处理、研磨、 匀浆匀浆 化学方法化学方法: SDS（阴离子去垢剂）（阴离子去垢剂） EDTA，使得，使得DNase失活失活(why?) 酶学方法酶学方法: 溶菌酶或蜗牛酶溶菌酶或蜗牛酶(2) 通过蛋白质变性通过蛋白质变性或分解，使或分解，使 DNA游离出来游离出来(3) 分离分离DNA17cDNA的分离与纯化
8、的分离与纯化（1）mRNA 分离分离oRNase，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广，不需辅助因子，耐酸碱，分布极广 oRNase的来源的来源 外源：操作者，实验器皿，试剂，空气外源：操作者，实验器皿，试剂，空气 内源：不同组织和细胞数量不同内源：不同组织和细胞数量不同o创造无创造无RNase的环境的环境 DEPC(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 异硫氰酸胍异硫氰酸胍oTrizol试剂试剂18（2）The first strand synthesis19cDNA第二链的合成方法第二链的合成方法置换合成法置换合成法o利用第一链在反转录酶作用下产生的利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA杂交链，
9、不用碱变性（水解杂交链，不用碱变性（水解mRNA），而是在），而是在dNTPs存在下，存在下，利用利用RNA酶酶H在杂交在杂交链的链的mRNA链上造成切口和缺口链上造成切口和缺口。o从而产生一系列从而产生一系列RNA引物，使之成为合成第二链引物，使之成为合成第二链的引物，在大肠杆菌的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的作用下合成的作用下合成第二链。第二链。注意：反转录酶除了具有聚合活性，还有RNaseH（降解DNA/RNA中的RNA）活性。20cDNA第二链的合成方法第二链的合成方法置换合成法置换合成法DNApol dNTPsRNaesH5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3T
10、TTTTTTTTTTTTTp 5AAAAAAAAAAAAAAp 55S1 AAAATTTOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55TTTTTTTTTTTTTTOH 3AAAAAAAAAAAAAA 55TTTTTTTTTTTTTT 33T4-DNA ligase该方法使用较多21质粒质粒DNA的分离与纯化的分离与纯化o质粒质粒plasmid: 指细菌细胞质中独立于细指细菌细胞质中独立于细菌染色体之外能自主复制的遗传单位菌染色体之外能自主复制的遗传单位o共价闭合环状共价闭合环状o质粒质粒DNA的分离：细菌培养和质粒的分离：细菌培养和质粒DNA扩增；细菌菌体的裂解；质粒扩增；细菌菌体的裂解；质粒D
11、NA的分离的分离 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。核酸的检测核酸的检测o包括包括DNA的质量、大小、纯度检测的质量、大小、纯度检测o分光光度计法分光光度计法 dsDNA：1A26050ug/ml ssDNA，RNA：1A260 40ug/ml 寡聚核苷酸：寡聚核苷酸：1A260 20ug/m
12、l A260/A280 1.651.85（DNA）；）；2.0(RNA) 比值高，有蛋白质、酚类等污染比值高，有蛋白质、酚类等污染o凝胶电泳法凝胶电泳法原理电泳及迁移率核苷酸链多聚阴离子 在生理条件下，核酸分子的糖一磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。相同分子量的双链DNA 几乎具有等量净电荷无反应活性的稳定的介质 降低了对流运动，故电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数，分子大小的不同、构型或形状的差异，所带的净电荷的多寡，便彼此分离开来。琼脂糖凝胶电泳n琼脂糖为线性多糖聚合物，红色海藻产物琼脂中提取而来。琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固，
13、密度由浓度决定的。n分辨能力同凝胶的类型和浓度有关:琼脂糖凝胶分辨 范围为0.250kb之间.不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 凝胶类型及浓度 分离DNA片段的大小范围（bp） 0.3琼脂糖 50 00010000.7琼脂糖 20 00010001.4琼脂糖 6 0003004.0琼脂糖 100010010琼脂糖 5002520琼脂糖 50127电泳装置凝胶电泳的优点它不单是一种分析的手段，同时也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。在这方面，低熔点（LMP）的琼脂糖凝胶较为方便。LMP琼脂糖是一种熔点为6265 的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37下持续保持液体状态达数小时之久，而在25下也可持续
14、保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收DNA分子。常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色，在 1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似.指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液. 作用有增加样 品密度.在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置.使样品呈色，加样操作更方便 指示剂溴化乙锭染色溴化乙锭（ethidium
15、 bromide，简称EtBr），是一种具扁平分子的核酸染料，在一切可能的部位同DNA分子结合，却不能同琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶结合并在300nm紫外光照射下放射出，可显现凝胶中0.05ug的微量DNA 方法：加入凝胶中，凝胶浸泡重要的特性：荧光强度同DNA片段的大小或数量成正比。在包含有数种DNA片段的电泳谱带中，每一条带的荧光强度是随着从最大的DNA片段到最小的DNA片段方向逐渐降低的。31操作过程DNA分子大小的检测分子大小的检测NEB，1Kb DNA Ladder：3kb=62.5ng， 1kb=21.0ngPCR产物3Kb1Kb提高转基因植物中外源基因表达的策略提高转基因植物中外源
