1、企业生产过程微生物企业生产过程微生物污染控制实例分析污染控制实例分析-无菌制剂生产过程微生物菌库的建立和种属鉴定一、立项目的一、立项目的二、采样方案二、采样方案三、试验材料及仪器设备三、试验材料及仪器设备四、鉴定方法四、鉴定方法五、鉴定结果五、鉴定结果六、结果分析六、结果分析七、讨论七、讨论 （1）为了了解无菌制剂生产过程中微生物污染情况，即微生物种类及分布情况，实现生产环境微生物、操作过程微生物与药品中污染微生物的比较和溯源分析，以便达到生产过程微生物实时有效动态控制目的。从而满足药品GMP对无菌制剂生产过程中微生物污染的监测和控制要求。 （2）生产企业也可以利用这些数据，对无菌制剂生产过程
2、进行微生物风险评估。一、立项目的立项目的 1. 1. 采样区域的确定采样区域的确定 2.2.采样对象及方式的确定采样对象及方式的确定 3.3.采样频次的确定采样频次的确定二、采样方案二、采样方案n根据车间的面积、房间数，考虑到可能影响到产品质量的关键区域及易于受到微生物污染的关键部位的分布，设定了监测点及采样方案。 企业按照中国新版药品GMP的要求，将洁净区划分为A级（动态100级）、B级（静态100级）、C级（10000级）、D级（100000级）。n微生物采样点分布图见图1和图2。其中一车间采样点共39个，二车间采样点共98个。1. 1. 采样区域的确定采样区域的确定1. 1. 采样区域的
3、确定（一车间）采样区域的确定（一车间）1. 1. 采样区域的确定（二车间）采样区域的确定（二车间）n人员：手套印记 表面接触（头、胸、 手腕、肘、膝盖）n环境：沉降菌（ A级、B级、 C级） 浮游菌（A级、B级）2.2.采样对象及方式的确定采样对象及方式的确定n企业根据生产情况和制剂车间的使用频次按季度制定采样频次 ，共收集4个季度的样本。3.3.采样频次的确定采样频次的确定 1 1样本来源样本来源 2 2培养基培养基 3 3仪器设备仪器设备 4 4试剂试药试剂试药三、试验材料及仪器设备三、试验材料及仪器设备 1 1样本来源样本来源 无菌制剂一车间和二车间无菌制剂一车间和二车间286286份样
4、本份样本 2 2培养基培养基 胰酪胨大豆琼脂培养基（胰酪胨大豆琼脂培养基（TSATSA），批号：），批号：12219651221965，BDBD公司；公司； 麦康凯琼脂（麦康凯琼脂（MacMac），批号：），批号：1108423, BD1108423, BD公司；公司； MRSMRS琼脂，批号：琼脂，批号：100915100915，北京陆桥技术有限，北京陆桥技术有限责任公司责任公司 三、试验材料及仪器设备三、试验材料及仪器设备 3 3仪器设备仪器设备 全自动微生物生化鉴定仪（全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Viteck 2 CompactCompact）：法国生物梅里埃公司；）：法国
