1、1第四章 蛋白质化学（Chemistry of Protein)2导 学1.掌握蛋白质的分子组成与结构掌握蛋白质的分子组成与结构2.熟悉蛋白质的理化；常用分离、纯化技术的熟悉蛋白质的理化；常用分离、纯化技术的基本原理。基本原理。3.了解蛋白质分子结构与功能的关系；蛋白质了解蛋白质分子结构与功能的关系；蛋白质的分类以及重要的活性肽。的分类以及重要的活性肽。3教学内容l 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成l 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构l 蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化l蛋白质的分类蛋白质的分类4第一节 蛋白质的分子组成一、蛋白质元素组成：一、蛋白质元素组成：CHOS5二、
2、蛋白质的基本组成单位氨基酸 H2N - C - HCOOHR H3N - C - HCOOR+_6氨基酸结构特点：l20种编码氨基酸种编码氨基酸l氨基酸的不同在于氨基酸的不同在于R侧链不同侧链不同l均为均为L-氨基酸氨基酸l（甘氨酸、脯氨酸除外）（甘氨酸、脯氨酸除外）7（二）氨基酸的分类1.非极性中性氨基酸非极性中性氨基酸2.极性中性基氨基酸极性中性基氨基酸3.极性酸性氨基酸极性酸性氨基酸4.极性碱性氨基酸极性碱性氨基酸R基有极性，但不带电，呈亲水性R基无极性，呈疏水性R基有极性，电离后R基带负电荷R基有极性，电离后R基带正电荷8非极性中性氨基酸NHCH32CH29极性中性氨基酸Cys，10酸
3、性氨基酸酸性氨基酸11碱性氨基酸碱性氨基酸H2N-C-NH=NH12（三）氨基酸的理化性质氨基酸具有氨基酸具有氨基氨基、羧基羧基等等能电离能电离出出H H+ +而成而成COOCOO- -具酸性具酸性1.两性电离和等电点13氨基酸的两性电离142.茚三酮反应 脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物黄色化合物15三、肽 （一）肽的形成和命名（一）肽的形成和命名 肽键的形成肽键的形成16肽键平面172.肽的形成与命名l肽、寡肽肽、寡肽(oligopeptide)、多肽、多肽(polypeptide)l多肽链（多肽链（polypeptide chain）l主链骨架（
4、主链骨架（backbone）l侧链部分（侧链部分（side chain）l羧基末端或羧基末端或C-末端（末端（C-terminus）l氨基末端或氨基末端或N-末端（末端（N-terminus）18多肽链的结构 侧链侧链N-末端末端C-末端末端主链骨架主链骨架HOH19（二）体内重要的肽 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）的结构）的结构Glu-Cys-Gly功能基：功能基：-SH-SH解毒剂、抗氧化剂解毒剂、抗氧化剂20第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构基本结构基本结构空间结构空间结构一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构21一、一级结构l概念：多肽链中
5、氨基酸的组成与排列顺序概念：多肽链中氨基酸的组成与排列顺序l主键：肽键主键：肽键l意义：决定蛋白质的空间结构意义：决定蛋白质的空间结构22胰岛素的一级结构A链链B链链23二、二级结构 （secondary structure）l定义定义 蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转，构成蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转，构成的局部空间构象。的局部空间构象。 24（一）二级结构的类型l-螺旋螺旋l-折叠折叠l-转角转角l无规则卷曲无规则卷曲251.-螺旋（-helix）0.50nm0.54nm氢键氢键-碳原子碳原子侧链侧链262. -折叠 （-sheet）平行平行俯视俯视侧视侧视反平行反平行俯视俯视侧视
6、侧视273.-转角（ -turn）284无规卷曲（random coil）l肽链的肽键平面不规则排列，形成松散的二级肽链的肽键平面不规则排列，形成松散的二级结构。结构。29（二）超二级结构与结构域 超二级结构（超二级结构（super secondary structure）l二级结构单元进一步聚集和组合在一起二级结构单元进一步聚集和组合在一起模模序（序（motif）l如如、等等 亮氨酸拉链和锌指结构亮氨酸拉链和锌指结构 30（二）超二级结构与结构域结构域（结构域（domain）l超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区域。域。l是蛋白质的功能部位是蛋白质
7、的功能部位31免疫球蛋白结构域 重链重链轻链轻链结构域结构域32三、三级结构 （tertiary structure）l定义：定义： 在二级结构基础上，所有原子（主链在二级结构基础上，所有原子（主链+ +侧链）侧链）相互作用形成的空间构象相互作用形成的空间构象 33三、三级结构 （tertiary structure）l化学键化学键-氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键-亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部亲水基团：分子表面；疏水基团：分子内部34三级结构示意图二硫键二硫键极性基团极性基团 离子键离子键 35四、四级结构 （quaternary struc
