1、第一节第一节 蛋白质的提取和分离蛋白质的提取和分离课程标准课程标准1尝试蛋白质的提取和分离。尝试蛋白质的提取和分离。2以动物血清为材料，提取其中的乳糖脱氢酶并分离其以动物血清为材料，提取其中的乳糖脱氢酶并分离其 同工酶。同工酶。课标解读课标解读1简述蛋白质提取和分离的基本方法和基本原理。简述蛋白质提取和分离的基本方法和基本原理。2尝试血清蛋白等的提取和电泳分离。尝试血清蛋白等的提取和电泳分离。将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到_、甚至是、甚至是_的蛋白质。目前常用的蛋白的蛋白质。目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括质分离提纯技术，包括
2、_技术、技术、_技术和技术和_技技术等。其中，术等。其中，_技术最为快捷灵敏、简便易行。技术最为快捷灵敏、简便易行。提取和分离蛋白质的方法原理提取和分离蛋白质的方法原理1提取和分离蛋白质的方法提取和分离蛋白质的方法高纯度的高纯度的单一种类单一种类离心离心层析层析电泳电泳电泳电泳(1)概念概念蛋白质含有游离的蛋白质含有游离的_和和_ ，是，是_电解质，在一电解质，在一定定_条件下带有电荷，在电场中可以向与其自身所带电条件下带有电荷，在电场中可以向与其自身所带电荷荷_的电极方向移动，这就是电泳现象。的电极方向移动，这就是电泳现象。(2)原理原理蛋白质所带的电荷数蛋白质所带的电荷数_ ，移动，移动_
3、 ；电荷数相同时，；电荷数相同时，相对分子质量相对分子质量_ ，移动，移动_ 。(3)结果结果不同蛋白质的混合溶液，经不同蛋白质的混合溶液，经_电泳后，会在电泳后，会在_上形成不同的上形成不同的_ 。2电泳技术电泳技术氨基氨基羧基羧基两性两性pH相反相反越多越多越快越快越小越小越快越快同一个电场同一个电场凝胶凝胶带纹带纹 洗脱法分离蛋白质利用的原理是什么？它与电洗脱法分离蛋白质利用的原理是什么？它与电泳技术的原理有何不同？泳技术的原理有何不同？提示提示洗脱法是依据蛋白质分子质量大小，利用凝胶色谱洗脱法是依据蛋白质分子质量大小，利用凝胶色谱柱使大分子蛋白质优先洗脱出来，而小分子蛋白质后分离柱使大
4、分子蛋白质优先洗脱出来，而小分子蛋白质后分离出来，称为凝胶色谱法。而电泳法技术则是依据各种分子出来，称为凝胶色谱法。而电泳法技术则是依据各种分子带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带带电性质的差异，以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分电分子产生不同的迁移速度，从而实现在电场中将各种分子分离。子分离。思维激活思维激活1(1)蛋白质的性质蛋白质的性质蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。条件下带有电荷。(2)电泳现象电泳现象作为带电粒子，蛋白质在电场中可以向与其
5、自身所带电荷作为带电粒子，蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动，这就是电泳现象。相反的电极方向移动，这就是电泳现象。(3)电泳原理电泳原理蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，相对分子质量越小，则移动越快。相对分子质量越小，则移动越快。1电泳技术分离蛋白质的原理电泳技术分离蛋白质的原理(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr)和交联剂和交联剂N，N甲基双甲基双
6、丙烯聚酰胺丙烯聚酰胺(Bis)聚合而成。聚合而成。Acr和和Bis单独存在或混合在一单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应戴手套，避免起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应戴手套，避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由接触皮肤，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。采用不同浓度的基团的方法有化学法和光化学法两种。采用不同浓度的Acr、Bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此，可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。因此，可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。(2)电泳结果电泳
7、结果2聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果及其鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果及其鉴定不同的蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会不同的蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。质。(3)结果鉴定结果鉴定将带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液将带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中蛋白质做进一步的分离。如果不能再分离，则这个带纹中蛋白质做进一步的分离。如果不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质；如果还能再分离，则这个中很可能含有一种单纯蛋白质；如果还能再分离，则这个
8、带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷荷_方向的电极移动方向的电极移动 ()。A相同相同 B相反相反 C相对相对 D相向相向解析解析在一定在一定pH作用下，生物大分子中有某些可解离的作用下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。答案答案B【巩固巩固1】(1)点样：样品
