1、1生物化学与分子生物学教研室生物化学与分子生物学教研室 刘先俊刘先俊23一、一、DNADNA半保留复制的概念及其实验证据半保留复制的概念及其实验证据 在在DNADNA复制过程中，复制过程中，DNADNA双螺旋结构的双螺旋结构的两条多核苷酸链彼此分开，然后，每条链两条多核苷酸链彼此分开，然后，每条链各自作为模板，在其上分别合成出一条互各自作为模板，在其上分别合成出一条互补链，这样，新形成的两个补链，这样，新形成的两个DNADNA分子（子代分子（子代DNADNA）与原来）与原来DNADNA分子（亲代分子（亲代DNADNA）的核苷酸）的核苷酸序列完全相同。在此过程中，每个子代序列完全相同。在此过程中
2、，每个子代DNADNA的两条链，一条来自亲代的两条链，一条来自亲代DNADNA，另一条链则，另一条链则是新合成的，这种方式称为是新合成的，这种方式称为DNADNA的半保留复的半保留复制制 。 4子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 5 1953 1953年，年，WatsonWatson和和CrickCrick在提出在提出DNADNA双螺旋双螺旋结构模型的同时，即提出结构模型的同时，即提出DNADNA是通过半保留复是通过半保留复制制19581958年，年，MeselsonMeselson和和StahlStahl通过
3、实验证实了通过实验证实了“半保留复制半保留复制”的设想。的设想。 首先将大肠杆菌置于含首先将大肠杆菌置于含1515NHNH4 4ClCl的培养基中的培养基中培养若干代后，使大肠杆菌培养若干代后，使大肠杆菌DNADNA全部成为全部成为1515N-N-DNADNA（由于大肠杆菌生长繁殖过程中，需要利（由于大肠杆菌生长繁殖过程中，需要利用培养基中的用培养基中的N N作为氮源以合成其作为氮源以合成其DNADNA或或RNARNA等等含氮物质，在仅提供含氮物质，在仅提供1515N N的情况下，大肠杆菌合的情况下，大肠杆菌合成的成的DNADNA必然为必然为1515N-DNAN-DNA）。）。6 普通大肠杆菌
4、为普通大肠杆菌为1414N-DNAN-DNA，1414N N和和1515N N是是N N元素的两种非放射性同位素，其中，元素的两种非放射性同位素，其中，1515N N比比 1414N“N“重重”。当分别提取出其相应。当分别提取出其相应DNADNA后，在后，在进行进行CsClCsCl等密度梯度离心时，等密度梯度离心时，1515N-DNAN-DNA与与1414N-N-DNADNA由于两者由于两者“重量重量”的差别而位于离心管的差别而位于离心管不同位置，前者称为不同位置，前者称为“重重”DNADNA，后者称为，后者称为“轻轻”DNADNA。因而可通过密度梯度离心而区。因而可通过密度梯度离心而区分开来
5、。分开来。 随后，再将含随后，再将含1515N-DNAN-DNA的大肠杆菌置于的大肠杆菌置于含含1414N N的培养基中培养，此后，在不同时间的培养基中培养，此后，在不同时间（第一代、第（第一代、第2 2代、第代、第3 3代代等）取样进等）取样进行密度梯度离心。其结果是：行密度梯度离心。其结果是：78第第 1 1 代 ： 出 现代 ： 出 现 1 1 条条 D N AD N A 带 ， 其 位 置 既 非带 ， 其 位 置 既 非“轻轻”DNADNA带也非带也非“重重”DNADNA带的位置，而带的位置，而处于两带之间的中间位置。处于两带之间的中间位置。第第2 2代：出现代：出现2 2条条DNA
6、DNA带，其中一条的位置与第带，其中一条的位置与第1 1代的位置相同（即处于代的位置相同（即处于“轻轻”带和带和“重重”带之间的中间位置），另一条出现在带之间的中间位置），另一条出现在“轻轻”DNADNA带的位置。带的位置。第第3 3代：于第代：于第2 2代类似，也出现代类似，也出现2 2条条DNADNA带，其带，其位置与第位置与第2 2代相同，即一条中间位置的带和代相同，即一条中间位置的带和一条一条“轻轻”带，但带，但“轻轻”带的带的DNADNA更多了。更多了。第第4 4代及以后：均为代及以后：均为2 2条条DNADNA带，其位置与第带，其位置与第2 2代、第代、第3 3代相似，但代相似，但
7、“轻轻”带的带的DNADNA越来越越来越多，而中间位置带的多，而中间位置带的DNADNA越来越少。越来越少。910 为了证实为了证实DNADNA分子中只有一条是新合成分子中只有一条是新合成的，的，MeselsonMeselson和和StahlStahl将提取出的第将提取出的第1 1代大代大肠杆菌肠杆菌DNADNA加热处理，使其变性后仍通过加热处理，使其变性后仍通过CsClCsCl超速离心分离，在紫外吸收扫描图上超速离心分离，在紫外吸收扫描图上可见两个比重不同的紫外吸收峰，从而确可见两个比重不同的紫外吸收峰，从而确证了第证了第1 1代细菌的代细菌的DNADNA是由两条比重不同的是由两条比重不同的
