1、目目 录录目目 录录1第二十三章第二十三章 DNADNA操作的基本技术操作的基本技术The Basic Technologies for DNA Manipulations目目 录录2第一节第一节 核酸印迹技术与分子杂交核酸印迹技术与分子杂交Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization目目 录录3什么是核酸分子杂交什么是核酸分子杂交 核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization） 以以DNA的变性、复性为理论基础的变性、复性为理论基础 指具有一定同源序列的两条核酸单链（指具有一定同源序列的
2、两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程过复性处理后，形成异源双链的过程 目目 录录4一、一、Southern 印迹可用于分析基因印迹可用于分析基因拷贝数的变化拷贝数的变化 由由E. M. Southern在在1975年提出年提出 可用于分析基因拷贝数的变化可用于分析基因拷贝数的变化 基本操作过程包括基本操作过程包括 待测待测DNA样品的制备和基因探针的标记；样品的制备和基因探针的标记； 待测待测DNA样品的电泳分离；样品的电泳分离； 电泳分离的电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的经变性、转移、
3、固定到合适的固相支持物；固相支持物； 特异性核酸探针与膜上特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自片段杂交，放射自显影或显色检测目的显影或显色检测目的DNA的存在。的存在。 目目 录录5Southern印迹分析基本流程印迹分析基本流程滤纸NC膜凝胶滤纸电泳电泳 转移转移 杂交，显影杂交，显影酶切酶切DNADNA样品上样样品上样 DNADNA印迹印迹重物缓冲液目目 录录6二、二、Northern 印迹和印迹和RT-PCR可用于可用于分析基因转录水平的变化分析基因转录水平的变化 Northern blot是将是将RNA从凝胶中转印到硝从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，定性分析酸纤维素膜上，定性分析m
4、RNA的常用方的常用方法；法； RT-PCR是以是以mRNA为模板反转录合成为模板反转录合成cDNA、再以、再以cDNA为模板进行特异性扩增，为模板进行特异性扩增，进行进行RNA定性或定量分析的一种方法；定性或定量分析的一种方法； 二者均可用于分析基因转录水平的变化二者均可用于分析基因转录水平的变化 。目目 录录目目 录录目目 录录9FISH箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置箭头所示为杂交信号，结合带型分析可判断染色体位置目目 录录10（二）利用原位杂交技术确定特定基因的（二）利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位表达定位 RNA原位杂交原位杂交 整体原位杂交（整体原位杂交（Wh
5、ole mount in situ hybridization, WISH） 目目 录录11第二节第二节 聚合酶链式反应聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction目目 录录12什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由由K. Mullis于于1983年建立年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确
6、定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列的相互作用。的相互作用。 目目 录录13PCR技术的工作原理技术的工作原理53355335+55变性、退火变性、退火引物引物5335+55dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶不同长度新链不同长度新链DNA循环循环1+引物引物变性、退火变性、退火目目 录录142530 次循环后，模板次循环后，模板DNA得到扩增得到扩增5335+5335+5335+5335+dNTP Taq DNA 聚合酶聚合酶均一长度新链均一长度新链DNADNA循环循环2目目 录录15一、一、PCR技术分析基因及其产物技术分析基因及其产物 反转录反转录PCR（revers
7、e transcription PCR，RT-PCR）是将）是将RNA的反转录反应和的反转录反应和PCR反反应联合应用的一种技术。应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的因以及对已知序列的RNA进行定性及半定进行定性及半定量分析的最有效方法。量分析的最有效方法。 目目 录录16mRNA 5 AAAAAA(n) 3 mRNA 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 mRNA 5 cDNA 3 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 oligo(dT)12-