9、的成分包括点样：样品的成分包括_5 L、与质量浓度为、与质量浓度为0.4 g/mL的的_溶液及质量分数为溶液及质量分数为0.1%的的_指示剂指示剂_混匀后，用混匀后，用_吸取样品加到电泳样品槽吸取样品加到电泳样品槽的的_上。上。(2)电泳：打开电源，将电流调节至电泳：打开电源，将电流调节至_mA，待样品进入分，待样品进入分离胶后，改为离胶后，改为_mA。当溴酚蓝前沿距离硅胶框下。当溴酚蓝前沿距离硅胶框下缘缘_时，将电流调回零，关闭电源。时，将电流调回零，关闭电源。提取和分离蛋白质的过程提取和分离蛋白质的过程1血清蛋白的提取和分离血清蛋白的提取和分离新制血清新制血清蔗糖蔗糖溴酚蓝溴酚蓝等体积等体
10、积微量加样器微量加样器胶面胶面102030 1 cm(3)染色：将凝胶放入质量分数为染色：将凝胶放入质量分数为_染色染色液中染色液中染色_min。(4)脱色：用体积分数为脱色：用体积分数为_溶液浸泡漂洗数次，每隔溶液浸泡漂洗数次，每隔_h更换一次脱色液。更换一次脱色液。(5)制干胶板：可获得血清蛋白的制干胶板：可获得血清蛋白的_ 。(1)加拿大科学家班廷等人发现和提纯了加拿大科学家班廷等人发现和提纯了_，救助了数千，救助了数千万的糖尿病患者。万的糖尿病患者。(2)在癌变检测中，现在只需从早期患者的在癌变检测中，现在只需从早期患者的_、 _或或_中提取少量蛋白质样品，采用中提取少量蛋白质样品，采
11、用_技技术，就可以更加快速、简便、准确地对术，就可以更加快速、简便、准确地对_作出诊断。作出诊断。能够提前能够提前35年发现一些年发现一些_ ，从而为患者做出及时的，从而为患者做出及时的肿瘤预警，争得更多宝贵的治疗时间。肿瘤预警，争得更多宝贵的治疗时间。2蛋白质提取与分离的实践意义蛋白质提取与分离的实践意义0.05%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250307%的醋酸的醋酸12电泳谱带电泳谱带胰岛素胰岛素尿液尿液血液血液细胞裂解液细胞裂解液蛋白质指纹图谱蛋白质指纹图谱细胞癌变细胞癌变变异基因变异基因 除了上述分离方法，你还知道哪种方法可以分除了上述分离方法，你还知道哪种方法可以分离蛋白质？它依据的原
12、理是什么？离蛋白质？它依据的原理是什么？提示提示透析法。依据的原理是半透膜只允许小分子透过，透析法。依据的原理是半透膜只允许小分子透过，不允许大分子透过。不允许大分子透过。思维激活思维激活2血清蛋白的提取与分离血清蛋白的提取与分离(1)点样：取新制血清点样：取新制血清5 L、与质量分数为、与质量分数为0.4 g/mL蔗糖溶蔗糖溶液及质量分数为液及质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混合均匀后，的溴酚蓝指示剂等体积混合均匀后，用微量加样器取用微量加样器取5 L样品，小心地将样品加到样品糟的胶样品，小心地将样品加到样品糟的胶面上面上(如下图所示如下图所示)。(2)电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下
13、槽连接，负极与上槽电泳：将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接连接(方向切勿接错方向切勿接错)；接通冷却水，打开电泳仪开关。开始；接通冷却水，打开电泳仪开关。开始时将电流调至时将电流调至10 mA，待样品进入分离胶时，将电流调至，待样品进入分离胶时，将电流调至2030 mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘1 cm时，将时，将电流调回到零，关闭电源。电流调回到零，关闭电源。(3)染色：将凝胶放入染色：将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色液中，使染染色液中，使染色液没过胶板，染色色液没过胶板，染色30 min左右。左右。(4)脱色：用脱色：
14、用7%醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去。如用用50 水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。(5)制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡34 h，然后将凝胶板放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得然后将凝胶板放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳图谱，如下图所示。血清蛋白的电泳图谱，如下图所示。特别提醒特别提醒 分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应分离胶和浓缩胶单独存在时具有神经毒性，应避免接触皮肤。避免接触皮肤。下列关于点样的叙述正确的是下列关于点样的叙述正
15、确的是 ()。A点样液是血清和溴酚蓝指示剂等体积混合液点样液是血清和溴酚蓝指示剂等体积混合液B点样需用微量加样器点样需用微量加样器C点样液是指新鲜血清点样液是指新鲜血清D点样液可在市场上购买点样液可在市场上购买答案答案B【巩固巩固2】 下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因的原因 ()。A分子带电性质的差异分子带电性质的差异 B分子的大小分子的大小C分子的形状分子的形状 D分子的变性温度分子的变性温度思维导图：思维导图：【例例1】示例示例一一提取和分离蛋白质的原理提取和分离蛋白质的原理深度剖析深度剖析电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁
16、移的过电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故正确答案选无关，故正确答案选D项。项。答案答案D归纳提升归纳提升 蛋白质的分离方法及相关原理比较：蛋白质的分离方法及相关原理比较：方法方法原理原理凝胶色凝胶色谱法谱法根据相对分子质量的大小分离蛋白质根据相对分子质量的大小分离蛋白质电泳法电泳法根据各种分子带电性质的差异以及分子本身根据各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同进行分离大小