8、链所组成，排除了其它可能性。链所组成，排除了其它可能性。1112半保留复制的意义半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。础，但不是绝对的。1314151617181.1.前导链前导链192.2.随从链随从链203.3.岗崎片段岗崎片段214.4.半不连续复制半不连续复制22（三）双向复制（三）双向复制 原核生物复制时，原核生物复
9、制时，DNADNA从从起始点起始点(origin)(origin)向两个方向解链，形向两个方向解链，形成两个延伸方向相反成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向的复制叉，称为双向复制。复制。复制中的复制中的DNADNA成成为为 状。状。 2324真核生物每个染色体有多个起始点，是多复真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个定为一个复制子复制子(replicon(replicon) ) 。复制子是独。复制子是独立完成复制的功能单位。立完成复制的功能单位。252627（一）（一）DNADNA聚合酶聚合酶 D
10、NADNA聚合酶（聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase）在有）在有DNADNA模板存在时，可催化合成模板存在时，可催化合成DNADNA，因此，因此，又 称 为又 称 为 D N AD N A 指 导 的指 导 的 D N AD N A 聚 合 酶 （聚 合 酶 （ D N A -D N A -directed DNA polymerasedirected DNA polymerase，DDDPDDDP）。）。1.1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶( (原核生物原核生物) ) 1956 1956年，年，KornbergKornberg等人首次从大肠杆等人首次
11、从大肠杆菌的提取液中发现了一种能催化合成菌的提取液中发现了一种能催化合成DNADNA的的酶，称为酶，称为DNADNA聚合酶聚合酶。28目前研究表明，大肠杆菌目前研究表明，大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶有三种功有三种功能：能：第一、第一、5353的聚合作用。的聚合作用。大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶只能在引物的只能在引物的33端加上脱氧核苷酸，它端加上脱氧核苷酸，它是利用引物的是利用引物的3-OH3-OH与待加入的脱氧核苷三磷与待加入的脱氧核苷三磷酸的酸的5-5-磷酸基之间形成磷酸基之间形成3,5-3,5-磷酸二酯磷酸二酯键。已加入的脱氧核苷酸则仍有一个游离的键。已加入的脱氧核苷酸则
12、仍有一个游离的3-OH3-OH，又可与下一个脱氧核苷三磷酸的，又可与下一个脱氧核苷三磷酸的55磷酸基之间形成磷酸基之间形成3,5-3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键, ,以后，以后，按这种方式，按这种方式，DNADNA链不断延伸，因此，新链的链不断延伸，因此，新链的合成方向是合成方向是5353，称为大肠杆菌，称为大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶酶的的5353聚合作用。聚合作用。2930第二、第二、3535的外切作用的外切作用（35exonuclease action35exonuclease action） 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶除具有除具有5353的的聚合作用外，也能催化从聚合作用
13、外，也能催化从3-3-末端水解末端水解DNADNA链，链，而产生游离的单核苷酸，称为而产生游离的单核苷酸，称为3535的外切的外切作用。其作用。其3535的外切作用对的外切作用对DNADNA的聚合具有的聚合具有校正功能校正功能。错位接上去的碱基。错位接上去的碱基C C会被会被DNADNA聚合酶聚合酶的的3535的外切作用水解掉，而的外切作用水解掉，而DNADNA聚合酶聚合酶再催化重新聚合上正确的碱基再催化重新聚合上正确的碱基T T。3132第三、第三、5353的外切作用。的外切作用。 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶还具有还具有5353的外切的外切作用。但这种外切作用不同于其作用。但这
