1、2020/11/241第十章第十章 蛋白质的研究方法与原理蛋白质的研究方法与原理2020/11/242第一节第一节 概概 述述精品资料2020/11/244 你怎么称呼老师？ 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你是否会认为老师的教学方法需要改进？ 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ 教师的教鞭 “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我笨，没有学问无颜见爹娘 ” “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早”2020/11/245 蛋白质的分离纯化包括以下过程：蛋白质的分离纯化包括以下过程：1.破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；破碎生物组织，并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来；
2、2.将有关的蛋白质分级沉淀下来将有关的蛋白质分级沉淀下来; （盐析法或有机溶剂法）（盐析法或有机溶剂法）3.应用应用层析法层析法或或电泳法电泳法使它们各自分开使它们各自分开； 4.蛋白质结晶；蛋白质结晶；5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。蛋白质纯度鉴定和含量测定。直接从生物组织中提纯蛋白直接从生物组织中提纯蛋白2020/11/246 制备过程中注意事项制备过程中注意事项： 要求自始至终保持在要求自始至终保持在天然状态天然状态 避免一切过激因素避免一切过激因素-如过酸或过碱，高温，如过酸或过碱，高温， 重金属等的影响。重金属等的影响。2. 2. 通常都在低温条件下操作。通常都在低温条件下操作。3.
3、3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。水平。2020/11/247第二节第二节 蛋白质的分离与纯化技术蛋白质的分离与纯化技术2020/11/248一、蛋白质沉淀与结晶一、蛋白质沉淀与结晶 2020/11/249 （一）（一）盐析法盐析法 概念：将概念：将中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和中性盐加入蛋白质溶液，破坏水化膜和电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析电荷而使蛋白质沉淀，叫盐析。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及所需的盐浓度及PH不同，加入不同浓度的中性盐不同，加入不同浓度的中性盐可可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。使各种蛋白质依次分别沉淀出来
4、。 优点：操作简便优点：操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用，对易变性的蛋白质有一定的保护作用， 适用范围十分广泛。适用范围十分广泛。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低缺点：分辨能力差，纯化倍数低2020/11/2410（1 1）盐的种类）盐的种类对同一种对同一种PrPr而言，而言，价数愈高价数愈高的盐离子，盐析能力的盐离子，盐析能力也愈强也愈强: : PO3-4SO42-C2O42-（CHOHCOO-）2 ACCLNO3-Br -I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+常用的中性盐常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。有如硫酸盐、磷酸盐等。2020/11/2411硫酸铵硫酸铵（常用盐
5、析剂）（常用盐析剂） 优点：盐析能力较强优点：盐析能力较强 具有较高的溶解度具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数较低的溶解度温度系数 价格低廉价格低廉 不产生副作用。不产生副作用。 缺点：缓冲能力较差缺点：缓冲能力较差 PHPH难控制难控制2020/11/2412（2 2）PHPH和温度和温度S S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于除取决于PrPr的种类，还受的种类，还受PHPH及温度影响及温度影响: : PH=PI PH=PI时，时，S S。的数值极小。的数值极小 S S。随温度增加而减低。随温度增加而减低。盐析过程中，若增高温度，有助于盐析过程
6、中，若增高温度，有助于PrPr的析出。的析出。2020/11/2413（3 3）蛋白质浓度）蛋白质浓度 PrPr较高较高，在较低无机盐浓度时，在较低无机盐浓度时, ,蛋白质便开蛋白质便开 始析出，盐析界限比较宽。始析出，盐析界限比较宽。 PrPr较低较低，需要无机盐的浓度也高，即盐析，需要无机盐的浓度也高，即盐析 界限变窄。界限变窄。2020/11/24141.1.基本原理基本原理（1）在）在PI附近，附近，Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂，由于有机溶剂，由于有机溶剂有机溶剂可使溶液可使溶液电离电离常数常数减小，增强了减小，增强了 中性离子间静
7、电引力，从而使分集合而沉淀出来。中性离子间静电引力，从而使分集合而沉淀出来。（2）有机溶剂有机溶剂本身的水合作用会破坏本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层，也表面的水合层，也 促使促使Pr变得不稳定而聚集析出变得不稳定而聚集析出.常用的有机溶剂：乙醇和丙酮常用的有机溶剂：乙醇和丙酮 （二）有机溶剂沉淀法（二）有机溶剂沉淀法 分辨力比盐析方法高，提纯效果好分辨力比盐析方法高，提纯效果好 2020/11/2415（三）选择性沉淀法（三）选择性沉淀法 选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标蛋白质的分离方法。例如，将提取液加热至一定温度蛋白质的分离
