1、 血清血清LDH及其同工酶测定及其同工酶测定刘湘帆刘湘帆nLDHLDH作用：作用： 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenaselactate dehydrogenase, LD, LD或或LDHLDH）在辅酶）在辅酶I I（NADNAD+ +）为氢受体时，催化）为氢受体时，催化L-L-乳酸为丙酮酸。乳酸为丙酮酸。nL-L-乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 NAD+ NADH+HNAD+ NADH+H+ + LDH分布：分布：特异性差特异性差 心肌、心肌、骨骼肌、肾脏骨骼肌、肾脏 、肝、脾、胰、肺、肿瘤、肝、脾、胰、肺、肿瘤、红细胞红细胞肾肾 心肌心肌 骨骼肌骨骼肌 肝肝 脾脾 胰
2、胰 肺肺1 1 方法方法(1) (1) 分光光度法分光光度法 1 1）利用顺向反应（）利用顺向反应（pH 8.8-9.8pH 8.8-9.8）：）：340nm340nm处处连续观察连续观察NADHNADH的产生速度。的产生速度。 2 2）利用逆向反应（）利用逆向反应（pH 7.4-7.8pH 7.4-7.8）：）：340nm340nm处处连续观察连续观察NADHNADH的消失速度。的消失速度。 分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围分光光度法能利用顺、逆双相反应，线性范围较广。但要求保持测定体系于最适温度下，否较广。但要求保持测定体系于最适温度下，否则会影响测定的准确性则会影响测定的准确性。
3、(2)(2)比色法测定比色法测定LDLD总活性总活性1 1） 原理：原理： 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDLD） 乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 丙酮酸丙酮酸 2,4-2,4-二硝基苯肼二硝基苯肼 丙酮酸丙酮酸- -二硝基苯腙二硝基苯腙 碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。碱性溶液中呈棕红色颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比。n2 2） 试剂：试剂：n基质缓冲液（基质缓冲液（pH 8.8pH 8.8）nNADNAD+ +溶液（溶液（11.311.3mmol/Lmmol/L）n丙酮酸标准液（丙酮酸标准液（0.50.5mmol/Lmmol/L）n2,4-2,4-二硝基苯肼溶液（二硝基苯肼溶液（1
4、1mmol/Lmmol/L）n氢氧化钠溶液（氢氧化钠溶液（0.40.4mmol/Lmmol/L）n单位定义：单位定义：n以以100ml100ml血清，血清，3737与基质作用与基质作用15min15min，生成生成1 1umolumol丙酮酸为一个金氏单位。丙酮酸为一个金氏单位。n参考值：参考值： 血清血清LDLD：190-437190-437金氏单位。金氏单位。3)3)操作步骤操作步骤1 LD1 LD活性测定活性测定 加入物加入物 对照管对照管 测定管测定管 血清血清 - 0.05- 0.05 基质缓冲液基质缓冲液 0.5 0.50.5 0.5 混匀，放混匀，放3737C C水浴水浴5 5m
5、inmin NAD+ NAD+溶液溶液 - 0.1- 0.1 混匀，放混匀，放3737C C水浴水浴1515minmin 2 2，4-4-二硝基苯肼溶液二硝基苯肼溶液 0.5 0.50.5 0.5 NAD+ NAD+溶液溶液 0.1 -0.1 - 混匀，放混匀，放3737C C水浴水浴1515minmin 0.4mol/LNaOH 0.4mol/LNaOH 5.0 5.05.0 5.0 室温放置室温放置5min5min进行比色，进行比色，波长波长440440nmnm2 LD2 LD校正曲线制作校正曲线制作加入物（加入物（mlml） B 1 2 B 1 2 3 4 3 4丙酮酸标准液丙酮酸标准液
6、 0 0.05 0.1 0.15 0.20 0 0.05 0.1 0.15 0.20 基质缓冲液基质缓冲液 0.5 0.45 0.40 0.35 0.300.5 0.45 0.40 0.35 0.30蒸馏水蒸馏水 0.15 0.15 0.15 0.15 0.150.15 0.15 0.15 0.15 0.152,42,4二硝基苯肼二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 混匀，混匀，放放3737C C水浴水浴1515minmin0.4mol/LNaOH 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.
