1、基因工程基因工程 -重组重组DNA技术技术2010-04-19概概 念念v基因是基因是DNADNA序列上的一个特定功能的片段，不同基序列上的一个特定功能的片段，不同基因的遗传信息有各自片段的碱基排列顺序所决定。因的遗传信息有各自片段的碱基排列顺序所决定。v基因通过转录出的信息是核糖核酸指导基因通过转录出的信息是核糖核酸指导mRNAmRNA合成合成特定的蛋白质，使基因的以表达，完成特定的生特定的蛋白质，使基因的以表达，完成特定的生命活动。命活动。分子克隆分子克隆 ( (基因克隆基因克隆) )细胞克隆细胞克隆动物克隆动物克隆克隆（克隆（cloneclone）：来自同一始祖的相同副本或拷贝：来自同一
2、始祖的相同副本或拷贝的集合。的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化（克隆化（cloningcloning）, ,即无即无性繁殖。性繁殖。重组重组DNA的定义的定义应用应用酶学酶学的方法，在体外将各种来源的的方法，在体外将各种来源的DNA与载体与载体DNA结合成具有自我复制能结合成具有自我复制能力的力的DNA分子，继而通过转化或转染宿分子，继而通过转化或转染宿主细胞主细胞, 筛选出含有目的基因的转化子细筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。分子。 又称又称基因克隆基因克隆或或重组重组DNA。重组重组DNA技术技
3、术1分离或合成目的基因2带有目的基因的DNA片段与载体DNA体外重组 重组DNA。 3将重组体DNA分子导入宿主（受体）细胞。 4重组体克隆的筛选和鉴定、扩增与表达。DNADNA克隆的基本过程：分离目的基因分离目的基因：对目的基因和载体适当切割对目的基因和载体适当切割：目的基因与载体连接目的基因与载体连接4. 转转：重组重组DNA转入受体菌转入受体菌：筛选出含有重组体的受菌体筛选出含有重组体的受菌体目的基因目的基因研究某个基因，或者要克隆某个基因研究某个基因，或者要克隆某个基因用于生产大量用于生产大量DNADNA和蛋白质分子和蛋白质分子, ,首先都要首先都要把它从庞大的基因组中分离出来。把它从
4、庞大的基因组中分离出来。 你所感兴趣和想研究的基因，称为你所感兴趣和想研究的基因，称为目的目的基因基因。分分基因组基因组DNADNA文库文库经反转录合成的、经反转录合成的、与与RNA互补的互补的单链单链DNA目的基因目的基因 cDNA：complementary DNA 经反转录合成的、与经反转录合成的、与RNA互补的单链互补的单链DNA。 基因组基因组DNA： 代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。序列。PCR 可以把可以把 数数量放大量放大染色体染色体PCR 法法, 多聚酶链式反应多聚酶链式反应Polymerase chain reacti
5、on, PCR 1985年，年，Mullis等人建立等人建立 体外扩增体外扩增DNA片断片断 把目的基因的寻找和把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里扩增，放在一个步骤里完成完成PCR的条件的条件-5要素要素 模板模板 引物引物 dNTP DNA聚合酶聚合酶 Mg2+模板：双链模板：双链DNA DNA ；原材料：核原材料：核苷酸；苷酸；辅助条件：辅助条件：解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶，聚合酶，DNA DNA 连接酶；连接酶；RNARNA引物引物 PCR PCR 的三个步骤为一次循环，约需的三个步骤为一次循环，约需5 510 10 分钟。每经一次循环，所找到的分钟。每经一次循环，所找到的目
6、的基因扩充一倍。经过目的基因扩充一倍。经过 30 30 次循环，次循环，即可扩增即可扩增 10109 9 倍，总共只需几个小时。倍，总共只需几个小时。1. 1. 变性变性：将反应系统加热至：将反应系统加热至95 95 ，使模板，使模板DNADNA完全变性成为单链；完全变性成为单链；2. 2. 退火退火：将温度下降至：将温度下降至5050左右，使引物与模左右，使引物与模板板DNADNA退火结合；退火结合；3. 3. 延伸延伸：将温度升至：将温度升至72 72 ，DNADNA聚合酶以聚合酶以dNTPdNTP为底物催化为底物催化DNADNA的合成反应。的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经上述三个步
7、骤为一个循环，经25253030次循次循 环后，可将模板环后，可将模板DNADNA扩增达百万倍。扩增达百万倍。 PCR PCR 的三个步骤为一次循环，约需的三个步骤为一次循环，约需5 510 10 分钟。每经一次循环，所找到的分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过目的基因扩充一倍。经过 30 30 次循环，次循环，即可扩增即可扩增 10109 9 倍，总共只需几个小时。倍，总共只需几个小时。P C RP C R操作流程操作流程9090 0 0 C C变性变性50 50 0 0 C C退火退火70 70 0 0 C C延伸延伸 能携带目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完能携带
8、目的基因，实现无性繁殖所采用的可独立复制的完整整DNADNA分子。又称分子。又称克隆载体克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的。其中为表达出蛋白质设计的载体又称载体又称表达载体表达载体。 常用的载体常用的载体：质粒（质粒（plasmidplasmid）、噬菌体）、噬菌体DNADNA（phagephage）、病毒）、病毒DNADNA（virusvirus），）， 这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。点等。 供插入目的基因并将其导入宿