8、方法。例如，将提取液加热至一定温度并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。并维持一段时间，是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等。应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯应用选择星辰殿，徐实现对系统中需除去的及欲提纯的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。2020/11/2416（四）蛋白质结晶（四）蛋白质结晶 蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。规则排列状态的固体，常用语分析研究其结构。蛋白质结晶是一个有序化过程，当蛋白质溶液达到过蛋白质结晶是一个有序化过程
9、，当蛋白质溶液达到过饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子饱和状态，能够形成一定大小的晶核，溶液中的分子失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上，失去自由运动的能量，不断地结合到形成的晶核上，长成适合于长成适合于X X线衍射分析的晶体。线衍射分析的晶体。2020/11/2417二、离心技术分离蛋白质二、离心技术分离蛋白质 离心技术是利用物体离心技术是利用物体告诉旋转时产生强大的离告诉旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩从而使某些颗粒达到浓缩或与其它颗粒分离之目的。或与其它颗粒分离之目的。
10、2020/11/2418三、层析技术分离纯化蛋白质三、层析技术分离纯化蛋白质最基本的特征：最基本的特征： 固定相固定相 流动相流动相层析技术（层析技术（chromatography）又称色谱技术，是利又称色谱技术，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 各种物质得以分离的最基本原因：各种物质得以分离的最基本原因：就在于它们在这就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时，两相作相对运动时， 这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分这些物质在两相间进行多次的分配，即使它们的分 配系数只有微小的差异
11、，通过这个过程也能得到最配系数只有微小的差异，通过这个过程也能得到最 大的分离效果。大的分离效果。2020/11/2419 气相层析气相层析 按按两相状态两相状态来分来分 液相层析液相层析 吸附层析吸附层析 分配层析分配层析 离子交换层析离子交换层析 按按层析机理层析机理来分来分 凝胶排阻层析凝胶排阻层析 亲和层析亲和层析 柱层析柱层析 按按操作方式操作方式来分来分 薄层层析薄层层析 纸层析纸层析层析技术的种类层析技术的种类2020/11/2420 （一）凝胶过滤层析（一）凝胶过滤层析又称又称分子筛或凝胶过滤分子筛或凝胶过滤（gel filtrationgel filtration）原理：载体
12、为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分原理：载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时，直径大于孔径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流径的分子将不能进入凝胶内部，便直接沿胶粒间隙流出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕出（全排出）。较小的分子进入能容纳它的孔穴，绕道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分道而行，在柱内保留时间就比较长。这样，较大的分子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而子被先洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。达到相互分离的目的。2020/11/2
13、422 离子交换层析法离子交换层析法*原理：原理：阴阴（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相）（阳）离子交换树脂颗粒（作为固定相） 填充在层析柱内，由于填充在层析柱内，由于阴阴（阳）离子交换树（阳）离子交换树 脂颗粒上带脂颗粒上带正正（负）电荷，能吸引溶液中的（负）电荷，能吸引溶液中的 阴阴（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的（阳）离子。然后再用含阴（阳）离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白下来，增加阴离子浓度，含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。202
14、0/11/2424 亲和层析法亲和层析法 原理原理：利用生物高分子具有能和某些相对应的专一利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。分子可逆结合的特性。 如，如，酶的活性部位能和底物酶的活性部位能和底物 抑制剂抑制剂 辅助因子专辅助因子专 一性地结合一性地结合, ,改变条件又能使这种结合解除改变条件又能使这种结合解除. . 酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之酶的变构中心与变构因子（或称效应物）之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结间、抗体与抗原之间、激素与受体之间，结 合蛋白与结合物之间合蛋白与结合物之间 。 这些被作用的对象物质称之为这些被作用的对象物质称之为配基（
15、配基（ligand) ligand) 。2020/11/2425 高效液相层析法高效液相层析法（High Performance Liquid Chromatography ，HPLCHPLC） 又称又称“高压液相色谱高压液相色谱，是，是色谱法色谱法的一个重要分支，以的一个重要分支，以液体液体为为流动相流动相，采用高压输液系统，将具有不同，采用高压输液系统，将具有不同极性极性的单一的单一溶剂溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的泵入装有固定相的色谱柱色谱柱，在柱内各成分被分离后，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析