8、18反转录酶反转录酶RNase HDNA 聚合酶聚合酶S1 核酸酶核酸酶3 cDNATTTTTT(n) 5 AAAAAA(n) 3 TTTTTT(n) 5 反转录合成反转录合成cDNA目目 录录17二、二、PCR技术可以进行实时、技术可以进行实时、定量分析定量分析QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ 33557版目目 录录18三、三、PCR结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合免疫沉淀扩增与蛋白质结合的结合的DNA序列序列7版目目 录录19第三节第三节 DNA序列测定序列测定DNA Sequencing目目 录录20* DNA序列分析方法的演变和发展序列分析方法的演变
9、和发展 20世纪世纪70年代年代 双脱氧链终止法：双脱氧链终止法：F. Sanger 化学裂解法：化学裂解法：A. Maxam和和W. Gilbert 20世纪世纪80年代年代 PCR及自动测序技术及自动测序技术目目 录录21一、一、DNADNA序列分析有双脱氧链终止法和序列分析有双脱氧链终止法和化学裂解法化学裂解法 （一）（一）Sanger双脱氧链终止法利用双脱氧链终止法利用2，3 -双脱氧核苷酸掺入中双脱氧核苷酸掺入中 （二）（二）Maxam-Gilbert化学裂解法利用化化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基学试剂裂解修饰碱基止聚合反应止聚合反应 目目 录录22双脱氧链终止法双脱氧链终止法7
10、版目目 录录237版GATC 测序反应测序反应 电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极正极负极负极ddGddAddTddC目目 录录24DNA序列自动分析序列自动分析ddG红红ddTddA绿绿ddC蓝蓝橙橙毛细管电泳毛细管电泳荧光标记荧光标记DNA合成合成测序结果展示测序结果展示目目 录录25二、二、DNA序列分析可以揭示基因和序列分析可以揭示基因和基因组一级结构变化基因组一级结构变化 通过通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组序列分析可以鉴定基因和基因组的变异的变异 通过通过DNA序列测定分析人工重组
11、的基因序列测定分析人工重组的基因 通过通过DNA序列测定对定点突变进行确认序列测定对定点突变进行确认目目 录录26第四节第四节 DNA芯片技术芯片技术DNA Chip Technologies目目 录录27什么是什么是DNA芯片技术芯片技术 DNA芯片（芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡核苷酸或在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针，探针，与待测荧光标记样品进行杂交；与待测荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样通过对杂交信号的检测、比较和分析，得出样品的遗传信息品的遗传信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DN
12、A microarray)。目目 录录28基因芯片工作流程基因芯片工作流程7版目目 录录29一、利用一、利用DNA芯片技术可同时进行高通量芯片技术可同时进行高通量基因转录活性的分析基因转录活性的分析 cDNA芯片每个探针是芯片每个探针是cDNA片段或基因的片段或基因的一段一段PCR产物，可以同任何具有同源序列产物，可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体，同时定量监测大量基的样品形成杂交体，同时定量监测大量基因的表达。因的表达。 寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段为探针，每个基因有段为探针，每个基因有1020个相对应的探个相对应的探针，对低丰度基因表达水平
13、变化的检测具针，对低丰度基因表达水平变化的检测具有高度灵敏性。有高度灵敏性。 目目 录录30二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合二、染色质免疫共沉淀与芯片技术结合检测蛋白质检测蛋白质-DNA相互作用相互作用 染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀-芯片（芯片（chromatin immunoprecipitation-chip，ChIP-on-chip） 特异性地富集目的蛋白结合的特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，解交片段，解交联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，联后对目的片段进行纯化、扩增和荧光标记，再用于芯片分析；再用于芯片分析； 寻找特异性蛋白在基因组中的结合位点，获得寻找特异性蛋白在基
14、因组中的结合位点，获得蛋白质与蛋白质与DNA相互作用的信息。相互作用的信息。（一）（一）ChIP-on-chip的基本原理是染色质免疫的基本原理是染色质免疫共沉淀与芯片技术相结合共沉淀与芯片技术相结合目目 录录31ChIP-on-chip工作原理工作原理甲醛处理使细胞内蛋白质和甲醛处理使细胞内蛋白质和DNA交联交联 超声波打碎超声波打碎 特异性抗体免疫沉淀特异性抗体免疫沉淀目的目的DNA片段纯化、扩增片段纯化、扩增荧光标记和芯片检测荧光标记和芯片检测芯片数据分析芯片数据分析目目 录录32（二）采用两步模型法进行（二）采用两步模型法进行ChIP-on-chip数据分析数据分析 两步模型法（两步模