8、tre）亚亚基基36血红蛋白四级结构示意图4个亚基构成个亚基构成2-亚基亚基2-亚基亚基37 蛋白质一、二、三、四级结构示意图38五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键 l氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等39蛋白质分子中的主要次级键 氢氢 键键 范德华力范德华力 40六、蛋白质结构与功能的关系l蛋白质的一级结构决定其高级结构蛋白质的一级结构决定其高级结构l蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。41（一）一级结构与功能的关系 l某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物学活某些蛋白质的一级结构加工后，才具有生物
9、学活性。性。l如胰岛素原（如胰岛素原（proinsulinproinsulin）的一级结构加工）的一级结构加工 42（一）一级结构与功能的关系l一级结构的改变可引起某些疾病的发生一级结构的改变可引起某些疾病的发生l由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病，称为分子病（分子病（molecular diseasemolecular disease）。l如镰状红细胞性贫血如镰状红细胞性贫血 43（二）空间结构与功能的关系 l空间构象决定蛋白质功能空间构象决定蛋白质功能l构象改变，功能改变构象改变，功能改变44血红蛋白结合氧前后构象的变化 l 当血红蛋白结合氧
10、以后，当血红蛋白结合氧以后，1 11 1与与2 22 2两个两个二聚体彼此滑动二聚体彼此滑动1515，其构象由，其构象由T T（tensetense）型）型转变为转变为R R（relaxedrelaxed）型。）型。Hb (T态态)HbO2 (R态态)11221545任何一个亚基接受任何一个亚基接受氧氧分子后，会增进其它亚基吸附分子后，会增进其它亚基吸附氧氧分子的能力分子的能力环境氧浓度高时环境氧浓度高时Hb快速吸收氧分子快速吸收氧分子环境氧浓度低时环境氧浓度低时Hb快速释出氧分子快速释出氧分子动脉动脉静脉静脉血红蛋白对氧的运输血红蛋白对氧的运输46第三节 蛋白质的理化性质与分离纯化 47一、
11、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的一般性质（一）蛋白质的一般性质 1.蛋白质的紫外吸收特征蛋白质的紫外吸收特征蛋白质（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸）蛋白质（色氨酸、酪氨酸）（苯丙氨酸） =280nm =260nm 紫外吸收（与蛋白质浓度成正比）紫外吸收（与蛋白质浓度成正比）48蛋白质的紫外吸收10,000100010010 200 250 300波长（波长（nm）TrpPheTyr摩尔吸光度（摩尔吸光度（M-1cm-1）492.蛋白质的两性电离和等电点 l与氨基酸的两性电离、等电点相同与氨基酸的两性电离、等电点相同50l双缩脲反应：双缩脲反应： Cu2+ 蛋白质蛋白质 紫色络合物紫色络合物 OH-3
12、.蛋白质的呈色反应 513.蛋白质的呈色反应 l酚试剂反应：酚试剂反应： 磷钨酸磷钨酸 蛋白质蛋白质 蓝色化合物蓝色化合物 磷钼酸磷钼酸52l米伦试剂反应：米伦试剂反应： 米伦试剂米伦试剂 蛋白质蛋白质 红色沉淀红色沉淀 3.蛋白质的呈色反应 53l考马斯亮蓝反应：考马斯亮蓝反应： 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 蛋白质蛋白质 （R-250）红蓝色红蓝色 （G-250）蓝绿色蓝绿色3.蛋白质的呈色反应 54（二）蛋白质的高分子性质 1.1.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质l蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围(1(1100nm)100nm)l蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液蛋白质
13、溶液是稳定亲水胶体溶液l稳定因素：水化膜、同种电荷稳定因素：水化膜、同种电荷55碱碱 碱碱酸酸 酸酸 562.蛋白质的扩散与沉降l蛋白质分子大，扩散速度慢蛋白质分子大，扩散速度慢l沉降：通过超速离心克服布朗运动使沉降：通过超速离心克服布朗运动使 蛋白质颗粒下沉的现象蛋白质颗粒下沉的现象 l沉降系数（沉降系数（S）可粗略反映蛋白质分子大小可粗略反映蛋白质分子大小573.蛋白质的变性与复性 58复性：去除变性因素，蛋白质恢复空间构象复性：去除变性因素，蛋白质恢复空间构象 与生物学活性的过程与生物学活性的过程3.蛋白质的变性与复性59核糖核酸酶的变性与复性示意图8M尿素或尿素或-巯基乙醇巯基乙醇透析
14、透析60l某些蛋白质在发生热变性后，松散的多肽链相某些蛋白质在发生热变性后，松散的多肽链相互缠绕在一起，变成固体状态，称为蛋白质的互缠绕在一起，变成固体状态，称为蛋白质的凝固凝固（coagulation）。 61二、蛋白质的分离纯化鉴定技术 蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及其它小分子物质结合在一起，需要对其进行分其它小分子物质结合在一起，需要对其进行分离、纯化与鉴定。离、纯化与鉴定。62（一）离心l原理：分子大小、密度不同原理：分子大小、密度不同沉降速度不同沉降速度不同l分类：分类： 普通离心：普通离心：310 kr/min 高速离心：高速离心：1025
