1、仔猪肠道微生物菌群的研究仔猪肠道微生物菌群的研究目录目录仔猪的肠道微生态仔猪的肠道微生态仔猪肠道菌群的形成仔猪肠道菌群的形成肠道菌群的研究方法进展肠道菌群的研究方法进展第二代测序技术第二代测序技术- -罗氏罗氏454焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术实验进展及后续实验计划实验进展及后续实验计划仔猪的肠道微生态仔猪的肠道微生态 仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加逐渐变得复杂多样，且形成一个相对动态平衡、稳定的微生态系统，对宿主的生长和健康起着重要作用。但报道认为，自然界中很多微生物不能用现有的培养方法进行分离和鉴定或是不能培养1,2，而且仔猪肠道中大部分微生物的生长需要厌氧环境，因此人们对仔猪肠道及粪样
2、微生物及其变化规律的了解甚少。仔猪肠道菌群的形成仔猪肠道菌群的形成 新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段3,4,5,6。 第一阶段:新生动物出生两周以内，肠道内的细菌定植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌，随之很快出现双歧杆菌并成为优势菌，这个时期肠道菌群的特点是不稳定，容易发生变化。 第二阶段:出生后两周到断奶以前，动物在母乳喂养下，肠道内细菌主要以厌氧菌为主，主要为双歧杆菌，肠杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易受食物的影响，食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生较大的变化。 第三阶段:断奶以后，基本类似与成年动物肠道菌群。肠道菌群的研究方法进展（常规分离培养技术
3、）肠道菌群的研究方法进展（常规分离培养技术） 在肠道微生物学研究中，科学家们通常使用一定的选择性液体或固体培养基，对粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样本进行培养和富集，并对培养得到的细菌种类进行分析7。根据肠道细菌的特性，对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的条件下进行，严格的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离和生长具有非常重要的意义。 但是，局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先，体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件，因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到分离；其次，仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株进行准确的鉴定8。因此，在研究肠道菌群结构和功能的研究中，研究者
4、们通常结合分离培养方法和分子生物学方法，对感兴趣的细菌种类进行研究。肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法） 分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸（DNA 或 RNA）为研究对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中，研究者们最常使用核糖体小亚基RNA 基因（细菌中的 16S rRNA 基因）的全部或部分序列作为分子标签来代表物种，以基因序列的多样性代表物种的多样性，从而对菌群的组成结构进行分析。细菌 16S rRNA 基因具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区（V 区）等特点，同时序列还具有信息量巨大且更新迅速的公开数据库，如
5、 Ribosomal Database Project（RDP）、SILVA 、Greengenes 等等，研究者们可以方便地将自己研究中的 16S rRNA基因序列与数据库进行比对，确定细菌的分类地位9。 常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于 DNA 指纹图谱的分析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量的荧光定量 PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。 肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）肠道菌群的研究方法进展（
6、分子生态学研究方法） DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）10,11,12和末端片段长度多态性（Terminalrestriction fragment length pol
7、ymorphism, T-RFLP）等。 不同于指纹图谱技术，DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序列核酸信息的方法，对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克隆质粒、转化细胞构建和桑格（Sanger）双脱氧法测序的 16S rRNA 基因克隆文库长期以来广泛用于研究群落中微生物组成的方法。 第二代测序技术第二代测序技术- -罗氏罗氏454焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术焦磷酸测序法的原理 将PCR扩增的单链与引物杂交,并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5磷酸硫腺苷共同孵育,然后脱氧核糖核苷三磷酸即按照碱基配对的原则依次连接到引物上。在每一轮测序反应中
8、,只加入一种dNTP,若该dNTP与待测模板配对, DNA 聚合酶可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团( PPi) 。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素( oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系,然后加入下一种dNTP,如此循环13。第二代测序技术第二代测序技术- -罗氏罗氏454焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术454测序法的步骤（1）样品输出并片段化： GS系统支持各基因组DNA、PCR产物和细菌人工染色
9、体(BACs) 及cDNA、小分子RNA 的测序。先将基因组DNA 和BACs等通过物理方法打断为300-800 bp 的片段,而对于短的小分子RNA 和PCR 产物, 则无需此步骤。（2）DNA 文库的准备：利用核酸内切酶、聚合酶和激酶的作用在DNA片段的5端加上磷酸基团,3端变成平端,然后和两个44 bp 的衔接子( adaptor)A、B进行平端连接。将样品5端和3端分别连接A和B衔接子。具有A B接头的单链DNA片段组成了样品文库。第二代测序技术第二代测序技术- -罗氏罗氏454焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术（3）DNA 片段与磁珠结合：加入特异性的洗脱溶液后,提高温度到DNA的解链温度