16、基因表达的策略1.转录水平-使用高表达启动子、增强子等表达调控元件。2.翻译水平-使用翻译增强元件和植物偏爱密码子。3.翻译后水平-将转基因产物定向表达在一个合适的细胞分隔。SCMRP基因设计、合成基因设计、合成 根据大豆密码子用法分析结果，对富含甲硫氨酸根据大豆密码子用法分析结果，对富含甲硫氨酸玉米醇溶蛋白基因序列进行重新编写，并在基因玉米醇溶蛋白基因序列进行重新编写，并在基因的的5端依次设计添加端依次设计添加omega、AACAATG序列，基序列，基因因3端依次设计添加加尾信号序列、剪切序列；端依次设计添加加尾信号序列、剪切序列； 获得改造的富含甲硫氨酸蛋白质基因序列获得改造的富含甲硫氨酸
17、蛋白质基因序列SCMRP（专利申请号：（专利申请号：200410043869.0）SCMRPkozakomega加尾和剪切序列Xba IKpn IHpa ISac I图图3 植物表达载体植物表达载体pBENM的构建的构建图图4 植物表达载体植物表达载体pBENM酶切鉴定结果酶切鉴定结果M：核酸分子量标准DL15000；泳道1：质粒pUMA Xba I和Sac I双酶切产物；泳道2：质粒pBENT Xba I和Sac I双酶切产物；泳道3：质粒pBENM Xba I和Sac I双酶切产物。ORF4 酶切位点通过克隆载体引入酶切位点通过PCR引入酶切位点（需测序）部分酶切Adaptor的使用克隆的
18、先后次序通过克隆载体引入酶切位点部分酶切Adaptor的使用通用植物表达载体pBHT-5的构建 BS1: 5-GATCCGTACGTGGCCATTA-3 BS2: 3-GCATGCACCGGT-5 SS1: 5-CGGCCGACTGGAGCT-3 SS2: 3-GGAGCCGGCTGACC-5克隆的先后次序4 实验方法和操作 质粒DNA的提取 酶切与回收 连 接 转 化 转化子的鉴定 质粒质粒DNA的提取的提取采用碱变性小量提取法：采用碱变性小量提取法：o挑取单菌落，加5ml含有相应抗生素的LB液体培养基，37，200r/min，振荡培养过夜。o将菌液加入1.5ml离心管，4000r/min，
19、离心5min，尽可能弃去上清。o加100L溶液，强烈振荡至细胞均匀分散，室温放置5min。o加200L溶液，颠倒混匀，动作要轻，冰浴5min。o加150L溶液，颠倒23次混匀，冰浴5min。o4，12000r/min，离心10min，将上清移至新管，小心不要将沉淀吸入。o用等体积苯酚 氯仿抽提。4，12000r/min，离心5min。上清移至新管，小心不要吸入苯酚 氯仿。o加两倍体积95%的冰乙醇，颠倒混匀，4，12000r/min，离心10min。o用70%乙醇清洗沉淀。o倒掉乙醇，吹干。o加入适量TE溶解o电泳检测。酶切与回收酶切与回收o双酶切体系的建立oDNA的质量（不需要加大酶量）o凝
20、胶重量o回收片段的质量（大片段降解？连接比）连连 接接o连接体系（需要调整）载体和DNA片段的大小PEG的添加（T载体、平末端连接）o连接条件：温度（粘性、平末端）4度、16度、22度o1M NaCl（转化）转化子的鉴定PCR技术要点 引物的设计 PCR反应体系 PCR反应条件 PCR技术PCR技术的应用 基因的分离和克隆 基因修饰、改造 转基因植株检测引物设计的原则（一）引物设计的原则（一）引物长度：引物长度： 15-30bp，常用为，常用为20mer左右左右n引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 mer，否则最适延伸温度会，否则最适延伸温度会超过超过TaqDNA聚合酶的最适温
21、度（聚合酶的最适温度（72），不能保证），不能保证PCR扩增产物的特异性。扩增产物的特异性。引物扩增跨度：以引物扩增跨度：以500bp为宜为宜n特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb的片段。的片段。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜为宜nG+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带过多易出现非特异条带nATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。的成串排列。引物设计的原则（二）引物设计的原则（二）避免引物内部出现二级结构避免引物内部出现二级结构n避免两条引物间互补，避免两条引物
22、间互补， 特别是特别是 3端的互补，否则会形端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带（热启动（热启动PCR）。引物引物 3端的碱基要求严格配对端的碱基要求严格配对n特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致配对而导致PCR失败。失败。引物中有或能加上合适的酶切位点引物中有或能加上合适的酶切位点n被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。析或分子克隆很有好处。引物设计的原则（三）引物设计的原则（三）引物的特异性：引物
23、的特异性：n引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：引物量：n每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 1umol或或10 100 pmol，以最低，以最低引物量产生所需要的结果为好。引物量产生所需要的结果为好。n引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。引物之间形成二聚体的机会。 对于比较复杂的实验，多设计几对引物配对于比较复杂的实验，多设计几对引物配合使用是很有效的（巢式合使用是很有效的（巢式PCR）。）。 Mg2+浓度浓度oMg2+对对PCR扩增的特异性和产量