15、 kr/min 超速离心：超速离心：25 kr/minl常用常用S值表示蛋白质分子质量相对大小值表示蛋白质分子质量相对大小63（二）透析 (dialysis)l用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分开的方法用透析袋（半透膜）把大分子和小分子分开的方法64（三）沉淀(precipitation)l定义：定义：蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象l原理：原理：破坏同种电荷和水化膜破坏同种电荷和水化膜65蛋白质的沉淀示意图66（三）沉淀(precipitation)l方法：方法： 盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂沉
16、淀法生物碱试剂沉淀法671.盐析（salting out）法 l定义：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀定义：高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀的方法的方法l原理：破坏水化膜、中和电荷原理：破坏水化膜、中和电荷l特点：蛋白质不变性特点：蛋白质不变性l分段盐析：不同浓度的中性盐分离不同蛋白质分段盐析：不同浓度的中性盐分离不同蛋白质682.有机溶剂沉淀蛋白质 l原理：破坏水化膜原理：破坏水化膜l条件：条件：pH=pIpH=pIl特点：常在低温下进行特点：常在低温下进行l常用有机溶剂：乙醇、丙酮等常用有机溶剂：乙醇、丙酮等693.重金属盐沉淀蛋白质l原理：中和负电荷原理：中和负电荷l条件：条件：
17、pHpHpIpIl特点：蛋白质变性特点：蛋白质变性704.生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质l原理：中和正电荷原理：中和正电荷l条件：条件：pHpHpIpIl特点：蛋白质变性特点：蛋白质变性l常用酸类：苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝常用酸类：苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝酸、过氯酸等酸、过氯酸等71（四）蛋白质层析 （chromatography）l定义：待分离的液体（流动相定义：待分离的液体（流动相mobile phase ）经）经过一个固态物质（固定相过一个固态物质（固定相solid phase)后所发生的后所发生的各组分在两相中分布的变化。各组分在两相中分布的变化。l原理：根据混合物溶液
18、中蛋白质分子的大小、形原理：根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、形状、极性、亲和力等差异而加以分离。状、极性、亲和力等差异而加以分离。72l类型：类型：离子交换层析（离子交换层析（ion exchange chromatographyion exchange chromatography）凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)亲和层析亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)（四）蛋白质层析 （chromatography
19、）73离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 亲和层析亲和层析74（五）电泳 （electrophoresis）l定义：定义： 带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极移动，从而到达分离的方法。移动，从而到达分离的方法。75l常用的电泳技术：常用的电泳技术：琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis，AGE）聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF
20、）双向电泳（双向电泳（two dimensional electrophoresis，2DE）毛细管电泳（毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）（五）电泳 （electrophoresis）76（六）western blotting（蛋白印迹法，免疫印迹法） 把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜（如把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜）上的技术，膜）上的技术，称为称为蛋白印迹（蛋白印迹（western blotting）。 7778（七）蛋白质芯片l将已知蛋白质固化于固体支持物上，利用蛋白将已知蛋白质固化于固体支
21、持物上，利用蛋白质与蛋白质之间的相互作用，对未知蛋白质进质与蛋白质之间的相互作用，对未知蛋白质进行检测的方法。行检测的方法。7980第四节 蛋白质的分类l根据分子形状分：根据分子形状分： 球状蛋白 纤维状蛋白l根据分子组成分根据分子组成分 单纯蛋白质 结合蛋白质81the end82D-型、L-性氨基酸结构83甘氨酸与脯氨酸结构脯氨酸脯氨酸 COOH | HNCH | CH2CH2H2C COOH |H2NCH | H 甘氨酸甘氨酸84 85亮氨酸拉链 锌指结构86胰岛素胰岛素A链链B链链胰岛素原胰岛素原C-肽肽前胰岛素原前胰岛素原信号肽信号肽胰岛素的转变生成过程87镰状红细胞性贫血l 正常正常链链 H-缬缬组组亮亮苏苏脯脯谷谷谷谷l 镰状红细胞性镰状红细胞性 贫血贫血链：链： H-缬缬组组亮亮苏苏脯脯缬缬谷谷88l对于某一特定蛋白质颗粒，其沉降速度在单对于某一特定蛋白质颗粒，其沉降速度在单位离心力场强度下为一常数，称为蛋白质的位离心力场强度下为一常数，称为蛋白质的沉降系数沉降系数，用，用S（Svedberg，1S=10-13秒）表示。秒）表示。
