1、 植物组织培养植物组织培养 主讲人：韩春梅（博士、副教授）主讲人：韩春梅（博士、副教授）1998-2002，内蒙古民族大学，内蒙古民族大学/学士学士2002-2005，四川农业大学，四川农业大学/硕士硕士2005-2008，中科院成都生物研究所，中科院成都生物研究所/博士博士 第第一一章章 绪绪 论论 植物组织培养植物组织培养 的基础理论和基本知识的基础理论和基本知识Tissue Culture一、植物组织培养的基本概念和分类一、植物组织培养的基本概念和分类（一）植物组织培养的概念（一）植物组织培养的概念1、植物组织培养又称为植物无菌培养（离体培、植物组织培养又称为植物无菌培养（离体培养、试管
2、培养），指在无菌条件下，将植物的离养、试管培养），指在无菌条件下，将植物的离体器官（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组体器官（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细织（花药、胚珠、形成层、皮层、胚乳等）、细胞（体细胞、生殖细胞等）以及原生质体，放在胞（体细胞、生殖细胞等）以及原生质体，放在离体无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培离体无菌条件下，在人工控制的环境条件下，培养在人工配制的培养基上对其进行克隆，使其生养在人工配制的培养基上对其进行克隆，使其生长、分化并长成完整小植株的过程。长、分化并长成完整小植株的过程。A Glimpse of Plant T
3、issue Culture2、植物组织培养的分类：、植物组织培养的分类：根据培养的器官不同，分为花药培养、根据培养的器官不同，分为花药培养、胚珠培养、根培养、茎尖培养、叶培胚珠培养、根培养、茎尖培养、叶培养等；养等；根据培养基的形态（培养方式），分根据培养基的形态（培养方式），分为固体培养（在培养基内加入琼脂）为固体培养（在培养基内加入琼脂）和液体培养（也叫液体震荡培养或悬和液体培养（也叫液体震荡培养或悬浮培养）两种；浮培养）两种；根据培养物量的多少，分为大量培养、根据培养物量的多少，分为大量培养、微量培养；微量培养；根据培养过程是否需要光照，分为光培根据培养过程是否需要光照，分为光培养、暗培
4、养；养、暗培养；根据培养方法不同，分为平板培养、微根据培养方法不同，分为平板培养、微室培养、悬浮培养、单细胞培养等。室培养、悬浮培养、单细胞培养等。补充：补充：悬浮培养又分为振荡培养、旋转培悬浮培养又分为振荡培养、旋转培养和纸桥培养养和纸桥培养振荡培养：在培养过程中，将培养基和振荡培养：在培养过程中，将培养基和被培养器官、组织、细胞放入振荡器中振被培养器官、组织、细胞放入振荡器中振荡而完成的培养过程。主要应用于组织培荡而完成的培养过程。主要应用于组织培养和细胞培养。养和细胞培养。旋转培养：在培养过程中，将培养基和旋转培养：在培养过程中，将培养基和被培养器官、组织、细胞放入摇床旋转而被培养器官、
5、组织、细胞放入摇床旋转而完成的培养过程。主要应用于器官脱分化完成的培养过程。主要应用于器官脱分化培养。培养。纸桥培养：在培养过程中，将培养基中纸桥培养：在培养过程中，将培养基中放入滤纸，再将材料置于滤纸上而进行的放入滤纸，再将材料置于滤纸上而进行的培养过程。主要应用于植物脱毒茎尖培养。培养过程。主要应用于植物脱毒茎尖培养。（二）（二） 植物组织培养的生理依据植物组织培养的生理依据1、植物细胞的全能性植物细胞的全能性指植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基指植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力，因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力，细胞的这种特性叫细胞全
6、能性。细胞的这种特性叫细胞全能性。2、细胞具有这种潜能是因为每个细胞都包含、细胞具有这种潜能是因为每个细胞都包含了这个物种的所特有的全套遗传物质，具有发了这个物种的所特有的全套遗传物质，具有发育成为完整个体所必需的全部基因。育成为完整个体所必需的全部基因。3、植物生长调节物质是植物组织培养中、植物生长调节物质是植物组织培养中的关键性物质：的关键性物质：IAA（诱导愈伤组织形（诱导愈伤组织形成、诱导生根）、成、诱导生根）、CTK（诱导生芽）、（诱导生芽）、GA（促进已分化芽的伸长生长）、（促进已分化芽的伸长生长）、ABA、ETH等，用量极少。等，用量极少。补充：补充：脱分化：脱分化：指植物的根、