14、种外切作用不同于其3535的外切的外切作用：作用：（1 1）首先，其裂解的键必须位于双螺旋区域。）首先，其裂解的键必须位于双螺旋区域。（2 2）其次，产物为单核苷酸或几个碱基组成的寡聚）其次，产物为单核苷酸或几个碱基组成的寡聚体。体。（3 3）5353的外切作用随着的外切作用随着DNADNA合成的进行而不合成的进行而不断增强。断增强。（4 4）5353的外切作用的酶的活性部位可与其聚的外切作用的酶的活性部位可与其聚合作用和合作用和3535的外切作用的活性部位分开。的外切作用的活性部位分开。 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的的5353外切作用外切作用在在DNADNA复制过程中用于复制过
15、程中用于去除引物去除引物。 333435 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶分子量为分子量为109kD109kD，是，是含有含有928928个氨基酸残基的单条肽链。若用枯草个氨基酸残基的单条肽链。若用枯草杆菌蛋白酶处理，可将大肠杆菌杆菌蛋白酶处理，可将大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶水解为大小不等的两个片断，其中，分子量较水解为大小不等的两个片断，其中，分子量较小的为小片断，其分子量为小的为小片断，其分子量为33kD33kD，它有，它有5353的外切作用；另一个分子量较大的称的外切作用；另一个分子量较大的称为大片断，其分子量为为大片断，其分子量为76kD76kD，它有，它有5353聚聚合
16、作用和合作用和3535的外切作用，大片断又称为的外切作用，大片断又称为KlenowKlenow片断（片断（KlenowKlenow fragment fragment）。）。36 可见，大肠杆菌可见，大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶的结构功的结构功能区可表示如下：能区可表示如下： 53 35 53 外切作用 外切作用 聚合作用 53 35 53 外切作用 + 外切作用 聚合作用 小片断小片断 大片断大片断C枯草杆菌蛋白酶N37 继继DNADNA聚合酶聚合酶之后，之后，19701970、19711971年又分别从年又分别从大肠杆菌中发现了另外大肠杆菌中发现了另外2 2种种DNADNA聚合酶，分别
17、命名聚合酶，分别命名为为DNADNA聚合酶聚合酶、。现将三种大肠杆菌。现将三种大肠杆菌DNADNA聚合聚合酶的主要特性列于下表中。酶的主要特性列于下表中。三种大肠杆菌三种大肠杆菌DNADNA聚合酶的主要特性比较聚合酶的主要特性比较DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶功能：53聚合作用+ 35外切作用+ 53外切作用+-分子量(kD)109120250细胞中存在的比例4004020聚合速度(bp/min/分子，37)1,0005015,000细胞内的主要作用校正复制错误填补复制、修复中的空隙参与应急状态的DNA修复DNA复制382. 2. 真核生物的真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-po
18、lDNA-pol 起始引发、有引物酶活性起始引发、有引物酶活性DNA-polDNA-pol 低保真低保真DNADNA复制复制DNA-polDNA-pol 线粒体线粒体DNADNA的复制的复制DNA-polDNA-pol 复制中延长子链、解螺旋酶复制中延长子链、解螺旋酶DNA-polDNA-pol 修复和填补缺口修复和填补缺口39（二）引物酶（二）引物酶 引物酶（引物酶（primaseprimase）是一种特殊的是一种特殊的RNARNA聚合聚合酶。在酶。在DNADNA复制过程中，复制过程中，DNADNA聚合酶催化合成聚合酶催化合成DNADNA时，需要一段带有时，需要一段带有3-OH3-OH末端的