5、生物梅里埃公司； 麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司；麦氏浊度比浊仪：法国生物梅里埃公司； BX 41 BX 41 光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司；光学成像显微镜：日本奥林巴斯公司； 卡玛薄层色谱成像仪卡玛薄层色谱成像仪: :瑞士瑞士CAMAGCAMAG卡玛公司。卡玛公司。 APIAPI RP RP三、试验材料及仪器设备三、试验材料及仪器设备 4 4试剂试药试剂试药 革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科革兰氏染色液：青岛高科园海博生物科技有限公司；技有限公司； GNGN鉴定卡、鉴定卡、GPGP鉴定卡、鉴定卡、BCLBCL鉴定卡、鉴定卡、YSTYST鉴定卡、鉴定卡、ANCANC鉴定卡：法国生物梅
6、鉴定卡：法国生物梅里埃公司。里埃公司。 APIAPI RP RP三、试验材料及仪器设备三、试验材料及仪器设备 鉴定流程图鉴定流程图 四、鉴定方法四、鉴定方法 1. 1.菌种的纯化与复壮菌种的纯化与复壮 采集的微生物可能在物理的、化学的消杀条件下暴露了较长时间，菌株本身可能存在一定的损伤和变异 ，有必要对送检菌株进行复壮和再次纯化。 首选的复壮及纯化培养基为胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA）;对于革兰氏阴性菌，在无法与革兰氏阳性菌区分的情况下，也会选择MaC琼脂作为纯化培养基；对于较难培养的菌株，也采用血平板、改良MRS琼脂等进行纯培养。四、鉴定方法四、鉴定方法 四、鉴定方法四、鉴定方法短小芽孢杆菌
7、短小芽孢杆菌溶血葡萄球菌四、鉴定方法四、鉴定方法施氏假单胞菌四、鉴定方法四、鉴定方法2.2.革兰氏染色及镜检革兰氏染色及镜检 表皮葡萄球菌四、鉴定方法四、鉴定方法2.2.革兰氏染色及镜检革兰氏染色及镜检缓慢芽孢杆菌四、鉴定方法四、鉴定方法2.2.革兰氏染色及镜检革兰氏染色及镜检施氏假单胞菌四、鉴定方法四、鉴定方法3.3.生化鉴定生化鉴定 （1）采用全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact），根据革兰染色结果选择鉴定卡。 （2）将24小时培养物，用0.45%无菌氯化钠溶液制备一定浊度的菌悬液，将64个生化反应集成到Viteck鉴定卡上，一般2-10小时左右给出鉴定结果 。 （3）
8、结果判断：相似度96%-99%为极好，95%-92%为较好，91%-89%为好，88%-85%为可以接受，85%以下的相似度为低分辨率的鉴别。对于只鉴定到属的鉴别，还需根据提示信息进行补充试验，进一步甄别到种。 四、鉴定方法四、鉴定方法n（一）人员环境总体结果n一车间：110株 其中：人员67株 环境43株n二车间：182株 其中：人员133株 环境49株n总计：292株，其中阳性球菌109株（37.3%） 阳性芽孢杆菌 114株（39.0%） 阳性无芽孢杆菌 22株（7.5%） 阴性杆菌 39株（13.4%） 2010-122010-12-1五、鉴定结果五、鉴定结果n( (二二) )不同区域
9、结果不同区域结果 一车间主要区域一车间主要区域五、鉴定结果五、鉴定结果分装分装灌装区灌装区（B B级）级）人员人员环境环境金黄色葡萄球菌溶血葡萄球菌头状葡萄球菌蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌泛菌属少动鞘氨醇单胞菌,短小芽孢杆菌花域芽孢杆菌解淀粉/萎缩/枯草芽孢杆菌缓慢芽孢杆菌解淀粉类芽孢杆菌 变异库克菌等溶血葡萄球菌腐生葡萄球菌木糖葡萄球菌表皮葡萄球菌人葡萄球菌藤黄微球菌/里拉微球菌苏云金芽孢杆菌少动鞘氨醇单胞菌嗜麦芽寡养单胞菌巨大芽孢杆菌等 n( (二二) )不同区域结果不同区域结果 一车间主要区域一车间主要区域五、鉴定结果五、鉴定结果调剂区调剂区（C C级）级）人员人员环境环境人葡萄球菌/腐生