10、上,可以选择性的将单链的AB 连接产物洗脱下来,通过生物素可以与链霉亲合素特异结合的特性,将这些DNA模板和过量的链霉亲合素的磁珠结合,使1条DNA片段结合1个磁珠。（4）乳滴PCR扩增：将这些磁珠用包含了PCR反应所必须的各种试剂的油-水混合物的小滴包裹后,对所有的DNA 片段进行emPCR 平行PCR ( emPCR)扩增。第二代测序技术第二代测序技术- -罗氏罗氏454焦磷酸测序技术焦磷酸测序技术（5）数据分析：经过扩增后, 每个磁珠上的DNA片段拥同一拷贝,此时打断PCR反应过程,对结合有大量DNA链的珠子进行富集,随后放入皮升级反应板中进行后继测序14。实验进展实验进展（1）试验动物
11、及采样 两窝产期相近、胎次相似、窝子数在8-11头杜长大出生仔猪按常规饲养管理。分别于仔猪出生后0d（吃乳前）、7d、14d、21d（断奶）、24d、28d采样，收集粪便样品待测。（2）粪便细菌总DNA提取 总DNA提取采用E.Z.N.A.TM Stool DNA Kit试剂盒。图 M 代表 DNA marker；1 代表使用E. Z. N. A stool DNA试剂盒所提取的基因组；2代表使用E. Z. N. A soil DNA试剂盒所提取的基因组。实验进展实验进展（3）PCR扩增16S r RNA基因片段 基于相对准确的种系发育信息，选取16S rRNA片段上V3-V6高变区作为PCR
12、扩增目标片段。并就该对目标片段对RDP16S 数据库进行比对，保证其可覆盖该数据库内98%的细菌16S基因序列，满足实验引物设计要求。确定PCR上游引物（含不同的IDtag）及4个兼并性下游引物（公司保密）。 PCR反应体系如下：DNA 2L 10Buffer（Mg2+）5L dNTP 2L 5上游引物（10M）1L 3下游引物（10M）4个兼并性引物各1L Taq酶 0.5L ddH2O 35.5LPCR反应条件：94预变性4min，94变性30s，55退火30s，72延伸50s，共25个循环，最后72延伸10min。 PCR产物使用上海生工胶回收试剂盒进行切胶回收。（4）454焦磷酸测序后
13、续实验计划后续实验计划（1）序列的筛选 大规模测序获得的大量序列信息中包括错误或者不合格的序列，需要进行合理筛选，本研究中序列的筛选条件如下：检验 barcode 的完整程度，且所有碱基的检测必须正确；要求每条序列长度大于 150 bp；序列中 80%以上碱基的测序质量数大于 20；去除尾部质量数低于 20 的末端序列。筛选出合格序列后，即可通过引物序列和 barcode 序列区分来自不同样品的序列。完成序列分类后，将位于序列头端的前引物序列和 barcode 去除，避免影响序列相似度的计算。（2）基于OTU的物种多样性分析 采用专业分析软件，获取序列距离矩阵，以相似度 97%进行 OTU 划
14、分，相似度大于 97%归为同一 OTU。在 OTU划分的基础上进行 多样性分析，计算群落OTU 数目（ Total Abundance ）、物种丰度（ Species Richness ）、香农威纳指数（Shannon-Weiner），辛普森多样性指数（Simpsons diversity）和物种均一度（Pielous evenness），物种丰度估计参数Chao1和ACE。对每一个样品随机抽取500条序列，通过稀释曲线（Rarefaction curve）比较不同群落的物种多样性特征。后续实验计划后续实验计划（3）基于数据库的分类地位分析 采用RDP Classifier 分类工具针对RDP
15、16S 数据库进行种系划归。选取置信度0.8 为临界阈值，低于该置信度则列为未分类细菌。分别统计在各个样品在每个分类水平上各物种的序列数，与该样品总体获得的序列数计算比值，获取每个门类物种的相对丰度，并就不同组别来源的样品进行比较。（4）多元统计分析 UniFrac 是一种通过计算系统发育树上序列的进化距离，比较不同微生物群落结构差异的系统发育进化方法。 UniFrac方法在比较不同微生物群落结构的差异时，不仅考虑物种的丰度，更考虑序列之间的进化距离。参考文献参考文献1.Zoetendal E, Koike S, Mackie R, et al. Molecular ecological an
16、alysis of the gastrointestinal microbiota: A review. J of Nutrition, 2004, 134:465-472.2.何明清，廖德惠，谢镜怀等.猪不同日龄及不同肠段正常肠菌群的研究J.畜牧兽医学报，1985，1:67-72.3.Willard M D, Simpson R B, Delles E K, et al. Effects of dietary supplementation of Fructooligosaccharides on small intestinal bacterial overgrowth in dogs.
17、Am. J Vet Res, 1994, 55:654-659.4.Suau A, Bonnet R, Sutren M, et al. Direct analysis of genes encoding 16SrRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the humangut. Appl Environ Microbiol, 1999, 65:4799-4807.5.Ward J. Hierarchical grouping to optimize an objective functi
18、on. J Am Stat Assoc, 1963, 58:236-244.6.Watanabe K, Kodama Y, Harayama S. Design and evaluation of PCR primers to amplify bacterial 16Sribosomal DNA fragments used for community fingerprinting. J Microbiol Methods, 2001, 44:253-262.7.凌泽春，杨红玲，孙云章等.斜带石斑鱼幼鱼消化道与养殖水体可培养菌群的研究J.大连水产学院学报，2009，24(6):497-503.
19、8.冯仰廉.反刍动物营养学M.北京:科学出版社，2004:114-130.9.冯霞，殷幼平，王中廉.现代分子生物学技术在动物肠道微生物多样性研究中的应用J.应用与环境生物学报，2005，11(3):381-387.10. Muyzer G, De Waal E, Uitterlinden A. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNAJ.
20、 Applied and Enviromental Microbiology, 1993,59(3):659.11. 宫曼丽，任南琪，邢德峰.DGGE/TGGE技术及其在微生物分子生态学中的应用J.微生物学报，2004，44(6):845-848.12. 马悦欣.变性梯度凝胶电泳(DGGE)在微生物生态学中的应用J.生态学报，2003，23(8):1561-1569.13. 许冠东. Genome Sequencer FLX引领快速基因组测序时代的带来.微生物学通报，2008,35(1):149-151.14. Rothberg J M, Leamon J H. The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 2008, 26:1117-1124.