19、低聚核苷末端的低聚核苷酸单链（体内为一小段酸单链（体内为一小段RNARNA）作引物）作引物（primerprimer），引物的碱基序列与模板），引物的碱基序列与模板DNADNA呈互呈互补结合，引物的长度在原核生物如大肠杆菌通补结合，引物的长度在原核生物如大肠杆菌通常只有常只有1 16 6个碱基，在真核生物，通常也只有个碱基，在真核生物，通常也只有1010个碱基左右。引物酶的作用即是利用四种核个碱基左右。引物酶的作用即是利用四种核苷三磷酸（简称苷三磷酸（简称NTPNTP）为底物，根据模板的碱）为底物，根据模板的碱基序列，按照碱基配对规则合成一小段基序列，按照碱基配对规则合成一小段RNARNA引引
20、物。物。40引物酶引物酶 (primase(primase):): 依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶。聚合酶。 催化带有催化带有3-OH3-OH末断的末断的RNARNA引物的合成。引物的合成。 引发体引发体 (primosome(primosome):): 是由是由DnaDna B B、DnaDna C C、引物酶、引物酶、DNADNA复制复制起始区等一起形成的复合体。起始区等一起形成的复合体。 引发体形成后，在引发体形成后，在ATPATP提供能量时，引提供能量时，引物酶以物酶以DNADNA作为模板而合成引物。作为模板而合成引物。4142（三）解链、解旋酶类（三）解链、解旋酶类 解开
21、并理顺解开并理顺DNADNA双链，维持双链，维持DNADNA处处于单链状态。主要有解螺旋酶、于单链状态。主要有解螺旋酶、DNADNA拓拓扑异构酶和单链扑异构酶和单链DNADNA结合蛋白。结合蛋白。431. 1. 解螺旋酶解螺旋酶 (helicase(helicase) : ) : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把把DNADNA解开成单链，它才能起模板作用。解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋白质，当时称为蛋白质，当时称为re
22、prep蛋白。作用是利用蛋白。作用是利用ATPATP供能，解开供能，解开DNADNA双链。双链。442. 2. 单链单链DNADNA结合蛋白结合蛋白 (SSB) :(SSB) : SSBSSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDPHDP）。）。在大肠杆菌，它是由在大肠杆菌，它是由177177个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成的同四聚体，结合单链的同四聚体，结合单链DNADNA的跨度约的跨度约3232个核个核苷酸单位。苷酸单位。SSBSSB与解开的与解开的DNADNA单链紧密结合，防止单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制中维
23、持模板处于单链状态。制中维持模板处于单链状态。453. DNA3. DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 (topoisomerase(topoisomerase) :) : 拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保拓扑：是指物体或图像作弹性移位而又保持物体不变的性质。持物体不变的性质。拓扑异构酶：是一类可改变拓扑异构酶：是一类可改变DNADNA拓扑性质拓扑性质的酶。对的酶。对DNADNA分子的作用是既能水解、又分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛能连接磷酸二酯键。可松弛DNADNA超螺旋，超螺旋，有利于有利于DNADNA解链。解链。4647拓扑异构酶拓扑异构酶I I（topotopo I I）
24、: : 在原核生物曾被称为在原核生物曾被称为 蛋白。蛋白。 主要作用是主要作用是将超螺旋将超螺旋DNADNA双股中的一股切断，双股中的一股切断，酶仍停留在酶仍停留在33断端，使链的末端沿着螺旋断端，使链的末端沿着螺旋轴按超螺旋的反方向转动，轴按超螺旋的反方向转动， DNADNA变为松弛变为松弛状态（状态（超螺旋消除后）超螺旋消除后）再封闭切口再封闭切口。催化。催化反应不需要反应不需要ATPATP。48拓扑异构酶拓扑异构酶IIII（ topotopo II II）: : 在原核生物又叫旋转酶在原核生物又叫旋转酶(gyrase(gyrase) )。连接断端。连接断端。 无无ATPATP参与时，使螺