10、葡萄球菌溶血葡萄球菌表皮葡萄球菌科氏葡萄球菌科氏亚种苛养颗粒链菌/藤黄微球菌/里拉微球菌藤黄微球菌/里拉微球菌施氏假单胞菌缺陷短波单胞菌/泡囊短波单胞菌泛菌属浅黄假单胞菌马耳他布鲁菌非脱羧勒菌少动鞘氨醇单胞菌/杀鲑气单胞菌巨大芽孢杆菌鲍曼不动杆菌蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌解脲棒杆菌克氏库克菌铫子短小芽孢杆菌 短小芽孢杆菌等短小芽孢杆菌耳炎差异球菌/玫瑰色库克菌（采样少） ( (二二) )不同区域结果不同区域结果 二车间主要区域二车间主要区域五、鉴定结果五、鉴定结果调剂区调剂区（B B级级） 人员人员 环境环境头状葡萄球菌藤黄微球菌/里拉微球菌4溶血葡萄球菌腐生葡萄球菌金黄色葡萄球菌/中间葡萄球
11、菌山羊葡萄球菌表皮葡萄球菌3花域芽孢杆7枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌11巨大芽孢杆菌2坚强芽孢杆菌2肠膜明串珠菌乳脂亚种缓慢芽孢杆菌5枯草/解淀粉/萎缩/花域芽孢杆菌地衣芽孢杆菌波茨坦短小芽孢杆菌玫瑰色库克菌杀鲑气单胞菌/奈瑟菌属西宫皮球菌/坐皮肤球菌少动鞘氨醇单胞菌蜡样/蕈状/苏云金芽孢杆菌枯草芽孢杆菌铫子短小芽孢杆菌等人葡萄球菌沃氏葡萄球菌金黄色葡萄球菌2头状葡萄球菌藤黄微球菌/里拉微球菌模仿葡萄糖球菌非脱羧勒菌植生拉乌尔菌克氏库克菌酸土脂环酸芽孢杆菌短小芽孢杆菌地衣芽胞杆菌简单芽孢杆菌鲍曼不动杆菌乳酸杆菌解淀粉/萎缩/枯草芽孢杆菌巨大芽孢杆菌等 ( (二二) )不同区域结果不同区域结果 二
12、车间主要区域二车间主要区域五、鉴定结果五、鉴定结果分装灌分装灌装区装区（B B级）级） 人员人员 环境环境沃氏葡萄球菌金黄色葡萄球菌溶血葡萄球菌2藤黄微球菌/里拉微球菌8鲁氏不动杆菌/少动鞘氨醇单胞菌/杀鲑气单胞菌枯草芽孢杆菌2枯草/解淀粉/萎缩芽孢杆菌2花域芽孢杆菌地衣芽孢杆菌施氏假单胞菌短小芽孢杆菌4缓慢芽孢杆菌2蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌巨大芽孢杆菌等藤黄微球菌/里拉微球菌鲁氏不动杆菌铜绿假单胞菌蜡样/苏云金/蕈状芽孢杆菌2波茨坦芽孢杆菌枯草芽孢杆菌史密氏芽孢杆菌缓慢芽孢杆菌等 n（三）不同季节鉴定结果n第一季度： n本季度阳性芽孢杆菌的检出率最高，达到了44.9%；阳性球菌的检出率居第
13、2位为43.5%，阳性杆菌的检出率为7.2%，阴性杆菌的检出率为4.3%。五、鉴定结果五、鉴定结果n（三）不同季节鉴定结果n第二季度： n在本季度，阳性芽孢杆菌的种群占据绝对优势地位，为54.2%；阳性球菌的检出率为33.6%；阳性无芽孢杆菌和阴性杆菌的检出率均为5.6%。五、鉴定结果五、鉴定结果n（三）不同季节鉴定结果n第三季度： n在本季度，阳性球菌的检出率为38.3%，阴性杆菌检出率为31.7%，阳性芽孢杆菌检出率为16.7%， 阳性无芽孢杆菌检出率为6.7%。五、鉴定结果五、鉴定结果n（三）不同季节鉴定结果n第四季度： n本季度阳性球菌的检出率为35.7%，阴性杆菌的检出率为21.4%
