1、巴氏染色巴氏染色n巴氏染色是人体和动物脱落细胞学最常用的染色方法之一，广泛应用于呼吸系统、泌尿系统及女性生殖系统等脱落细胞学的诊断及微生物感染的鉴定等领域，特别在宫颈脱落细胞学诊断方面更具有独到之处。巴氏染色的优点n1、颜色鲜艳多彩n2、细胞结构清晰n3、胞质颗粒分明n4、透明度好等巴氏染色的不足n1、配置过程复杂n2、染色步骤繁琐n3、染液质量不稳定等（影响染色的主要原因）巴氏染色的组成n苏木素n桔黄GnEA50（EA36）等EA50EA50简介nEA50的组成：伊红，亮绿，磷钨酸n影响EA50的主要因素：EA染液的PH值巴氏染液原理n蛋白质所带正负电荷的多少是随染液的PH值而改变，在偏碱环
2、境中蛋白质的羧基游离增多（带负电），在偏碱环境中氨基游离增多（带正电）。氨基酸结构通式 氨基酸三维结构巴氏染液原理n苏木素染色原理：苏木素是碱性染料，能与细胞核内的主要化学成分脱氧核糖核酸结合而呈紫蓝色。 苏木素结构墨水树巴氏染液原理n桔黄G：是一种小分子染料，能够很快地作用于胞浆。n作用：使宫颈、阴道上皮中非正常角化细胞和角化型鳞癌细胞的胞浆呈鲜艳的橘黄色。 桔黄G巴氏染液原理n伊红、亮绿：属于酸性染料，其发色团为负离子，发色团可与蛋白质中带正电荷的氨基结合，而使胞浆显蓝色、绿色或红色。巴氏染液原理n伊红染料作用于成熟鳞状细胞的胞浆、核仁，染色结果呈粉红色。n亮绿染料作用于代谢活跃的细胞，如
3、鳞状上皮副基底层和中层细胞、柱状上皮细胞，染色结果呈绿色或蓝绿色。伊红结构式巴氏染液原理n磷钨酸：酸性质子的位置不同，酸性强度也不同，其中位于桥氧的酸性质子具有超强酸性，其酸性甚至超过浓硫酸。n作用：1、作为媒染剂 2、作为弱酸缓冲剂磷钨酸结构式巴氏染液的影响因素-PH-PHn较高PH值：细胞质红染减少，绿染增多n较低PH值：细胞质红染增多，绿染减少巴氏染液的存放n染液保存在阴凉干燥的地方，避免阳光直射。阳光或过高的温度不仅造成染料过早失效，还会引起染液PH值降低。经典巴氏染色结果n胞核染为深蓝色；n鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染绿色，n表层不全角化细胞胞质染粉红色，n完全角化细胞胞
4、质呈桔黄色；n细菌：灰色；滴虫：淡蓝灰色；n黏液：淡蓝色或粉红色；n中性粒细胞和淋巴细胞、吞噬细胞胞质均为蓝色；n红细胞染粉红色；n高分化鳞癌细胞可染成粉红色或桔黄色；n腺癌胞质呈灰蓝色。 简易巴氏染色步骤n将刚离心好的TCT玻片放入95%的酒精15min以上（此步骤为湿固定，TCT玻片不能用吹风机吹干）n70%酒精15sn50%酒精15sn自来水水洗n苏木素染色n1%盐酸分化n0.5%氨水蓝化n自来水洗n0.2%磷钨酸水溶液1Minn简易EA工作液5minn95%酒精清洗n100%酒精清洗n吹干，封片简易巴氏染色n简易简易EA染色液的配置：染色液的配置：n亮绿S.F ：0.72g 水溶性伊红
5、 ：1.08g 蒸馏水：600ml 三者混合摇匀，让两种燃料充分溶解n0.2%磷钨酸：0.2g磷钨酸粉末 100ml蒸馏水简易EA染色结果细胞核：呈蓝色基底层、中层、表层角化前细胞质：蓝绿色表层细胞质：红色挖空细胞辨认清晰念珠细菌：紫红色滴虫细胞质：浅绿色、细胞核深蓝色阴道杆菌：紫蓝色。简易巴氏染色注意事项n固定：用95酒精固定液固定的细胞学标本一定一定使用湿固定法。制片制备完后，趁标本新鲜而又湿润时，立即放入盛有95 酒精的固定缸内。制片在固定液内至少保持15-30min 。n湿固定的重要性：标本在新鲜时及时固定是保证染色效果的重要因素。如苏木素对细胞核的染色，巴氏染色中胞浆的特殊着色作用，
6、均可因标本干燥后固定而大受影响 。简易巴氏染色注意事项n磷钨酸水溶液越新鲜或作用时间越长，则胞质蓝绿色调越强，当作用太强时分色效果差，因此，本法的磷钨酸水溶液的作用时间要灵活掌握。简易巴氏染色使用期限n0.2%的磷钨酸水溶液在染250张TCT后更换。n每600mlEA可染8000张TCT片。染色不佳常见原因及解决方法n1、细胞核着色不佳、细胞核着色不佳n（1）细胞核着色过浅：）细胞核着色过浅： n1）盐酸分化时间过长或苏木素染液时间过长。需要缩短分化时间或延长碱化时间；每日加入少量新鲜苏木素染液或重新配制苏木素液。 n2）在固定之前制片干燥。所以对巴氏染色的制片需要严格遵守湿固定的原则。 n3
7、）自来水的PH值偏酸性。使用碱性溶液。 n（2）细胞核着色过深：）细胞核着色过深： n1）盐酸溶液浓度不够。适当加入几滴盐酸以增加浓度。 n2）制片用高于95以上浓度的酒精固定后可以出现染色过深。应用95酒精固定。 染色不佳常见原因及解决方法n2、细胞浆着色不佳、细胞浆着色不佳（1）如果全片内胞浆都淡染，则需要延长染色时间或更换新液。 （2）如果胞浆不分色，均为浅红色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌样细菌影响胞浆染色。此情况可以适当增加染色时间能够部分纠正不分色状况。 （3）胞浆染成灰色或紫色，是由于苏木素染色时间过长或盐酸分化不佳。经过褪色后重新苏木素可以纠正。 （4）由于标本的不同，同样配方的EA染液可造成偏蓝、偏绿和偏红，对不同的标本应该使用不同的EA染液。一般认为，EA36和EA50用于妇科标本，而EA65或改良EA用于非妇科标本。 （5）胞浆不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰当所致。如染色为红色，可以加少许磷钨酸溶液纠正；如染色均为蓝色或绿色，可以加少许饱和碳酸锂溶液纠正。经典与简易巴氏染色的比较n经典巴氏染色缺点：使用的染料种类多，配置过程复杂，影响因素多，易出现沉淀物，染液容易过期。n简易巴氏染色优点：颜色鲜艳，细胞结构清晰，染液可长期使用，不容易出现染料沉淀物，不容易失效，配置简单，易操作，减少成本。