25、旋松弛。参与时，使螺旋松弛。 在在ATPATP参与下，松弛的参与下，松弛的DNADNA进入负超螺进入负超螺旋。旋。49（四）（四）DNADNA连接酶连接酶 可催化可催化DNADNA链内缺口通过链内缺口通过3,5-3,5-磷酸磷酸二酯键连接起来，在此过程中，需要消耗二酯键连接起来，在此过程中，需要消耗能量。该能量的提供者是能量。该能量的提供者是ATPATP（动物细胞、（动物细胞、噬菌体）或噬菌体）或NADNAD+ +（细菌）。（细菌）。5051525354（一）原核生物（一）原核生物DNADNA复制过程复制过程5556DNADNA复制的起始就是要解开双链和生成引物。复制的起始就是要解开双链和生成
26、引物。(1)DNA(1)DNA解成单链解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，解开双链，SSBSSB结合到单链上使其稳定。结合到单链上使其稳定。 复制起始的解链需要多种蛋白质参与。复制起始的解链需要多种蛋白质参与。这些蛋白质与复制起始点的特有序列结合，这些蛋白质与复制起始点的特有序列结合，促使其邻近的促使其邻近的DNADNA解链。解链。57 首先起始复合体（首先起始复合体（DnaADnaA-ATP-ATP）与）与4 49bp9bp重复序列结合，重复序列结合，3 313bp(13bp(富含富含AT)AT)重复序列在重复序列在型拓扑异构酶的作用下，使型
27、拓扑异构酶的作用下，使3 313bp13bp重复序重复序列区域松弛，再在列区域松弛，再在DNADNA解旋酶解旋酶(DnaB(DnaB蛋白）的作蛋白）的作用下，用下，3 313bp13bp区域发生解链；复制泡被单链区域发生解链；复制泡被单链结合蛋白结合蛋白(SSB(SSB蛋白蛋白) )覆盖，以免断裂和再复性；覆盖，以免断裂和再复性；引物酶结合到模板引物酶结合到模板DNADNA上并合成一段短的上并合成一段短的RNARNA，作为合成作为合成DNADNA的引物，引发第一个复制叉的先的引物，引发第一个复制叉的先导链的复制，接下来是双向复制。导链的复制，接下来是双向复制。58596061参与原核生物复制起
28、始的主要成分参与原核生物复制起始的主要成分DnaADnaA蛋白蛋白DnaBDnaB蛋白蛋白( (解螺旋酶解螺旋酶) )DnaCDnaC蛋白蛋白DnaGDnaG蛋白蛋白( (引物酶引物酶) )SSBSSB拓朴异构酶拓朴异构酶oriCoriC辨认起始点辨认起始点解开解开DNA双链双链协助协助DnaBDnaB蛋白蛋白催化形成催化形成RNARNA引物引物稳定解开的单链稳定解开的单链DNADNA理顺理顺DNADNA链链大肠杆菌的复制起始点大肠杆菌的复制起始点6263646566领头链领头链 (leading strand)(leading strand) 顺着解链方向生成的子链，其复制是顺着解链方向生成
29、的子链，其复制是连续进行的，得到一条连续的子链。连续进行的，得到一条连续的子链。53355解链方向367随从链随从链 (lagging strand) 复制方向与解链方向相反，须等解开复制方向与解链方向相反，须等解开足够长度的模板链才能继续复制，得到足够长度的模板链才能继续复制，得到的子链由不连续的片段所组成。的子链由不连续的片段所组成。53355解链方向335536869707172（二）真核生物（二）真核生物DNA的复制特点的复制特点 酵母的复制起始点称为酵母的复制起始点称为ARS(autonomouslyARS(autonomously replicating replicating s
30、equencessequences自主复制序列自主复制序列 ) )，长约，长约15Obp15Obp左左右，包括数个复制起始必需的保守区，其右，包括数个复制起始必需的保守区，其核心序列富含核心序列富含ATAT。真核生物。真核生物DNADNA复制的起始复制的起始需要起点辨认复合物需要起点辨认复合物(ORC)(ORC)参与。真核生物参与。真核生物DNADNA复制叉的移动速度比原核生物慢得多复制叉的移动速度比原核生物慢得多（大约只有（大约只有5Obp/s5Obp/s，还不到大肠杆菌的，还不到大肠杆菌的1/201/20）。）。73 真核生物有多个复制起始点真核生物有多个复制起始点( (oriori) )
31、。复制起。复制起始点有特殊的序列。起点辩认复合物（始点有特殊的序列。起点辩认复合物（origin origin recognition complexrecognition complex，ORCORC）组装在起始部位上，）组装在起始部位上，形成复制叉形成复制叉。ORCORC在起始点上的组装还不足以开始起在起始点上的组装还不足以开始起动，另一种复合物称小染色体维系蛋白（动，另一种复合物称小染色体维系蛋白（mini mini chromosome maintenance protein , MCMchromosome maintenance protein , MCM）必须参）必须参与。与。MC