14、，阳性芽孢杆菌的检出率为26.8%，阳性无芽孢杆菌的检出率为12.5%。 五、鉴定结果五、鉴定结果食品微生物方法标准食品微生物方法标准n1、生产过程微生物污染结果分析 通过以上样本鉴定结果，可以看出，生产过程微生物污染主要来源于人员及人员不当的操作过程。环境的微生物种类与人员表面微生物种类基本一致，主要是革兰阳性的葡萄球菌属和革兰阳性的芽孢杆菌。六、结果分析六、结果分析n2.不同季节微生物污染趋势变化n一车间：n从2010年第3季度到2011年第2季度，一车间革兰氏阳性球菌检出率始终维持在40%50%的区间范围内；革兰氏阳性无芽孢杆菌检出率在10%上下徘徊；放线菌、霉菌、酵母菌仅在2010年第
15、3季度零星检出；革兰氏阳性芽孢杆菌呈现逐步上升的趋势；革兰氏阴性杆菌呈现逐步下降的趋势。六、结果分析六、结果分析n2.不同季节微生物污染趋势变化n二车间：n从2010年第4季度到2011年第2季度，二车间革兰氏阳性球菌检出率在30%50%的区间范围内；革兰氏阳性无芽孢杆菌检出率在10%上下徘徊；放线菌在2010年第4季度和2011年第2季度零星检出；革兰氏阳性芽孢杆菌呈现逐步上升的趋势；革兰氏阴性杆菌呈现逐步下降的趋势。 六、结果分析六、结果分析n2.不同季节微生物污染趋势变化n1）在第一、二季度，阳性芽孢杆菌的种群优势明显。 原因分析：北方的第一、二季度由于天气寒冷干燥，一些在夏秋容易滋生的
16、微生物，如革兰氏阴性细菌、霉菌和酵母菌的营养体在空气中明显减少，而芽孢杆菌的休眠体（芽孢）则相对增多；另一方面，冬春两季北方的大气质量较差，空气中悬浮的尘埃粒子较多，芽孢可以随尘埃迁入洁净区甚至空调净化设备中，并长期驻留。n2）四个季节阳性球菌的种群和所占比例基本一致。 提示：阳性球菌的种群受季节性因素影响较小。六、结果分析六、结果分析n2.不同季节环境微生物鉴定结果分析 ：n3）在第三季度（夏季），阴性杆菌的检出率较高，阳性芽孢杆菌的检出率为四个季度中的最低。 提示：夏季优势菌群为阳性球菌和阴性杆菌。六、结果分析六、结果分析n1. 1.主要微生物污染源主要微生物污染源 通过上述分析，296株
17、菌中有200株来自于人员表面接触皿，可见得无菌制剂生产过程微生物最大的污染源就是人，人员的数量和活动将直接影响着整个洁净区的环境质量。提示要严格控制操作人员的卫生状况和无菌操作技术。n2.2.根据微生物分布情况，制定合理的控制措施根据微生物分布情况，制定合理的控制措施 通过上述分析，根据不同季节的生产过程微生物的主要种群分布趋势，选择适宜的消杀方法和适当的控制措施，达到更好控制人员和生产环境的目的。七、讨论七、讨论n3.3.方法尚存在问题，有待进一步改进方法尚存在问题，有待进一步改进 本次考察是对无菌制剂生产过程微生物污染情况的初步探索研究，主要采用法国生物梅里埃全自动微生物生化鉴定仪（Viteck 2 Compact）进行鉴定，由于数据库的原因，一些革兰阳性无芽孢杆菌很难鉴定。另外还存在需进一步进行生化实验的由于时间关系而未进行的情况。七、讨论七、讨论n4.4.对微生物溯源分析的认识对微生物溯源分析的认识 建立菌库的目的是发现微生物污染规律，更好地进行生产过程的控制。但要达到溯源分析的目的需要在现有环境微生物数据库基础上建立基于基因分型的数据库，方能真正实现生产环境微生物与药品中污染微生物的比较和溯源之目的。七、讨论七、讨论 感谢聆听！谢谢！感谢聆听！谢谢！