9、主细胞内供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具表达或复制的运载工具l1 1. .自主稳定复制自主稳定复制l2.2.多克隆位点多克隆位点l3.3.遗传标记遗传标记l4.4.插入容量大插入容量大l5.5.分子量小，拷贝多分子量小，拷贝多l6.6.安全安全l按来源：质粒、噬菌体、按来源：质粒、噬菌体、病毒病毒l按产物：克隆载体、表按产物：克隆载体、表达载体达载体l按宿主细胞：原核细胞按宿主细胞：原核细胞载体、真核细胞载体载体、真核细胞载体 最早使用的质粒最早使用的质粒DNA是人工构建的是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为，该质粒分子大小为4.3kb，带，带有抗四环素和抗氨苄青霉
10、素基因，含有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限等单一的限制酶切点。制酶切点。 polylinker 3病毒：病毒： 常用的为常用的为SV40，通过感染方，通过感染方式将其式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。殖。目前应用相对较少。 切切工具酶工具酶 工具酶工具酶 功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶 催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基形成二酯键羟基形成二酯键DNA聚合酶聚合酶I a.合成合成cDNA的第二条链的第二条链b.缺口平移
11、缺口平移c.测序测序d.补平补平反转录酶反转录酶 合成合成cDNA多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化末端转移酶末端转移酶 同聚物加尾同聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 主要来源于原核生物，具有主要来源于原核生物，具有识别识别自身自身DNA或异或异源源DNA的功能，通过的功能，通过切割切割破坏或破坏或限制限制异源异源DNA分子侵入宿主细胞来保护自身。分子侵入宿主细胞来保护自身。 限制酶目前已经发现限制酶目前已经发现400400多种，所识别的顺序多种，所识别的顺序往往往往具有双链对称的回
12、文结构具有双链对称的回文结构4-84-8个碱基对，个碱基对，称为限制性位点或切点称为限制性位点或切点 识别特性：识别特性：具有双链对称的回文结构具有双链对称的回文结构 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5 即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，即将带有切口的载体与所获得的目的基因连接起来，得到重新组合后的得到重新组合后的DNADNA分子分子（一）粘性末端连接法：（一）粘性末端连接法： 当载体当载体DNADNA和目的基因均用同一种限和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合
13、在一起，性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入加入DNADNA连接酶，即可封闭其缺口，得到连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。重组体。 较少的情况下，对产生的平端较少的情况下，对产生的平端也可直接进行连接。也可直接进行连接。 （二）人工接尾法：（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法。即同聚物加尾连接法。 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同的粘性末端时，可采进行切断，无法得到相同的粘性末端时，可采用此方法。用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，此法首
14、先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的核苷酸添加于载体或目的基因的3-3-端，如载端，如载体上添加一段体上添加一段polyApolyA，则可在目的基因上添加，则可在目的基因上添加一段一段polyTpolyT，故二者即可通过碱基互补进行粘，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由合，再由DNADNA连接酶连接。连接酶连接。 （三）人工接头连接法：（三）人工接头连接法： 将人工连接器（即一段含有多种限将人工连接器（即一段含有多种限制酶切点的制酶切点的DNADNA片段）连接到载体和目的片段）连接到载体和
15、目的基因上，即有可能使用同一种限制酶对基因上，即有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进行切断，得到可以互载体和目的基因进行切断，得到可以互补的粘性末端。补的粘性末端。 （transformationtransformation）转转 重组重组DNA需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。需导入宿主细胞才能进行增殖或表达。由外来由外来DNA引起生物体遗引起生物体遗传性状改变的过程称为传性状改变的过程称为转转化化(transformation)。将质粒将质粒DNADNA或以其为载体构或以其为载体构建的重组子导入细菌的过建的重组子导入细菌的过程。程。 *转染转染( (transfectiontransf