32、MMCM有较弱的解旋酶的活性。此外，还需拓扑异有较弱的解旋酶的活性。此外，还需拓扑异构酶、复制因子构酶、复制因子(RF)(RF)、增值细胞核抗原（、增值细胞核抗原（PCNAPCNA）的）的参与。参与。74 RF RF有多种如有多种如RFARFA、RFBRFB、RFCRFC等，是调节等，是调节细胞细胞DNADNA复制的重要蛋白质。在蛋白激酶的复制的重要蛋白质。在蛋白激酶的作用下被磷酸化，激活或抑制作用下被磷酸化，激活或抑制RFRF的活性。的活性。而蛋白激酶包括调节亚基（又称细胞周期而蛋白激酶包括调节亚基（又称细胞周期蛋白）和催化亚基（又称细胞周期蛋白依蛋白）和催化亚基（又称细胞周期蛋白依赖激酶，
33、赖激酶，CDKCDK），且各有多种（参见书），且各有多种（参见书P254P254表表10-510-5）。从而对）。从而对DNADNA复制起始进行精确及复制起始进行精确及多样化控制多样化控制, ,使多位点复制呈时序性而非同使多位点复制呈时序性而非同步性。步性。75PRAPRA：复制蛋白：复制蛋白A A76 DNA DNA聚合酶聚合酶能识别起始位点，并且以能识别起始位点，并且以核糖核苷三磷酸为底物（核糖核苷三磷酸为底物（NTPNTP），以解开的一），以解开的一段段DNADNA为模板，合成一个短链为模板，合成一个短链RNARNA（8 81010个核个核苷酸）引物。然后从引发酶的活性转变为苷酸）引物。
34、然后从引发酶的活性转变为DNADNA聚合酶聚合酶的活性的活性，RNARNA引物的引物的3-OH3-OH末端为合末端为合成新的成新的DNADNA单链的起点，以单链的起点，以dNTPdNTP为原料，延长为原料，延长引物大约引物大约15-3015-30个脱氧核苷酸。个脱氧核苷酸。77 合成的方向仍然为合成的方向仍然为5533。一旦冈崎片。一旦冈崎片段达到一定长度，段达到一定长度，DNADNA聚合酶聚合酶便从便从DNADNA上解离上解离下来。下来。RFCRFC结合到这一延长的引物上，并组装结合到这一延长的引物上，并组装到到PCNAPCNA滑动夹上，然后滑动夹上，然后DNADNA聚合酶聚合酶（polpo
35、l）结合到结合到PCNAPCNA上并完成冈崎片段的最终长度上并完成冈崎片段的最终长度130-130-200bp.200bp.当它遇到原先已形成的冈崎片段当它遇到原先已形成的冈崎片段55末端末端时，时，polpol/PCNA/PCNA复合物从复合物从DNADNA上释放下来上释放下来78两条链均按两条链均按55到到33方向合成，一条链方向合成，一条链33末端的方向朝着复制叉前进的方末端的方向朝着复制叉前进的方向，可连续合成，称前导链（向，可连续合成，称前导链（leading strandleading strand）。另一条链）。另一条链55末端朝着复末端朝着复制叉，合成是不连续的，形成冈崎片段，
36、此链称后随链制叉，合成是不连续的，形成冈崎片段，此链称后随链(lagging strand)(lagging strand)。79 引物的去除通过两个步骤，首先由引物的去除通过两个步骤，首先由RNaseRNase H H降解降解RNARNA引物，留下单个核糖核苷酸引物，留下单个核糖核苷酸连接到冈崎片段上。然后，由側翼内切核酸连接到冈崎片段上。然后，由側翼内切核酸酶（酶（flap endonucleaeflap endonucleae 1,FEN1 1,FEN1） 除去最后除去最后一个核苷酸。一个核苷酸。FEN1FEN1也能除去由于也能除去由于DNADNA聚合酶聚合酶产生的某些错误的碱基。产生的
37、某些错误的碱基。80 DNA DNA连接酶将相邻的两个连接酶将相邻的两个DNADNA片段连接起片段连接起来，形成大分子来，形成大分子DNADNA链。链。 由于由于DNADNA聚合酶聚合酶 具有校正功能，即通具有校正功能，即通过它的核酶外切酶的功能，能及时切除错过它的核酶外切酶的功能，能及时切除错配的碱基，使配的碱基，使DNADNA复制具有高度的保真性，复制具有高度的保真性，保证遗传信息的稳定性。保证遗传信息的稳定性。8182四、端粒四、端粒(telomere)(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNADNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持