7、0 5.0LDLD活性单位活性单位 0 250 500 750 1000 0 250 500 750 1000 临床意义n心肌损害：心肌损害： 心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎心肌梗塞、充血性心衰、心肌炎n肝脏疾病肝脏疾病: :病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌n其它其它: :骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴骨骼肌的损伤、恶性肿瘤（白血病、淋巴瘤等）、肺梗塞等瘤等）、肺梗塞等n注意事项：注意事项：n标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝标本不能溶血，也不能用草酸盐抗凝血。血。n由于由于LDLD4 4，LDLD5 5对冷不稳定，不宜冰箱存对冷不稳定，不宜冰箱存放，血清标本在室
8、温下可稳定放，血清标本在室温下可稳定2-32-3天。天。LDLD同工酶的测定同工酶的测定n LD LD同工酶同工酶 H H亚单位亚单位 心肌心肌 M M亚单位亚单位 肌肉肌肉 LDLD1 1 （H H4 4） 心肌心肌 LDLD2 2 （H H3 3M M） 心肌心肌 LDLD3 3 （H H2 2M M2 2） 肺、脾肺、脾 LDLD4 4 （HMHM3 3） 肝、骨骼肌肝、骨骼肌 LDLD5 5 （M M4 4） 肝、骨骼肌肝、骨骼肌 正常成人：正常成人：LDLD2 2LDLD1 1LDLD3 3LDLD4 4LDLD5 5人体某些组织中人体某些组织中LDHLDH同工酶电泳图谱同工酶电泳图
9、谱 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5心肌心肌 + + + + +红细胞红细胞 + + + + +肾上腺肾上腺 + + + + +骨骼肌骨骼肌 + + + + +肝肝 + + + + + 总之：复基因位点同工酶在生物体内可以各个总之：复基因位点同工酶在生物体内可以各个同工酶独自存在，也可以以杂化体形式存在同工酶独自存在，也可以以杂化体形式存在。 LD1 LD2 LD3 LD4 LD5n二、测定方法：二、测定方法：n柱层析法柱层析法n免疫化学法免疫化学法n热稳定性和抑制法热稳定性和抑制法n* *电泳法电泳法：醋酸纤维素薄膜醋酸纤维素薄膜聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖琼脂糖n原理
10、：原理：n根据根据LDLD同工酶一级结构和等电点的差异，在一同工酶一级结构和等电点的差异，在一定电泳条件下，使定电泳条件下，使LDLD在支持物上被分离。在支持物上被分离。n 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDLD）n 乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸nNADH + NADH + 氧化型氧化型PMS PMS 还原型还原型PMS + NADPMS + NAD+ +n还原型还原型PMS + PMS + 四氮唑盐类四氮唑盐类 氧化型氧化型PMS + PMS + 甲臢甲臢n当有当有LDLD活性的区带存在即显紫红色，颜活性的区带存在即显紫红色，颜色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪色深浅与酶活性成正比，借助于扫描仪或光密度
11、仪，可进一步求出相对含量。或光密度仪，可进一步求出相对含量。n 例如，例如，LDHLDH同工酶同工酶LDHLDH2 2、LDHLDH3 3、LDHLDH4 4、LDHLDH5 5都比都比LDHLDH1 1有较多的碱有较多的碱性氨基酸，在性氨基酸，在pH8.6pH8.6的巴比妥缓冲液中的巴比妥缓冲液中LDHLDH1 1带带有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。有更多的负电荷，因而向阳性泳动最快。n试剂：试剂：n巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH 8.6pH 8.6）n巴比妥盐酸缓冲液（巴比妥盐酸缓冲液（0.0820.082mol/Lmol/L， pH pH 8.28.2）nEDTA-Na2EDTA-