7、茎、叶、花、果实、种指植物的根、茎、叶、花、果实、种子等器官在人工条件下失去原有的状态和功能，子等器官在人工条件下失去原有的状态和功能，恢复到能分裂和增殖细胞的状态（愈伤组织或恢复到能分裂和增殖细胞的状态（愈伤组织或细胞团）的过程。细胞团）的过程。再分化：再分化：指细胞状态（愈伤组织）再次分化产指细胞状态（愈伤组织）再次分化产生分生组织，形成器官状态（丛生芽或胚状体）生分生组织，形成器官状态（丛生芽或胚状体）的过程。的过程。外植体：外植体：在植物组织培养过程中，由植物体上切在植物组织培养过程中，由植物体上切取的根、茎、叶、花、果、种子等器官以及各种取的根、茎、叶、花、果、种子等器官以及各种组织
8、和细胞统称为外植体。（大多为多细胞体，组织和细胞统称为外植体。（大多为多细胞体，均具有分化器官或其他组织的能力）。均具有分化器官或其他组织的能力）。愈伤组织：愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种高度液泡化、无定形状态、由薄壁细胞组成的排列疏液泡化、无定形状态、由薄壁细胞组成的排列疏松的组织。松的组织。愈伤组织愈伤组织（Callus） 植物组织培养过程植物组织培养过程 再分化再分化脱分化脱分化愈伤组织愈伤组织外植体外植体试管苗试管苗 新植株新植株CTK、IAA培养基培养基无菌环境
9、下操作无菌环境下操作（三）植物组织培养的类型（三）植物组织培养的类型1、愈伤组织培养：、愈伤组织培养：愈伤组织（外植体）愈伤组织（外植体） 体细胞胚胎发生体细胞胚胎发生（体细胞胚）（体细胞胚） 再生植株再生植株愈伤组织（外植体）愈伤组织（外植体） 器官发生途径（不器官发生途径（不定根定根/芽）芽） 再生植株再生植株愈伤组织愈伤组织分化的方向分化的方向不定芽不定芽胚状体胚状体根、芽根、芽2、器官培养：根、茎、叶、花、果实、器官培养：根、茎、叶、花、果实、种子等均可。种子等均可。3、胚培养：、胚培养：拯救胚：避免受精后胚乳发育不良或因种拯救胚：避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种
10、胚夭折，及胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚夭折，及时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗。接成苗。4、细胞和原生质体培养：在组织培养过程、细胞和原生质体培养：在组织培养过程中，对单个分离出来的细胞或去掉细胞壁中，对单个分离出来的细胞或去掉细胞壁而裸露的原生质体进行培养。而裸露的原生质体进行培养。原生质体：原生质体：指去掉细胞壁的由质膜包裹着指去掉细胞壁的由质膜包裹着的具有生活力的裸露细胞（细胞膜、细胞的具有生活力的裸露细胞（细胞膜、细胞质、细胞核）。质、细胞核）。二、植物组织培养的发展二、植物组织培养的发展探索阶段（探索阶段（1902-1929年）年）组培方
11、法和定义的建立阶段（组培方法和定义的建立阶段（1930-1939年）年）细胞全能性的证实阶段（细胞全能性的证实阶段（1940-1959）组培技术和理论迅速发展阶段（组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）组培技术在生产上广泛应用阶段（组培技术在生产上广泛应用阶段（1980-至今）至今）1. 探索阶段（探索阶段（1902-1929年）年）Haberlandt（德国植物生理学家）：（德国植物生理学家）：观点：观点：贡献：贡献：提出细胞全能性提出细胞全能性小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和万年青属表皮细胞万年青属表皮细胞无分裂无分裂细胞高度分化细胞高度分化+培养基培养基
12、中无生长激素中无生长激素首次进行离体细胞培养首次进行离体细胞培养高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞Knop+蔗糖蔗糖1904年年：Hanning胚培养：培养萝卜和辣根胚培养：培养萝卜和辣根菜的胚，得到植株；菜的胚，得到植株；1922年年：Kotte和和Robbins根培养；根培养；1925年年：Laibach亚麻种间杂交幼胚培养得到亚麻种间杂交幼胚培养得到杂种。杂种。其它研究其它研究1922年年：Knudson采用胚培养法获得兰花幼采用胚培养法获得兰花幼苗，克服其种子发芽困难的问题；苗，克服其种子发芽困难的问题；2. 组培方法和定义的建立阶段（组培方法
13、和定义的建立阶段（1930-1939年）年）1934年：年：White 用番茄根建立第一个植物无性系。用番茄根建立第一个植物无性系。当根当根2 cm长长 切成切成0.5-1 cm切断切断，无菌，无菌液液体培养体培养 完全相同的完全相同的离体根离体根 根离体培养真正根离体培养真正成功。成功。并提出植物细胞全能性假设：并提出植物细胞全能性假设：1934年：年：Gautherete培养山毛杨、黑杨形成层组培养山毛杨、黑杨形成层组织产生了愈伤组织；织产生了愈伤组织；1937年：年：White发现发现3种种B族维生素和族维生素和IAA对植物生对植物生 长有用长有用1939年：年：Gautherete培养