16、。进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 2020/11/2426四、电泳技术分离蛋白质四、电泳技术分离蛋白质 电泳（电泳（electrophoresis）是指带电粒子在电场是指带电粒子在电场中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。2020/11/2427 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDSSDS ( (十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠) )是阴离子型去污剂是阴离子型去污剂(Sodium dodecyl sulfate, SDS)(Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q Q u = u = （迁移率）（
17、迁移率）6r 6r u u 与与 Q Q、 r r有关有关 若蛋白质分子带有足够的电荷，在若蛋白质分子带有足够的电荷，在SDS-PAGESDS-PAGE中进中进行电泳，由于分子筛效应，行电泳，由于分子筛效应， u u 仅取决于分子的大小。仅取决于分子的大小。因此因此 SDSSDS一凝胶电泳可以按一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同蛋白质分子大小的不同将其将其分开。分开。 这时，若以分子量的对数（这时，若以分子量的对数（logMlogM）对相对于染料前沿）对相对于染料前沿的迁移率（的迁移率（RfRf）作图，呈现线性关系。）作图，呈现线性关系。 2020/11/2429 这种关系，对一种胶浓度时，
18、只适用于一定的这种关系，对一种胶浓度时，只适用于一定的 分子量范围：分子量范围： 5 5胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量6 6200200万的区间；万的区间； 1010胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.61.67 7万的区间；万的区间； 1515胶浓度时，适用于分子量胶浓度时，适用于分子量1.21.24.54.5万的区间。万的区间。 2020/11/2430聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱2020/11/2431 等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF） 是一种根据样品的等电点不同而使它们在是一种根据样品的等电点不同而
19、使它们在pHpH梯度梯度中相互中相互分离的一种电泳技术。分离的一种电泳技术。 利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个丙烯酰胺凝胶）内制造一个pHpH梯度。梯度。 pH梯度制作利用的两性电解质（ampholyte，商品名为ampholine），是脂肪族多胺和多羧类的同系物，他们具有相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下，自然形成pH梯度。凝胶可用：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等2020/11/2432 PrPr分子有一定的分子有一定的PIPI，它处在一个由，它处在一个由阳极到阴极阳极到阴极梯梯度逐渐增
20、加的介质中，并通过以直流电时，它便度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦聚焦”在与其在与其PIPI相同的相同的pHpH位置上。位置上。PIPI不同的蛋不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。2020/11/2433优点：优点：1.1.有很高的分辨率；有很高的分辨率；2.2.可以区分等电点只有可以区分等电点只有 0.01 pH0.01 pH单位差异的蛋白质；单位差异的蛋白质；3.3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量；4.4.对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。2
21、020/11/2434双向电泳双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） 第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-PIPI第二向采用第二向采用SDSSDS一凝胶电泳一凝胶电泳-分子量分子量由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率同的特一性来进行分离，因此具有非常高的分辨率可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。可同时分析几千上万个蛋白，分辨率高，分离度好。是蛋白质组学研究的核心技术。是蛋白质组学研究的核心技术。2020/11/2
22、435双向双向PAGE2020/11/2436具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被检测到：检测到：等电点（等电点（pl)pl)值很大或很小的，比如大于值很大或很小的，比如大于8 8和小于和小于4 4的那些蛋白质；的那些蛋白质；分子质量很大的蛋白质，比如大于分子质量很大的蛋白质，比如大于l00kDal00kDa的蛋白的蛋白质就比实际的少了，而大于质就比实际的少了，而大于150kDa150kDa的蛋白质就几的蛋白质就几乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些乎完全探测不到了（尽管在一维电泳凝胶上这些大蛋白质都能清楚地被观察到；大蛋白质都能清楚地被观察到
23、；疏水性蛋白质。疏水性蛋白质。 双向电泳技术缺点双向电泳技术缺点2020/11/2437高效毛细管电泳高效毛细管电泳2020/11/24381.1.毛细管区带电泳（毛细管区带电泳（CZECZE） 毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳泳, 这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度依赖物质的缓冲溶液充满，带电粒子的迁移速度依赖物质的荷荷/质比差异。质比差异。荷荷/质比越大，泳动越快。质比越大，泳动越快。2020/11/24392.2.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（capillary ge
24、l electrophoresis ，CGE） 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。2020/11/24403. 3. 胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC） 缓冲溶
