1、模块2 微生物的纯培养技术2 微生物的分离纯化n在自然界中，微生物呈混合状态存在，要想获得所需菌种，则必须把它们从中分离出来并加以纯化培养。n分离分离：将特定的微生物个体从群体中或从混杂的微生物群体中分离出来的技术叫作分离。n纯化纯化：在特定环境中只让 1种来自同一祖先的微生物群体生存的技术叫作纯化。概念n分离技术主要是稀释和选择培养。n稀释：稀释：是在液体中或在固体表面上高度稀释微生物群体，使单位体积或单位面积仅存留一个单细胞，并使此单细胞增殖为一个新的群体。最常用的为平板划线平板划线法和稀释涂布法法和稀释涂布法。n选择培养：选择培养：如果所要分离的微生物在混杂的微生物群体中数量极少或者增殖
2、过慢而难以稀释分离时，需要结合使用选择培养法，即选用仅适合于所要分离的微生物生长繁殖的特殊培养条件特殊培养条件来培养混杂菌体，改变群体中各类微生物的比例，以达到分离的目的。概念实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板计算（二）接种纯化大肠杆菌实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板接种方法有：计算（二）接种纯化大肠杆菌实验操作（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基称量溶化灭菌倒平板接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法计算（二）接种纯化大肠杆菌稀释平板分离法稀释平板分离法： 将待分离样品做系列稀释，使样品中的微生物细胞充将待分离样品做系列稀释，使样品中的微生物细胞
3、充分分散。取合适稀释度的样品与培养基混合，培养分分散。取合适稀释度的样品与培养基混合，培养出现菌落。如稀释度适合在培养基平板上即可出现出现菌落。如稀释度适合在培养基平板上即可出现的单个菌落。的单个菌落。平板划线分离法平板划线分离法： 用无菌接种环挑取待分离材料，在平板培养基表面划用无菌接种环挑取待分离材料，在平板培养基表面划线稀释而获得单菌落的方法。线稀释而获得单菌落的方法。实验原理细菌的接种工具细菌的接种工具接种针接种针接种环接种环涂布器涂布器u1.1.平板划线接种法：平板划线接种法：目的：使混合的细菌呈目的：使混合的细菌呈单个分散单个分散生长，形成生长，形成单个菌落，以获得单个菌落，以获得
4、纯菌纯菌。方法方法 分区划线法分区划线法：适用于含菌量较多的标本：适用于含菌量较多的标本 连续划线法连续划线法：适用于含菌量较少的标本：适用于含菌量较少的标本菌落菌落当单个或少数细菌在固当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌的子细胞群体，叫做菌落。落。分区划线生长现象分区划线生长现象连续划线生长现象连续划线生长现象1.平板划线法讨论每次使用接种环之前都要进行灼烧，每次使用接种环之前都要进行灼烧，为什么？为什么？讨论1.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微
5、生物污染培养物；每次划线前灼烧每次划线前灼烧接种环接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。讨论2. 以免接种环温度太高，杀死菌种。讨论2. 以免接种环温度太高，杀死菌种。3. 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布法2.稀释涂布法（1）系列稀释操作：2.稀释涂布法（1）系列稀释操作：依次依次1mL，注意更换移液管，注意更换移液管充分混匀充分混匀（2）涂布平板操作系列稀释系列稀释1个个225mL无菌水无菌水 2个个9ml无菌水无菌水得得10-125g或或25mL样品样品10-2, 10-3的菌悬液的菌悬液1ml2.稀释稀释涂布法2.稀释稀释涂布法按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞恒温恒温37培养培养平板菌落计数平板菌落计数讨论