24、有显著的影响。扩增的特异性和产量有显著的影响。o在一般的在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L 时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mmol/L为宜。为宜。oMg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产聚合酶的活性，使反应产物减少。物减少。 退火(复性)温度与时间：o退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素特异性的较重要因素o变性后温度快速冷却至变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生，可使引物和模板发生结合。由于模板结
25、合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。o复性温度复性温度=Tm值值-(510)n在在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异反应的特异性。性。（梯度降落（梯度降落PCR ）o复性时间一般为复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全，足以使引物与模板之间完全结合。结合。延伸时间：根据所用根据所用Taq酶种类和待扩增片段长度而定酶种
26、类和待扩增片段长度而定n使用使用有校读有校读功能的酶应延长延伸时间；功能的酶应延长延伸时间；n1Kb以内的以内的DNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min就足够了；就足够了； n34kb的靶序列需的靶序列需34min；n扩增扩增10Kb需延伸至需延伸至15min。o延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增o对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些基因克隆的一种方法RACE基于同源序列的克隆技术基于同源序列的克隆技术n已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨已克隆的一些基因（转录因子、蛋白激酶类的基因）在氨基酸水平上表现出一定程度的相
27、似性，在一些区段高度保基酸水平上表现出一定程度的相似性，在一些区段高度保守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理守，这些保守的结构区不仅有助于基因的分离及作用机理的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是的理解，而且也为基因克隆提供了一条快捷途径。这就是基于同源序列的候选基因法基于同源序列的候选基因法（homology-based candidate gene method）。）。n其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对其基本思路是：根据已知克隆的保守区设计简并引物，对基因组基因组DNA进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这些进行扩增，得到该基因的类似序列，检测这
28、些序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或序列与性状共分离情况。如果这些序列与性状紧密相关或带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基带有该基因功能结构区序列，则可用于其作为探针筛选基因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆因组文库，获得候选基因；或者通过扩增末端的方法克隆全长基因。全长基因。Sequence analysis of gene GsCBRLK By Ph.D. Liang YangSequence analysis of gene GsCBRLK By Ph.D. Liang YangThe hydrophilic residues were ill
29、ustrated as circles, hydrophobic residues as diamonds, potentially negatively charged as triangles, and potentially positively charged as pentagons. Hydrophobicity is color coded with green (the most hydrophobic residue) and yellow (zero hydrophobicity) with the amount of green decreasing proportion
30、ally to the hydrophobicity. Hydrophilic residues are coded red with pure red being the most hydrophilic (uncharged) residue, and the amount of red decreases proportionally to the hydrophilicity. The potentially charged residues are coded light blueFig. 2 A helical wheel projection prediction of CaMB
31、D in protein GsCBRLKn目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方目前，这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大面已经应用很广泛，已在大豆，马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。片段。n在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面，Urao等利用这一方等利用这一方法，根据蛋白激酶保守功能结构区和法，根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的特有的E-F手手性结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码性