25、液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高合的较牢，流出时间长；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。效毛细管电泳的应用范围。 在电场力的作用下，在电场力的作用下，胶束在柱中移动。胶束在柱中移动。2020/11/24414.4.毛细管等电聚焦电泳（毛细管等电聚焦电泳（Capillary is
26、oelectric focusing，CIEF） 是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； CIEF是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（是在毛细管内充有两性电解质，当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；梯度； 具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质
27、的等电点、纯窄溶质带而相互分离；此法可用于测定蛋白质的等电点、纯度鉴定、不同变异体的分析等。度鉴定、不同变异体的分析等。2020/11/24425.5.毛细管等速电泳毛细管等速电泳（Capillary isotachophoresis ，CITP） 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛充满毛细管细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。以同一速度移动。 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前
28、导离子的速度等速向阳极前进，逐渐子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。2020/11/24436.6.亲和毛细管电泳亲和毛细管电泳（affinity capillary electrophoresis, ACE） 是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基，以亲和力的不同达到分离目的。和力的不同达到分离目的。2020/11/24447.7.毛细管电动色谱毛细管电动色谱（Capillary electrokinetic chromatography ，
29、CEC） 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以以“电渗泵电渗泵”取代机械泵，试样组分在两相间的分配为取代机械泵，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程。分离机理的电动色谱过程。2020/11/2445第三节第三节 蛋白质含量的测定方法蛋白质含量的测定方法2020/11/2446n测定蛋白质含量的方法较多测定蛋白质含量的方法较多n基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物学活性建立起来的。学活性建立起来的。2020/11/2447 目前常用的有四种古老的经典方法目前常用的有四种古老的经典方法: :定氮法定
30、氮法, ,双缩脲法双缩脲法( Biuret( Biuret法法) )，Folin -Folin -酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) )和紫外吸收法和紫外吸收法. .另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法, ,考马斯考马斯亮蓝法亮蓝法( Bradford( Bradford法法).).其中其中Bradford Bradford 法和法和 Lowry Lowry 法灵敏法灵敏度高，比紫外吸收法高度高，比紫外吸收法高10-2010-20倍倍, ,比比 Biuret Biuret 法高法高100100倍以上倍以上. .凯氏定氮法比较复杂凯
31、氏定氮法比较复杂, ,但较准确但较准确, ,往往以定氮法测定的蛋白往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。质作为其他方法的标准蛋白质。2020/11/2448一、凯氏定氮法一、凯氏定氮法 凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%，通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。基本操作过程：基本操作过程：用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成用硫酸对样品加热消化，蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O，氮元素被，氮元素被还原成还原成NHNH3 3 ，并形成，并形成(NH(NH4 4) )2 2SOS
32、O4 4 ；加入强碱，使硫酸铵释放出加入强碱，使硫酸铵释放出NHNH3 3，并将，并将NH3收集在无机酸液中；收集在无机酸液中；用标准碱溶液滴定，确定用标准碱溶液滴定，确定NH3量；量；根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。根据量确定样品含氮量，进而求得样品中的蛋白质含量。2020/11/2449(1) H2NCH2COOH +3H2SO4 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3(2) 2NH3 +H2SO4 (NH4)2SO4 (3)(NH4)SO4 +2NaOH 2H2O+Na2SO4 +2NH3此法灵敏度低此法灵敏度低,适用于适用于0.3-3.0g 氮氮,误差为误差
33、为2%,最大最大缺点缺点是受样品中非蛋白质含氮化合物的影响。测定前是受样品中非蛋白质含氮化合物的影响。测定前需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。需用蛋白质沉淀剂沉淀蛋白，除去非蛋白含氮化合物。n优点优点n凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。方法。 1 1、酒精灯、酒精灯 2 2、蒸汽发生器、蒸汽发生器 3 3、长玻璃管长玻璃管 4 4、橡皮