14、胡萝卜根小外植体成功培养胡萝卜根小外植体成功1939年：年：White培养烟草种间杂种幼茎切段原形成培养烟草种间杂种幼茎切段原形成 层成功层成功1939年：年：Nobecourt培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功培养胡萝卜根块茎薄壁组织成功 组织培养的奠基人组织培养的奠基人 3. 细胞全能性的证实阶段（细胞全能性的证实阶段（1940-1959）1943年：年：White植物组织培养手册植物组织培养手册A Handbook of Plant Tissue Culture，标志组织培养成为一门新兴学科；标志组织培养成为一门新兴学科；1946年：年：罗士韦在菟丝子茎尖培养地观察到花罗士韦在菟丝子茎尖培养地
15、观察到花的形成，为试管受精奠定了基础；的形成，为试管受精奠定了基础；1948年：年：Skoog和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌和崔真培养烟草茎段时，发现腺嘌呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，呤或腺苷可解除生长素对芽生长的抑制作用，腺腺嘌呤嘌呤/生长素生长素高，生芽；低，生根；相等，不分高，生芽；低，生根；相等，不分化。化。1952-1953年：年：美国科学家美国科学家Steward F.C.用胡萝卜根用胡萝卜根的细胞悬浮培养，的细胞悬浮培养，发现单个细胞发现单个细胞能象受精卵发育能象受精卵发育成胚一样的途径，发育成完整植株。证实了植物成胚一样的途径，发育成完整植株。证实了植物细胞全能性学说
16、。细胞全能性学说。1952年：年：Morel和和Martin首次报道茎尖分生首次报道茎尖分生组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。组织的离体培养，获得无病毒大丽花植株。1954年：年：Muir将将烟草愈伤组织置于固体培烟草愈伤组织置于固体培养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上养基上，在其上放一片滤纸，再在滤纸片上放上一放上一 个烟草体细胞，个烟草体细胞，单细胞培养单细胞培养成功成功。1956年：年：Miller分离出分离出Kinetin，Kinetin / 生生长素长素 4. 组培技术和理论迅速发展阶段（组培技术和理论迅速发展阶段（1960-1979）1960年以来组织培养理论、实践、技术和
17、方法年以来组织培养理论、实践、技术和方法不断完善和发展，形成独具特色的专业技术不断完善和发展，形成独具特色的专业技术在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成在实验技术上建立了较完整的实验程序，已成为一种重要和精细的实验技术为一种重要和精细的实验技术组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，组织培养已广泛应用于生物学的许多分支学科，并取得丰硕的成果。并取得丰硕的成果。4.1原生质体培养原生质体培养1960年：年：Cocking酶解法分离原生质体获得成功。酶解法分离原生质体获得成功。使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。使植物细胞可以象动物细胞一样进行细胞融合。1971年：日本年：日本 tak
18、ebe和和Nagata首次利用烟草叶片首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株。分离原生质体并获得再生植株。80年代的一个研究热点年代的一个研究热点,日本和中国做出了很大日本和中国做出了很大的贡献。的贡献。日本科学家进行了大约日本科学家进行了大约70个植物品种的原个植物品种的原生质体培养。生质体培养。中国中国获得了获得了30个以上品种的原生质体再生个以上品种的原生质体再生植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和植株，其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、经济作物大豆、水稻、玉米、小麦、谷子、高梁、大麦、棉花、油莱、马铃薯等。高梁、大麦、棉花、油莱、马铃薯等。在木