15、型法（two-step paradigm），可以从利用），可以从利用ChIP-on-chip获得的大量复杂数据中，经过聚类、获得的大量复杂数据中，经过聚类、挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可挖掘、分析，得到有效的数据及信息，特别是可以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信以获得大量的转录因子在基因组上结合位点的信息。息。 第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处第一步在获得的数据中抽取转录因子结合位点处5001 000 bp左右的序列信息，然后在这些序列中左右的序列信息，然后在这些序列中进行模式比对，寻找可能的模体（进行模式比对，寻找可能的模体（motif），获得），获得粗略的目的
16、数据集。粗略的目的数据集。 第二步对其进行数据挖掘和分析。第二步对其进行数据挖掘和分析。目目 录录33（三）（三）ChIP-on-chip适于适于DNA-核蛋白相互核蛋白相互作用及表观遗传学研究作用及表观遗传学研究 主要集中在两个领域：主要集中在两个领域： 第一，确定转录因子及其作用位点：第一，确定转录因子及其作用位点：能够将直接与能够将直接与蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学蛋白结合的基因作为靶点，数据可以直接用于生物信息学分析，更直接地识别转录因子结合元件。分析，更直接地识别转录因子结合元件。 第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观遗传第二，确定基因表观遗传修饰，应用于表观
17、遗传学研究。学研究。 表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰表观遗传学的主要研究内容包括甲基化，组蛋白修饰和染色质重塑等。和染色质重塑等。 ChIP-on-chip技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分技术可提供基因编码区中组蛋白甲基化分布模式的信息：布模式的信息：CpG岛表达序列标签芯片，可以显示岛表达序列标签芯片，可以显示基因组内基因组内CpG甲基化和组蛋白修饰之间的联系甲基化和组蛋白修饰之间的联系目目 录录34三、芯片技术的发展三、芯片技术的发展蛋白质芯片和蛋白质芯片和组织芯片组织芯片 蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力蛋白质芯片技术是研究蛋白质组学的有力工具工具 蛋白质检测芯片
18、蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 组织芯片是以形态学为基础进行高通量检组织芯片是以形态学为基础进行高通量检测基因表达信息的芯片技术测基因表达信息的芯片技术多组织片多组织片组织阵列组织阵列组织微阵列组织微阵列 目目 录录35第五节第五节 酵母及哺乳动物细胞杂交系统酵母及哺乳动物细胞杂交系统Yeast and Mammalian Hybrid Systems目目 录录36一、酵母双杂交探测蛋白一、酵母双杂交探测蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用 酵母双杂交系统（酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）由由S. Fields 和和O. Song 于于1989年提出
19、并初步年提出并初步建立建立目目 录录37酵母双杂交技术的基本原理酵母双杂交技术的基本原理目目 录录38（一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测（一）酵母双杂交系统利用报告基因的表达探测蛋白蛋白-蛋白的相互作用蛋白的相互作用（二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定（二）酵母双杂交可通过蛋白质相互作用鉴定/分离新的相互作用蛋白及其编码基因分离新的相互作用蛋白及其编码基因（三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统（三）哺乳动物双杂交系统是在酵母双杂交系统基础上发展的基础上发展的目目 录录39二、酵母单杂交系统需要构建二、酵母单杂交系统需要构建“报告报告”细胞细胞 酵母单杂交技术（酵母单杂交技术（y
20、east one-hybrid）由）由J. Li于于1993年从酵母双杂交技术发展而来年从酵母双杂交技术发展而来 是体外分析是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一与细胞内蛋白质相互作用的一种方法；种方法； 通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。 目目 录录40酵母单杂交技术的基本原理酵母单杂交技术的基本原理目目 录录41三、蛋白质三、蛋白质-RNA相互作用也可采用酵母相互作用也可采用酵母三杂交系统进行分析三杂交系统进行分析 酵母三杂交系统（酵母三杂交系统（yeast
21、three-hybrid system）于）于1996年由年由D.J.SenGupta等首先报等首先报道道（一）用于蛋白质（一）用于蛋白质-RNA相互作用分析的酵母相互作用分析的酵母三杂交系统需要杂合三杂交系统需要杂合RNA 目目 录录42酵母三杂交基本原理酵母三杂交基本原理 目目 录录43（二）酵母三杂交系统应用范围广泛（二）酵母三杂交系统应用范围广泛 可进行与特定蛋白结合的未知可进行与特定蛋白结合的未知RNA的筛选；的筛选； 确定确定RNA-蛋白质相互作用的结构域；蛋白质相互作用的结构域； 鉴定、分离能够识别具有重要生理功能鉴定、分离能够识别具有重要生理功能RNA的的RNA结合蛋白。结合蛋白。