32、结构区序列设计简并引物，从拟南芥中分离了编码CDPK的的2个个cDNA克隆克隆(cATCDPK1和和cATCDPK 2)，并通，并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。行性。 基因克隆的一种方法RACEnRACE的基本概念n不同厂家RACE试剂盒的介绍nRACE技术的关键环节n存在的问题及解决办法RACE的基本概念ncDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基
33、于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。n3RACE 和5RACE n介绍一下不同公司生产的RACE试剂盒的特点3RACE原理示意图原理示意图mRNA(A)n5GSP35 3CCCCGSP2 GI IG5AAPAUAPnested GSP 3 CCCC5 GI IG533AUAPnested GSP535(A)n5RACE技术的关键环节nRACE 技术的关键环节有2个：1.3个连续的酶促反应 (逆转录、TdT加尾、PCR扩增)2.RACE的引物 即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背
34、景。存在的问题及解决办法n反转录反转录1.RNA的质量的质量 有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。 2.反转录提前终止反转录提前终止 模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5末端。 提供一种改进的反转录方法1.在RNase-free的0.2 mL Eppendorf 管中加入以下成分：2.Oligo(dT)(0.5g) 1L Total
35、 RNA(45g) 3L DEPC-H2O To 25 L 混匀，70保温10min；50保温5min；稍微离心一下。3.在混合物中，依次加入以下成份：4.10X SS（ SS ）Buffer 5.0L 10mM dNTP mix 1.0L 0.1M DTT 2.0L RNase Inhibitor(40U/L) 1.0L DEPC-H2O To 24 L 轻轻混合，在50保温5min后，在50下将3号管中的混合成分移入2号管中。5.每个反应加入1L SuperScriptTM （SS ），轻轻混匀，50反应50min。6.70放置15min以终止反应。7.-20保存。nTdT加尾反应及其替代
36、反应加尾反应及其替代反应n首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，从而导致第二链cDNA合成效率的降低。n其次，TdT反应难以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全长cDNA，这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。nTdT加尾反应及其替代反应加尾反应及其替代反应n第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。n我们所使用Invitr
37、ogen公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。nRACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5末端。 nRACE引物的设计引物的设计 在实验过程中总结如下经验：1.引物不能设计在保守区简并引物区。2.各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。3.尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物
38、，便于鉴定的正确性。nPCR扩增及产物的克隆扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题n一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；n另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。 增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法：1.热启动PCR(hotstart PCR)，长距离PCR(long distance PCR)和降落PCR(touch down PCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。2.利用抑制PCR(suppression PCR)技术改进RACE程序，可大大减少非特异性的线性化扩增。3.单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照
39、，并减少引物的浓度。M 1 2 3 M 4 5 M 6 7 8 9M：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：GSP 11；4：5GSP22+AUAP；5,7,9：AUAP；6,8：5GSP44+ AUAP图图 多轮多轮PCR扩增的电泳结果扩增的电泳结果Fig. Results of PCR amplifiedAB M 1 2M 3 4 M 5 6 CA：The first PCR；BC：Nest PCRM：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：5GSP332+AUAP；4,6：AUAP；5：5GSP333+AUAP图图 多轮多轮PCR扩增的电泳结果扩增的电泳结果Fig. Results of PCR amplified M 1 2 3 4 5 6 M M：2000marker；1：3GSP441+AUAP；3：3552+AUAP；5：3IPCR2+AUAP2,4,6：AUAP；图图 多轮多轮PCR扩增的电泳结果扩增的电泳结果Fig. Results of PCR amplified图图 5RACE、3RACE克隆的片段与克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果序列拼接的结果Fig. The contig result of 5RACE 、3RACE and GsAP2 by software