19、本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。质体培养方面的进展也十分迅速。4.2 细胞融合与体细胞杂交细胞融合与体细胞杂交1972年，美国年，美国Carlson诱导粉蓝烟草和郎氏烟草诱导粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合得到种间体细胞杂种：第一株体的原生质体融合得到种间体细胞杂种：第一株体细胞杂种。细胞杂种。1978年，年，有性杂交不亲和的番茄有性杂交不亲和的番茄/马铃薯间的体马铃薯间的体细胞杂交获得了杂种植株（细胞杂交获得了杂种植株（Melchers）。随后获）。随后获得了地上结番茄，地下生马铃薯的杂种植物。得了地上结番茄，地下生马铃薯的杂
20、种植物。1985年，年，马铃薯的栽培品种与野生种的体马铃薯的栽培品种与野生种的体细胞杂交，得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂交，得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂种（细胞杂种（Austin）。）。科间的大豆科间的大豆/粉蓝烟草（粉蓝烟草（Kao，1977）、大）、大豆豆/烟草（烟草（Chien，1982）产生了连续增殖）产生了连续增殖的杂种细胞系，更远缘的大豆的杂种细胞系，更远缘的大豆/水稻产生了水稻产生了愈伤组织（愈伤组织（Niizeki，1985）。）。4.3 胚胎培养和试管受精胚胎培养和试管受精避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲避免受精后胚乳发育不良或因种胚与胚乳间不亲和而致使杂种胚
21、夭折，及时分离幼胚接种在无激素和而致使杂种胚夭折，及时分离幼胚接种在无激素培养基上使之直接成苗，这就是胚挽救。培养基上使之直接成苗，这就是胚挽救。大大提高远缘杂交的成功率。主要应用于一些亚大大提高远缘杂交的成功率。主要应用于一些亚洲国家。大量的幼胚培养成为植株的报道，有洲国家。大量的幼胚培养成为植株的报道，有40多多个杂种胚培养成功。个杂种胚培养成功。印度科学家在裁培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂印度科学家在裁培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂交中获得了理想的重组体。交中获得了理想的重组体。中国中国农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚得到了种间杂种。胚得到了种间
22、杂种。4.4 组织及细胞培养生产有用物质组织及细胞培养生产有用物质Arregnin和和bonner在在1950年首先进行了培养橡胶年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试。茎愈伤组织获取橡胶的尝试。1967年，年，Kaul和和Staba从牙签草的组织和细胞培从牙签草的组织和细胞培养物中分离出目的次生代谢物呋喃色酮。养物中分离出目的次生代谢物呋喃色酮。近近50年来飞速的发展。从年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞多种植物培养细胞中分离到中分离到600多种次级代谢产物，其中多种次级代谢产物，其中60多种在含多种在含量上超过或等于其原植物，量上超过或等于其原植物，20种以上干重超过种以上干重
23、超过1。在日本，人参细胞培养已达在日本，人参细胞培养已达130600 L发酵罐；德发酵罐；德国用国用1000 L发酵罐培养毛地黄细胞；在我国，人发酵罐培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。参细胞培养技术也已实现产业化。利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行了出色的研究。他们在毛地黄细德国科学家进行了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和黄毒素和 甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100的转化速率使之羟基化，变为
24、医药强心剂的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。地高辛。4.5 单倍体育种单倍体育种亚太地区一直处于领先的地位。亚太地区一直处于领先的地位。1964年，印度的年，印度的Guba和和Meheshiwari培养毛培养毛叶曼陀罗花药获得了第一棵单倍体植株。叶曼陀罗花药获得了第一棵单倍体植株。印度培育的水稻品系比对照提高产量印度培育的水稻品系比对照提高产量15%49%；韩国获得了；韩国获得了2个水稻新品种；日本培育了个水稻新品种；日本培育了耐寒性和口味较好的水稻品种。耐寒性和口味较好的水稻品种。中国中国于于1970年开始这方面的研究，取得了很大的年开始这方面的研究，取得了很大的成果。成果。40种