34、管、橡皮管 5 5、小玻杯、小玻杯 6 6、棒状玻璃塞、棒状玻璃塞 7 7、反应室、反应室 8 8、反应室外壳反应室外壳 9 9、夹子、夹子 1010、反应、反应室中插管室中插管 1111、冷凝管、冷凝管 1212、锥形、锥形瓶瓶 1313、石棉网、石棉网2020/11/2451二、紫外吸收法二、紫外吸收法 蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。在最大
35、吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系符合朗大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系符合朗伯伯-比耳定律，因此，可用比色法直接测定蛋白质浓度。比耳定律，因此，可用比色法直接测定蛋白质浓度。2020/11/2452 在测定工作中，可以利用在测定工作中，可以利用280nm280nm及及260 nm260 nm的光密度值求出的光密度值求出蛋白质的浓度：蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（蛋白质浓度（mg/mLmg/mL）=1.45=1.45A280nm0.74A280nm0.74A260nmA260nm 上式中的上式中的OD280nmOD280nm是蛋白质溶液在是蛋白质溶液在280nm280nm下测
36、得的光密度，下测得的光密度，OD260nmOD260nm是蛋白质溶液在是蛋白质溶液在260nm260nm下测得的光密度。下测得的光密度。2020/11/2453优点：优点：n1. 快速；n2. 对蛋白质无破坏性。缺点：n1.不是严格的定量方法。因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。 另外，当蛋白质分子中不含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）n2. 核酸可引起强烈干扰。 2020/11/2454（一）考马斯亮蓝法（一）考马斯亮蓝法（Bradford法）法）
37、考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法。法是比色法与色素法相结合的复合方法。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，在是一种染料，在游离状态下呈棕红色，在465nm465nm下有最大吸收峰；当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一下有最大吸收峰；当与蛋白质结合后呈青蓝色。在一定范围内，也就是当蛋白质含量在定范围内，也就是当蛋白质含量在01000g01000g范围内，蛋白范围内，蛋白质质- -色素结合物在色素结合物在595 nm595 nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，下的吸光度与蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。所以可用比色法测定
38、。2020/11/2455 优点是：优点是： （1 1）灵敏度高：蛋白质染料复合物具有很高的消光）灵敏度高：蛋白质染料复合物具有很高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为为1ug1ug蛋白质。据估计比蛋白质。据估计比LowryLowry法约高四倍。法约高四倍。 （2 2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只需需2 2分钟，结合物的颜色在分钟，结合物的颜色在1 1小时内是稳定的。因而小时内是稳定的。因而完全不用像完全不用像LowryLowry法那样费时和严格地控制时间。法那样费时和严格地控
39、制时间。 （3 3）干扰物质少。如干扰）干扰物质少。如干扰LowryLowry法的法的K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+离离子、子、TrisTris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTAEDTA等均不干扰此测定法。等均不干扰此测定法。 2020/11/2456（二）（二）lowry法法n在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物nFolin-Folin-酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐- -磷钨酸盐被蛋白质中的磷钨酸盐被蛋白质中的TyrTyr和和PhePhe残基还原，产生深兰色的钼兰和钨兰的混合物
40、。残基还原，产生深兰色的钼兰和钨兰的混合物。n在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。在680nm680nm处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。处测定样品吸光值，确定其蛋白质含量。2020/11/2457优点：n操作简单、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，灵敏度比较高。缺点：nFolin-酚试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中的酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。n此方法受蛋白质特异性影响，蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸含量不同使得显色强度也不同，标准曲线也不是严格的直线。n此方法的初步显色是双缩脲反应，因此，凡是干扰双缩脲反应
41、的基团（因素）都会干扰Folin-酚反应。2020/11/2458第四节第四节 蛋白质结构分析方法蛋白质结构分析方法2020/11/2459一、蛋白质的一级结构分析一、蛋白质的一级结构分析步骤：步骤： 分离蛋白质样品必需纯（97%以上）。测定蛋白质分子中多肽链的数目。 巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，产生单一多肽链。 分离纯化单一多肽链。测定多肽链的氨基酸组成。多肽链断裂 可采用特异的酶或化学试剂将多肽样品断裂成肽碎片，并将其分离开来。对每一肽段进行测序。确定肽段在多肽链中的次序。确定蛋白质分子中二硫键及酰胺基的位置 以及磷酸化、糖基化位点。2020/11/2460（一）测序前的准备工作（一