38、染色体的稳定性 维持维持DNADNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNADNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNADNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G G、T T碱基碱基的短序列。的短序列。TTAGGGTTAGGGOH83端粒酶端粒酶(telomerase)(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTRRNA (human telomerase RNA, hTR) ) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human telomerase (human telomerase associat
39、ed protein 1, hTP1)associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse (human telomerase reverse transcriptase, hTRTtranscriptase, hTRT) ) 组成组成84爬行模型：爬行模型：858687端粒及端粒酶的意义：端粒及端粒酶的意义： 端粒的长短及端粒酶活性变端粒的长短及端粒酶活性变 化与细胞水平的老化化与细胞水平的老化(aging)(aging)及及 肿瘤的发生有一定关系。肿瘤的发生有一定关系。88五、逆转录五、逆转录 逆转录（逆转录
40、（reverse transcriptionreverse transcription）也）也称为反转录。它是指以称为反转录。它是指以RNARNA为模板，按照为模板，按照RNARNA分子中的核苷酸顺序，以分子中的核苷酸顺序，以dNTPdNTP为原料合为原料合成成DNADNA的过程。即将遗传信息从的过程。即将遗传信息从RNARNA到到DNADNA的的过程，这与遗传信息从过程，这与遗传信息从DNADNA到到RNARNA的转录过的转录过程相反。通过逆转录合成的程相反。通过逆转录合成的DNADNA称为互补称为互补DNADNA（complementary DNAcomplementary DNA，cDN
41、AcDNA）。）。89 催化逆转录反应的酶是逆转录酶催化逆转录反应的酶是逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase），也称为），也称为RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶（聚合酶（RNAdirected DNA RNAdirected DNA polymerasepolymerase，RDDPRDDP）, ,由一个由一个亚基和一个亚基和一个亚基组成的二聚体。逆转录酶以亚基组成的二聚体。逆转录酶以dNTPdNTP为为底物，需要一个具有底物，需要一个具有3-OH3-OH的引物，同时的引物，同时需要需要2 2价金属离子（细胞的酶以价金属离子（
42、细胞的酶以ZnZn2+2+为主，为主，病毒的酶以病毒的酶以MgMg2+2+为主）。逆转录酶为多功能为主）。逆转录酶为多功能酶，至少具有以下作用：酶，至少具有以下作用：1 1RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶作用：聚合酶作用：在有引物存在在有引物存在时，逆转录酶可以时，逆转录酶可以4 4种种dNTPdNTP为底物，以为底物，以RNARNA为模板，按为模板，按5353合成合成DNADNA，形成，形成RNA-RNA-DNADNA杂合体杂合体 即即RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶作用。聚合酶作用。902 2核酸酶核酸酶H H的活性即有核酸外切酶的作用。的活性即有核酸外切酶的作用。能特
43、异性地水解能特异性地水解RNA-DNARNA-DNA杂合体上的杂合体上的RNARNA，按按5353或或3535的方向均可进行，的方向均可进行，产物主要是产物主要是5-5-末端磷酸化的含末端磷酸化的含2 28 8个核个核苷酸残基的寡核苷酸。苷酸残基的寡核苷酸。3 3DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶作用：聚合酶作用： 同样在有引物存在时，逆转录酶也可以同样在有引物存在时，逆转录酶也可以4 4种种dNTPdNTP为底物，以为底物，以DNADNA为模板，按为模板，按5353合成合成DNADNA，形成双链，形成双链DNADNA产物即产物即DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶作用。聚合酶作