17、、形状的不同进行分离 用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离和提取血清蛋白的实验用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离和提取血清蛋白的实验操作中，错误的是操作中，错误的是 ()。A点样时将样品小心加到电泳样品槽的胶面上点样时将样品小心加到电泳样品槽的胶面上B电泳时，将稳压稳流电泳仪的电流稳定在电泳时，将稳压稳流电泳仪的电流稳定在10 mAC染色时用染色时用0.05%考马斯亮蓝考马斯亮蓝P250染色液染色液D脱色用脱色用7%醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去醋酸浸泡漂洗数次，直至背景蓝色褪去思维导图：思维导图：【例例2】示例二示例二提取和分离蛋白质的过程提取和分离蛋白质的过程深度剖析深度剖析用聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取分
18、离蛋白质的操用聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取分离蛋白质的操作顺序为：点样作顺序为：点样电泳电泳染色染色脱色脱色制干胶板。点样用制干胶板。点样用微量加样器取微量加样器取5 L样品，加到样品槽的胶面上。电泳时，样品，加到样品槽的胶面上。电泳时，打开电泳仪开关将电流调至打开电泳仪开关将电流调至10 mA，待样品进入分离胶时，待样品进入分离胶时，将电流调至将电流调至2030 mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下。当蓝色染料迁移至距离橡胶框下缘缘1 cm时，将电流调回到零，关闭电源。时，将电流调回到零，关闭电源。答案答案B凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理利用凝胶色谱法分离蛋白质利用凝胶色谱法分离蛋白质技法必备技
19、法必备蛋白质的蛋白质的分离原理分离原理根据蛋白质相对分子质量的大小，利根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用用具有网状结构的凝胶的分子筛作用来进行分离来进行分离蛋白蛋白质分质分子运子运动情动情况况类型类型相对分子质量大相对分子质量大相对分子质量小相对分子质量小大小大小直径较大直径较大直径较小直径较小方向方向垂直向下运动垂直向下运动无规则扩散无规则扩散速度速度较快较快较慢较慢路径路径较短较短较长较长洗脱次序洗脱次序先流出先流出后流出后流出下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理示意图，据图回答下下图是凝胶色谱法分离蛋白质的原理示意图，据图回答下列问题：列问题：能力展示能力展示(
20、1)图中图中A表示的含义是：相对分子质量较小的蛋白质表示的含义是：相对分子质量较小的蛋白质_；相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质_。(2)图中图中B表示的凝胶色谱法分离蛋白质的过程，指出图中表示的凝胶色谱法分离蛋白质的过程，指出图中各自的含义：各自的含义：_；_；_；_；_。解析解析本题主要是对识图能力考查。图中本题主要是对识图能力考查。图中A表示相对分子质量不表示相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶层时扩散的特点，同的蛋白质通过凝胶层时扩散的特点，B表示蛋白质混合液通过表示蛋白质混合液通过凝胶色谱柱被洗脱的过程。凝胶色谱柱被洗脱的过程。答案答案(1)因扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞
21、留被排阻在凝因扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过(2)蛋白质混合物上柱蛋白质混合物上柱洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内部；洗脱开始，相对分子质量较小的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内部；相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外相对分子质量较大的蛋白质则被排阻于颗粒之外相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白相对分子质量较小的蛋白质被滞留，相对分子质量较大的蛋白质向下移动质向下移动相对分子质量不同的分子完全分开相对分子质量不同的分子完全分开相对分子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分
22、子质量较大的蛋白质行程较短，已从层析柱中洗脱出来，相对分子质量较小的蛋白质还在行进中相对分子质量较小的蛋白质还在行进中下列关于电泳概念的理解，错误的是下列关于电泳概念的理解，错误的是 ()。A能进行电泳的物质一般是带电颗粒能进行电泳的物质一般是带电颗粒B带电颗粒向着与其电性相同的电极移动带电颗粒向着与其电性相同的电极移动C影响电泳速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强影响电泳速度的因素包括带电颗粒的性质、电场强 度、溶液的度、溶液的pH等等D电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等电泳支持物有滤纸、大分子凝胶、醋酸纤维薄膜等解析解析电泳是指带电颗粒向着与其电性相反的电极移动的电泳是指带电颗粒
23、向着与其电性相反的电极移动的现象。现象。答案答案B1.电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快电泳过程中，什么样的分子迁移速度最快 ()。A纤维状、大分子纤维状、大分子 B纤维状、小分子纤维状、小分子C球状、大分子球状、大分子 D球状、小分子球状、小分子解析解析电泳就是利用了分离样品中各种分子带电性质的差电泳就是利用了分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同而分离各种分子的。异以及分子本身的大小、形状的不同而分离各种分子的。一般来说，球形分子比纤维状分子易移动，小分子比大分一般来说，球形分子比纤维状分子易移动，小分子比大分子易移动。子易移动。答案答案D2(1)目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括目前常用的蛋白质分离提纯技术，包括_、_和和_等。其中，等。其中，_最为快捷灵敏、简便易行。最为快捷灵敏、简便易行。(2)蛋白质含有游离的蛋白质含有游离的_和和_，是，是_电电解质，在一定解质，在一定pH条件下带有电荷。条件下带有电荷。答案答案(1)离心技术层析技术电泳技术电泳技术离心技术层析技术电泳技术电泳技术(2)氨基羧基两性氨基羧基两性3课堂小结课堂小结