25、以上植物获得单倍体植株，其中小麦、玉米、种以上植物获得单倍体植株，其中小麦、玉米、橡胶树、杨树、辣椒、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、橡胶树、杨树、辣椒、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、葡萄和苹果等的单倍体植株为我国首创。通过单葡萄和苹果等的单倍体植株为我国首创。通过单倍体育种获得了水稻、小麦、烟草、辣椒和甜樱倍体育种获得了水稻、小麦、烟草、辣椒和甜樱新品种。中华新品种。中华8号、号、9号等号等15个水稻新品种，总种个水稻新品种，总种植面积达植面积达1000万亩。万亩。通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。体植株。5. 组织培养在生产上广泛应用阶段（组织培
26、养在生产上广泛应用阶段（1980年年-至今）至今）植物快速繁殖技术植物快速繁殖技术 60年代，法国的年代，法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗工厂化生产和无病毒种苗生产技术在工厂化生产和无病毒种苗生产技术在70年代得年代得到了快速的发展。到了快速的发展。通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有的植物已有100多科、多科、1000种以上。种类由以观赏种以上。种类由以观赏植物为主逐渐发展到果树、林木、蔬菜和大田作植物为主逐渐发展到果树、林木、
27、蔬菜和大田作物（粮食经济作物）。物（粮食经济作物）。美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗的年产量均在数千万株以上，并且以每年的年产量均在数千万株以上，并且以每年7-8的速度增加。的速度增加。 我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于70年代，脱毒马铃薯、大蒜、香蕉、甘蔗、花卉等年代，脱毒马铃薯、大蒜、香蕉、甘蔗、花卉等已开始规模化生产。已开始规模化生产。（一）植物组织培养的快速繁殖（一）植物组织培养的快速繁殖 三、植物组织培养的应用三、植物组织培养的应用快速繁殖主要应用于工厂化大规模生产的热带水快速繁殖主要应用于工
28、厂化大规模生产的热带水果（香蕉、甘蔗、草莓等）、花卉（康乃馨、兰果（香蕉、甘蔗、草莓等）、花卉（康乃馨、兰花）、树木（桉树）、珍惜植物（安徽黄里软子花）、树木（桉树）、珍惜植物（安徽黄里软子石榴、太和樱桃）等。石榴、太和樱桃）等。（二）脱毒（二）脱毒柑橘的衰退病、葡萄的扇叶病、草莓的病毒病、柑橘的衰退病、葡萄的扇叶病、草莓的病毒病、番木瓜的叶环斑病、番木瓜的叶环斑病、马铃薯疫病、枣疯病、姜腐马铃薯疫病、枣疯病、姜腐烂病等蔬菜，严重影响其产量和品质；花卉（康烂病等蔬菜，严重影响其产量和品质；花卉（康乃馨、菊花、百合、风信子等的鳞茎、球茎、宿乃馨、菊花、百合、风信子等的鳞茎、球茎、宿根类花卉、兰科
29、植物）退化严重，降低其观赏价根类花卉、兰科植物）退化严重，降低其观赏价值；值；利用植物的茎尖培养脱毒技术可以克服病毒的利用植物的茎尖培养脱毒技术可以克服病毒的感染。感染。（三）体细胞无性系变异和新品种培育（三）体细胞无性系变异和新品种培育1、变异的无方向性、变异的无方向性2、变异的普遍性、变异的普遍性3、植物体细胞无性系变异的类型（遗传型变、植物体细胞无性系变异的类型（遗传型变异和生理型变异）异和生理型变异）4、引起植物体细胞无性系变异的原因（激素、引起植物体细胞无性系变异的原因（激素的种类和浓度）的种类和浓度）5、植物体细胞无性系变异的利用价值及途径、植物体细胞无性系变异的利用价值及途径（四）单倍体育种（四）单倍体育种（五）种质保存：（五）种质保存：名特优新品种、濒危物种名特优新品种、濒危物种（六）遗传转化（六）遗传转化（七）良种繁育（七）良种繁育 无性繁殖或种子繁殖无性繁殖或种子繁殖 慢慢 有病毒有病毒 组织培养组织培养 快快 无病毒无病毒思考题思考题1.1.概念：植物组织培养、愈伤组织、外植体概念：植物组织培养、愈伤组织、外植体细胞全能性、脱分化、再分化、原生质体？细胞全能性、脱分化、再分化、原生质体？2.2.组织培养的类型有哪些？组织培养的类型有哪些？3.3.组织培养在农业上的应用有哪些？组织培养在农业上的应用有哪些？
