1、实验十一实验十一 植物组织总植物组织总DNADNA的提取的提取 掌握用掌握用CTAB法提取植物总法提取植物总DNA的方法和基本原理。的方法和基本原理。 学习利用紫外分光光度法测定学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液的浓度。溶液的浓度。一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理 通常采用通常采用机械研磨机械研磨的方法破碎植物的组织和细的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化尤其是氧化酶类酶类)对对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入液中需加入抗氧化剂或强还原剂抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙
2、醇如巯基乙醇)以降以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂，能溶解细胞等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以得以游离出来。游离出来。 再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变蛋白质变性，性，并使抽提液分相，因核酸并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋经离心后即可从抽提液
3、中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入白质。上清液中加入异丙醇或乙醇使异丙醇或乙醇使DNA沉淀沉淀，沉，沉淀淀DNA溶于双蒸水或溶于双蒸水或TE溶液中，即得植物总溶液中，即得植物总DNA溶液。之后可加入溶液。之后可加入RNA酶降解其中的酶降解其中的RNA，再用氯，再用氯仿除去仿除去RNA酶，得到较纯的酶，得到较纯的DNA制剂。制剂。 DNA的吸收光谱峰在的吸收光谱峰在260 nm处，据计算，测处，据计算，测定此波长下定此波长下DNA溶液的溶液的OD值，当值，当OD260=1时，双时，双链链DNA含量约为含量约为50 g/ml，据此可用紫外分光光，据此可用紫外分光光度计测定溶液中度计测定溶液
4、中DNA含量。含量。 由于由于蛋白质蛋白质的吸收峰在的吸收峰在280 nm处，在测定处，在测定DNA含量时，还常计算含量时，还常计算OD260/OD280之值，如该值之值，如该值为为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。水稻品种的幼苗叶片水稻品种的幼苗叶片三、实验材料三、实验材料四、实验器具、药品试剂四、实验器具、药品试剂 水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台水浴锅，研钵，微量移液器，枪头，离心管，台式离心机，液氮，恒温箱，标签纸，紫外分光光度式离心机，液氮，恒
5、温箱，标签纸，紫外分光光度计，磁力搅拌机，剪刀等。计，磁力搅拌机，剪刀等。 2% CTAB抽提缓冲溶液，异丙醇抽提缓冲溶液，异丙醇, 氯仿氯仿-异异戊醇等戊醇等 CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤异丙醇沉淀异丙醇沉淀DNA溶液溶液五、实验方法五、实验方法(1) 2%CTAB抽提缓冲液在抽提缓冲液在65水浴中预热。水浴中预热。(2)取少量叶片（约取少量叶片（约0.2 g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；）置于研钵中，用液氮磨至粉状；(3) 在液氮挥发将尽而植物组织尚未解冻时迅即加入在液氮挥发将尽
6、而植物组织尚未解冻时迅即加入700 l的的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；抽提缓冲液，轻轻搅动；(4) 将磨碎液分倒入将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二；占管的三分之二；(5) 置于置于65的水浴槽或恒温箱中，每隔的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动轻轻摇动，40 min后取出；后取出；1. DNA的提取的提取 （6）冷却）冷却2 min后，加入氯仿后，加入氯仿-异戊醇（异戊醇（24：1）至）至满管，剧烈振荡满管，剧烈振荡23 min，使两者，使两者混合均匀混合均匀；（7）放入离心机中）放入离心机中10 000 rpm
7、离心离心10 min，与此，与此同时，将同时，将600 l的异丙醇加入另一新的灭菌离心管的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中；中；（8） 用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙用移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使，使异丙醇与水层充分混合至能见到异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；絮状物；（9）10000 rpm离心离心1 min后，立即倒掉液体，注后，立即倒掉液体，注意勿将白色意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上；纸巾上；（10）60 sec后，直立离心管，加入
8、后，直立离心管，加入720 l的的75%乙醇及乙醇及80 l 5 M的醋酸钠，的醋酸钠，轻轻转动轻轻转动，用手指弹管，用手指弹管尖，使沉淀与管底的尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；块状物浮游于液体中；（11）放置）放置30 min，使，使DNA块状物的不纯物溶解；块状物的不纯物溶解；（12） 10000 rpm离心离心1 min后，倒掉液体，再加后，倒掉液体，再加入入800 l 75%的乙醇，将的乙醇，将DNA再洗再洗 30 min；（13）10000 rpm离心离心30 sec后，立即倒掉液体，后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离将离心管倒立于铺开的纸巾上
9、；数分钟后，直立离心管，干燥心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；（自然风干或用风筒吹干）；（14）加入）加入50 l 0.5 TE(含含RNase)缓冲液，使缓冲液，使DNA溶解，置于溶解，置于37恒温箱约恒温箱约15 h，使，使RNA消解；消解；（15）置于）置于-20保存、备用。保存、备用。称取样品，液氮研磨，加入预热的称取样品，液氮研磨，加入预热的(65 ) CTAB及及-巯基乙醇巯基乙醇 保温保温1h,期间不停的摇均期间不停的摇均吸取上清液吸取上清液,移至新的离心管中移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒混），轻缓颠倒混匀匀,100
10、00rpm,10min 取上清液，移至新的离心管中取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀颠倒混匀, 10000rpm,10min取上清液，加入取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干乙醇清洗两次，吹干用用TE溶解溶解DNA,然后低温保存然后低温保存（1）叶片磨得）叶片磨得越细越好越细越好。（2）移液器的使用。）移液器的使用。（3）由于植物细胞中含有大量的）由于植物细胞中含有大量的DNA酶酶，因此，除，因此，除在抽提液中加
11、入在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操抑制酶的活性外，第一步的操作应作应迅速迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使酶，使DNA降解。降解。六、注意事项六、注意事项七、作业七、作业(1)本实验所得的植物总本实验所得的植物总DNA制剂中含有哪些遗传制剂中含有哪些遗传物质？物质？(2) 在在DNA抽提过程中造成抽提过程中造成DNA分子断裂的主要因分子断裂的主要因素有哪些素有哪些?(3) 本实验中所用到下列试剂的作用各是什么本实验中所用到下列试剂的作用各是什么? CTAB, 氯仿氯仿, 异丙醇异丙醇, 75%乙醇乙醇, EDTA，巯基乙，巯基乙醇醇此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！