44、用。91逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链逆转录逆转录酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA92逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNAcDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链
45、。链。 试管内合成试管内合成cDNA93逆转录研究的意义逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNARNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了2020世纪初世纪初已注意到的病毒致癌理论。已注意到的病毒致癌理论。 94外因外因物理因素物理因素化学因素化学因素内因内因代谢过程代谢过程复制过程复制过程损伤损伤(突变突变)DNADNA分子的结分子的结构改变构改变自发突变自发突
46、变诱发突变诱发突变( (诱变诱变) )9596（一）突变的原因（一）突变的原因 能引起生物能引起生物DNADNA突变的理化因素或物质，突变的理化因素或物质，称为诱变剂（称为诱变剂（mutagenmutagen）。主要有：）。主要有：1 1物理因素：如紫外线、高能电离辐射等，物理因素：如紫外线、高能电离辐射等，紫外线可引起紫外线可引起DNADNA分子内相邻的两个胸腺嘧啶分子内相邻的两个胸腺嘧啶碱基之间交联而形成环丁烷基的结构即胸腺碱基之间交联而形成环丁烷基的结构即胸腺嘧啶二聚体。此外，也可形成其它的相邻嘧嘧啶二聚体。此外，也可形成其它的相邻嘧啶碱基之间的交联如啶碱基之间的交联如TCTC、CCCC
47、间。间。97982 2化学因素：种类繁多，按其对化学因素：种类繁多，按其对DNADNA作用的作用的不同途径和方式，可分为：不同途径和方式，可分为：1 1）直接作用于）直接作用于DNADNA分子使之化学结构发生改分子使之化学结构发生改变。主要有：变。主要有：a)a)亚硝酸盐类：亚硝酸能使亚硝酸盐类：亚硝酸能使DNADNA分子中的碱基分子中的碱基发生氧化脱氨（组成发生氧化脱氨（组成DNADNA的碱基中，除胸腺的碱基中，除胸腺嘧啶外，嘧啶外，A A、G G、C C都有氨基），在亚硝酸的都有氨基），在亚硝酸的作用下，作用下，A A、G G、C C分别转变为分别转变为I I、X X、U U。后。后者再按
48、以下方式改变者再按以下方式改变DNADNA的碱基配对：的碱基配对： A-T I-T I-C G-C A-T I-T I-C G-C C-G U-G U-A T-A C-G U-G U-A T-A99b b）烷化剂。烷化剂是临床上肿瘤化疗中的一）烷化剂。烷化剂是临床上肿瘤化疗中的一大类药物，它可提供甲基（或乙基）使碱大类药物，它可提供甲基（或乙基）使碱基发生烷基化，继而使碱基发生改变如使基发生烷基化，继而使碱基发生改变如使G-CG-C配对变为配对变为mGmG-T-T配对（配对（mGmG表示鸟嘌呤被甲表示鸟嘌呤被甲基化），继而变为基化），继而变为A-TA-T配对。此外，烷化剂配对。此外，烷化剂还可
49、使还可使DNADNA分子发生交联作用而妨碍复制过分子发生交联作用而妨碍复制过程；程；C C）吖啶类化合物包括溴化乙锭。可以嵌入）吖啶类化合物包括溴化乙锭。可以嵌入DNADNA分子内部，造成插入或缺失（见后），分子内部，造成插入或缺失（见后），发生移码突变（发生移码突变（frame shift mutationframe shift mutation）。）。1002 2）碱基类似物（）碱基类似物（base analogsbase analogs）。其结构与碱基相）。其结构与碱基相似，因而在似，因而在DNADNA复制过程中可取代与其结构类似的复制过程中可取代与其结构类似的碱基，使复制过程受阻或发生
50、错配。此外，许多碱基，使复制过程受阻或发生错配。此外，许多碱基类似物还可干扰核苷酸的合成过程如碱基类似物还可干扰核苷酸的合成过程如5-5-氟尿氟尿嘧啶（嘧啶（5-FU5-FU）、）、6-6-巯基嘌呤（巯基嘌呤（6-MP6-MP）。）。3 3）活化代谢物。在肝脏的生物转化作用过程中，某）活化代谢物。在肝脏的生物转化作用过程中，某些代谢物或摄入物经过生物转化可从无度、低毒些代谢物或摄入物经过生物转化可从无度、低毒转变为有毒性的化合物，其中，部分属于抗代谢转变为有毒性的化合物，其中，部分属于抗代谢物或改变物或改变DNADNA分子结构的物质（后者也称为基因毒分子结构的物质（后者也称为基因毒素，素，ge
