1、 DNA重组及重组重组及重组DNA技技术术第第 二十一二十一 章章DNA重组（DNA recombination）是指不同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。重组DNA技术（recombinant DNA technology）是指在体外将两个或两个以上DNA分子重新组合并在适当细胞中增殖形成新DNA分子的过程。 2第一节第一节自然界的自然界的DNA重组和重组和基因转移基因转移DNA重组4同源重组 (homologous recombination)位点特异重组(site-specific recombination)转座重组(transposition
2、 recombination)接合作用 (conjugation)转化作用 (transformation)转导作用 (transduction)第二节第二节 重组重组DNA技术技术重组DNA技术的发展史1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验。1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子。1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗 传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重 要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工 厂。1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。6工 具 酶功
3、 能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针； DNA序列分析；填补3 末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35 外切活性，而无53 外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3 末端标记等反转录酶合成cDNA；替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3 羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸
4、酶切除末端磷酸基9一、重组一、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是一类核酸内切酶，能识别双链DNA分子内部的特异序列, 并裂解磷酸二酯键。GGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GBam H10第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。 命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌
5、流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶11类酶识别序列特点回文结构(palindrome) 切口：平端切口、粘端切口12Bam HGTCGTCCAGCAGG GCCTAGCCTAGGATCCGATCC G GGGATCCGGATCCCCTAGGCCTAGGHindGTCGACGTCGACCAGCTGCAGCTGGACGACCTGCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口13 定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 载体按功能分为 克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序 列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(express
6、ion vector)：为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为 表达载体。14二、重组二、重组DNA技术中常用的载体技术中常用的载体质粒(plasmid)：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。 常用的克隆载体15pUC18质粒载体图谱1617原核表达载体的基本组成R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列表达载体18真核表达载体的基本组成 OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点； TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。 基本原理目的基因的获取 克隆载体的选择和构建外源基因与
7、载体的连接 DNA导入受体细胞重组体的筛选 克隆基因的表达 19三、重组三、重组DNA技术的基本原理技术的基本原理及操作步骤及操作步骤 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程2021l目的基因的分离获取分l载体的选择与构建选l目的DNA与载体连接接l重组DNA转入受体细胞转l重组体的筛选与鉴定筛l克隆基因的表达22（一）目的基因的分离获取分1.化学合成法 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸 序列 。2. 从基因组DNA文库和cDNA文库中获取目的DNA3. PCR法 4. 其他方法23（二）载体的选择与构建选DNA克隆的目的：化学合成法获得某一目的基因或DNA片段 获得目的DN
8、A片段所编码的蛋白质载体插入DNA片段宿主细胞质粒510kb细菌，酵母噬菌体载体20kb细菌黏粒50 kb细菌BAC400kb细菌YAC3 Mb酵母24不同载体的克隆容量及适宜宿主细胞251. 黏端连接(1) 单一相同黏端连接(2) 不同黏端连接(3) 通过其他措施产生黏端进行连接 （三）目的DNA与载体连接接Bam H切割反应切割反应 GGATCCGGATCC CCTAGG CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶 15CGATCCGATCC G GG GCCTAGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCC
9、GGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连26单一相同黏端连接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位点切割位点Bg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l双酶切双酶切Eco R+ Bg l双酶切双酶切GCTT
10、AAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体27不同黏端连接（定向克隆）Eco REco REco RCCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R28人工接头及其应用5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5 -核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 D
11、NA连接酶连接酶15C重组体5 29同聚物加尾连接目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体载体自连载体自连目的基因目的基因自连自连302. 平端连接31受体菌条件：安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)（四）重组DNA转入受体细胞转321. 借助载体上的遗传标志进行筛选2. 序列特异性筛选3. 亲和筛选法（五）重组体的筛选与鉴定筛插入失活筛选带有重组载体的克隆33互补筛选（蓝-白筛选）34
12、菌落或噬斑原位杂交筛选重组体35重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分分离获取目的基因 选载体的选择与构建接目的DNA与载体连接 转重组DNA转入受体细胞筛重组体的筛选与鉴定36重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化 体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交37381. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用)2. 真核表达体系(酵母、昆虫、乳类动物细胞)（六）克隆基因的表达第三节第三节 重组重组DNA技术在医学中技术在医学中的应用的应用 利用基因
13、工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。 美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。40一、重组一、重组DNA技术广泛应用于生物制药技术广泛应用于生物制药重组DNA医药产品产 品功 能组织胞浆素原激活剂抗凝血液因子VIII促进凝血颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成促红细胞生成素剌激白细胞生成生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化生长素治疗侏儒症胰岛素治疗糖尿病干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶抗组织损伤单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗(CHO, 酵母)预防乙肝口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱41 疾病相关基因的发现与鉴定 转基因和基因打靶 加速了人类基因组计划的完成 疾病的基因诊断和基因治疗 42二、重组二、重组DNA技术还应用于医学技术还应用于医学的其他诸多方面的其他诸多方面