16、ection) )l 转染是转化的一种特殊形式。转染是转化的一种特殊形式。 由由transformationtransformation（转化）和（转化）和 infectioninfection（感染）两词构成。（感染）两词构成。l 原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重组子导入受体细胞的过程。导入受体细胞的过程。l 通过通过感染方式感染方式将外来将外来DNADNA引入宿主细胞，并导致宿引入宿主细胞，并导致宿主细胞主细胞遗传性状改变遗传性状改变的过程称为的过程称为转染转染。l 将任何类型将任何类型DNADNA转移至动物细胞内的过程均可叫转转移至动物细胞
17、内的过程均可叫转染。染。转转重组体的转化重组体的转化1. 重组体导入大肠杆菌重组体导入大肠杆菌（1）氯化钙法）氯化钙法（2）电击法）电击法（3）体外包装法）体外包装法2. 重组体导入哺乳动物细胞重组体导入哺乳动物细胞（1）磷酸钙共沉淀法）磷酸钙共沉淀法（2）脂质体介导法）脂质体介导法（3）病毒感染法）病毒感染法（4）显微注射法）显微注射法50-100mmol/LCaCl2 用用噬菌体作为载体的噬菌体作为载体的重组体，则需要用外壳重组体，则需要用外壳蛋白进行包装，使之成蛋白进行包装，使之成为具有感染能力的噬菌为具有感染能力的噬菌体，再通过体，再通过转染转染(transfection)方式将重组方
18、式将重组噬菌体噬菌体DNA导入大肠杆导入大肠杆菌等宿主细胞。菌等宿主细胞。 重组重组DNA导入宿主细导入宿主细胞后，即可在适当的培胞后，即可在适当的培养条件下进行培养以扩养条件下进行培养以扩增宿主细胞。增宿主细胞。筛筛 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。重组体的宿主细胞进行筛选并作鉴定。： 对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插插入灭活法入灭活法进行筛选。如进行筛选。如pBR322pBR322中带有抗氨苄青中带有抗氨苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入
19、抗四霉素和抗四环素基因，当将目的基因插入抗四环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨环素基因后，就可引起该基因失活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青苄青霉素耐药，而对四环素敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培霉素的培养基上能够生长，而在含四环素的培养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。养基上不能生长的细菌即为带重组体的细菌。 pBR322AmpTet 当宿主细胞存在某种基因及其表达产当宿主细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。物的缺陷时，可采用此方法筛选重组体。即在载体即在载体DNADNA分子中插入相应的缺陷基因，分子中插入相应的缺
20、陷基因，如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产如宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，则说明该细胞中带有重组体。物，则说明该细胞中带有重组体。 经过粗筛后的含重组体的细菌，还需经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一进行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细菌进行扩增后分别提取其细菌进行扩增后分别提取其DNADNA，用重组，用重组时所用的同一限制酶进行酶切，再将其时所用的同一限制酶进行酶切，再将其与不含目的基因的载体一起进行电泳比与不含目的基因的载体一起进行电泳比较分析，如发现出现目的基因片段的电较分析，如发现出现目的基因片段的电泳带即证明重组体中带有目的基因。泳带即证明重组体中
21、带有目的基因。 原原 位位 杂杂 交交表表实验仪器离心设备离心设备台式高速冷冻离心机台式高速冷冻离心机恒温培养箱恒温培养箱培养皿培养皿恒温水浴锅恒温水浴锅材料及试剂E.coliE.coli DH5 DH5 pUC19质粒质粒DNAEcoRI酶酶3mol/L Kac (pH5.2)Xgal (20mg/ml)IPTG (200mg/ml)材料及试剂 1. T4DNA连接酶连接酶2 10T4DNA连接酶缓冲液连接酶缓冲液: 400mmol/L Tris-Cl pH7.5 100mmol/L MgCl2 100mmol/L DTT, 500 g/ml BSA 5-10mmol/L ATP试剂3 限制
22、性内切酶（限制性内切酶（PstI）4 10限制性内切酶缓冲液限制性内切酶缓冲液 500mmol/L Tris-Cl 100mmol/L MgCl2 1000mmol/L NaCl 1mg/L BSA 1mg/L BSA5. 5. 灭菌去离子水灭菌去离子水 实验步骤1 混合以下溶液于一个无菌离心管中混合以下溶液于一个无菌离心管中xl pUC19 质粒质粒 (0.1-4g)2l 10酶切缓冲液酶切缓冲液15U 限制性内切酶（限制性内切酶（EcoRI）yl 去离子水去离子水终体积为终体积为 20l2 在推荐温度下育温在推荐温度下育温1小时（一般为小时（一般为37）加入加入5l5l电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。电泳缓冲液终止反应，电泳检测结果。 酶切酶切实验步骤1混合以下试剂混合以下试剂 DNA 7.7lpUC19 DNA 1 .0l10T4DNA连接酶缓冲液连接酶缓冲液 1.0lT4DNA连接酶连接酶(10u/l) 0.3l混合液于混合液于1414培养培养1212小时小时 连接连接实验结果