42、）测序前的准备工作1.多肽链氨基端和羧基端分析多肽链氨基端和羧基端分析2.多肽链氨基酸组成分析多肽链氨基酸组成分析3.多肽链有限水解为若干个肽段多肽链有限水解为若干个肽段N-端：丹酰氯丹酰肽-层析分离鉴定C-端：肼解法，羧肽酶法高效液相色谱 测定氨基酸的种类和含量采用特异性的酶或化学试剂将单一多肽链有限水解为具有部分重叠的若干个肽段。2020/11/2461（二）多肽链氨基酸序列测定（二）多肽链氨基酸序列测定1.Edman 降解法降解法Edman降解法：是肽链或蛋白质中降解法：是肽链或蛋白质中N-端氨基端氨基酸序列分析方法之一。由菲尔酸序列分析方法之一。由菲尔埃德曼（埃德曼（Pehr Edma
43、n）首先创立。）首先创立。2020/11/2462 原理：原理：用异硫氰酸苯酯（PITC）与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸处理，关环，肽链N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。余下肽链中的酰胺键不受影响。通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。每反应一次，结果是得到一个去掉每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下
44、一个循环，端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。继续发生降解。2020/11/2463 优点：优点： 能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。而且此法用量少， 缺点： 由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为SO3H，然后才能用Edman降解测定序列。2020/
45、11/24642. 质谱法质谱法质谱技术基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是质谱技术基于串联质谱技术的氨基酸测序方法是根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特根据质谱技术测定多肽分子质量的极高准确性这一特点而设计的点而设计的 。先测定某一肽段（如：先测定某一肽段（如：A A-B- C-D-E-F-G- -B- C-D-E-F-G- ）以及）以及从从C-C-末端或末端或N-N-末端去除一个残基的同一肽段（如：末端去除一个残基的同一肽段（如：B-B-C-D-E-F-G-C-D-E-F-G-）各自的）各自的分子质量分子质量，二者之差值即为末端，二者之差值即为末端残基（残基（A A）的分子质量。）
46、的分子质量。然后与然后与2020种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确种标准氨基酸的分子量进行比较就可以确定末端氨基酸的本质了。定末端氨基酸的本质了。测定时：测定时：2020/11/2465 实际操作时：实际操作时： 从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相从质谱上得到的是一系列的多肽片段，每对大小相近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。近的片段之间仅仅相差一个氨基酸残基。 根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基根据这一分子量差值的大小，较大肽段的末端残基即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一即可准确判断。换句话说，从获得的一系列依次相差一个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以
47、确定最初样个残基的肽段的分子质量中我们很快就可以确定最初样品多肽的末端序列（从品多肽的末端序列（从N一末端或一末端或C一末端开始）。一末端开始）。2020/11/2466二、蛋白质空间结构分析二、蛋白质空间结构分析（一）（一）X射线衍射晶体分析法射线衍射晶体分析法（二）核磁共振法（二）核磁共振法（三）圆二色谱法（三）圆二色谱法（四）傅里叶变换红外光谱法（四）傅里叶变换红外光谱法（五）生物信息学预测蛋白质空间结构（五）生物信息学预测蛋白质空间结构2020/11/2467（一）（一）X射线衍射晶体分析法射线衍射晶体分析法2020/11/2468X射线本质射线本质 X X射线是一种短波长射线是一种短
48、波长(0.005(0.00510nm)10nm)、高能量、高能量(2.5(2.510105 5 1.21.210102 2eV)eV)的电磁波。它是原子内层的电磁波。它是原子内层电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电子在高速运动电子流冲击下，产生跃迁而发射的电磁辐射。电磁辐射。2020/11/2469X-X-射线晶体结构分析基本原理射线晶体结构分析基本原理 nX射线衍射分析所依赖的基本原理是射线衍射分析所依赖的基本原理是X射线衍射现象射线衍射现象n X射线衍射现象射线衍射现象利用利用X射线的波长和晶体中原子的大小射线的波长和晶体中原子的大小及原子间距同数量级的特性来分析晶体结构。及原子
49、间距同数量级的特性来分析晶体结构。 n当当X射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子射线入射到样品晶体分子上时，分子上的每个原子使使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。图形。 n衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的衍射图形能给出样品内部结构的许多资料，如原子间的距离距离、键角键角，分子的，分子的立体结构立体结构、绝对构型绝对构型、原子和分子、原子和分子的的堆积堆积、有序或无序的、有序或无序的排列排列等。等。 2020/11/2470（二）核磁共振法（二）核磁共振法v1946年美国年美国斯坦福大学斯坦福大学的的F.Blo
50、ch和哈佛大学的和哈佛大学的E.M.Purcell两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，两个研究小组首次独立观察到核磁共振现象，为此他们两人获为此他们两人获1952年诺贝尔物理奖。年诺贝尔物理奖。v1983年年，瑞士科学家，瑞士科学家Kurt WKurt Wthrichthrich教授实验室首次运用教授实验室首次运用核磁共振方法解析了胰高血糖素（核磁共振方法解析了胰高血糖素（glucagonglucagon）多肽的溶液构）多肽的溶液构象象. .发明了利用核磁共振发明了利用核磁共振(NMR)(NMR)技术测定溶液中生物大分子三维技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法获得了结构的方法获得了200