12、Na2溶液（溶液（1010mmol/Lmmol/L）n缓冲琼脂糖凝胶（缓冲琼脂糖凝胶（8g/L8g/L和和 5 5g/Lg/L）n底物显色液和固定漂洗液底物显色液和固定漂洗液n（3 3）操作）操作n凝胶板制备凝胶板制备n加样加样n电泳电泳n显色显色n固定和漂洗固定和漂洗（4 4）计算：）计算：nA A总总（吸光度总和）（吸光度总和）= = A A1 1 + A + A2 2 + A + A3 3 + A + A4 4 + A + A5 5n（A A1 1AA5 5 相应为相应为LDLD同工酶同工酶LDLD1 1LDLD5 5的吸光度。）的吸光度。）nLDLD同工酶的百分比（同工酶的百分比（%
13、%）为：）为：nLDLD1 1 = A = A 1 1/ A/ A总总 100% 100%nLDLD2 2 = A = A 2 2/ A/ A总总 100% 100%nLDLD3 3 = A = A 3 3/ A/ A总总 100% 100%nLDLD4 4 = A = A 4 4/ A/ A总总 100% 100%nLDLD5 5 = A= A5 5 / A/ A总总 100% 100%临床意义临床意义n心脏疾病心脏疾病n心肌梗塞心肌梗塞 LDLD1 1 LDLD2 2n充血性心衰，心肌炎充血性心衰，心肌炎 LDLD1 1 LDLD2 2n肝脏疾病肝脏疾病 n病毒性肝炎病毒性肝炎 LDLD5
14、 5 LDLD4 4n肝硬化，原发性肝癌肝硬化，原发性肝癌 LDLD5 5，LDLD5 5 LDLD4 4n恶性肿瘤恶性肿瘤n白血病、结肠癌等白血病、结肠癌等 LD3LD3，LDLD3 3LDLD1 1n肌肉疾病肌肉疾病n肌肉损伤、肌萎缩肌肉损伤、肌萎缩 LDLD5 5注意事项注意事项n不宜用溶血标本。不宜用溶血标本。n严格控制温度（严格控制温度（LDLD4 4和和LDLD5 5，特别是，特别是LDLD5 5对热敏感，对热敏感，如底物显色液温度超过如底物显色液温度超过5050，LDLD5 5易失活）。易失活）。n底物显色液需避光保存，因底物显色液需避光保存，因PMSPMS对光敏感，否则对光敏感
15、，否则显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。显色后的凝胶板背景颜色深而影响结果。nLDLD同工酶对冷的敏感性不同，尤其是同工酶对冷的敏感性不同，尤其是LD5LD5对冷不对冷不稳定。因此血清标本应该放室温保存稳定。因此血清标本应该放室温保存CK及其同工酶的检测肌酸激酶（Creatine Kinase ，CK） ，系统名为三磷酸腺苷：肌酸磷酸转移酶。广泛存在于各种组织中，与ATP 的再生有关。 n分布分布n骨骼肌骨骼肌n心肌心肌n脑组织脑组织n平滑肌（胃肠道、子宫）平滑肌（胃肠道、子宫）n在肝及红细胞中测不到在肝及红细胞中测不到CKCK的活性。的活性。Creatine KinaseCreatine
16、Kinase（CK, EC 2.7.3.2CK, EC 2.7.3.2， ATP:ATP: 肌酸磷酸转移酶）肌酸磷酸转移酶）pH9.0pH9.0ATP + ATP + 肌酸肌酸 磷酸肌酸磷酸肌酸 + + ADPADP pH7.0pH7.0 CK: MM, MB, BB, Mt MW 86 000CK: MM, MB, BB, Mt MW 86 000ADP + 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸激酶 丙酮酸 + ATP丙酮酸-2，4-二硝基苯腙实验操作实验操作加入物加入物 B S B S U U血清血清 - - 0.1 - - 0.1 标准标准 - 0.1 - 0.1 -（1mmol/L;200U/L1
17、mmol/L;200U/L） H2O 0.1 - H2O 0.1 - - -酶试剂酶试剂 0.5 0.5 0.50.5 0.5 0.5 37 1537 15minminDNP DNP O.5 0.5 0.5 O.5 0.5 0.5 37 1537 15minminNaOH NaOH 4 4 4 4 4 4 室温室温 5min 440nm5min 440nm比色比色 肌酸、ATP、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸临床意义临床意义（1 1）引起血清）引起血清CKCK活性升高的疾病活性升高的疾病 1 1）心脏疾病：）心脏疾病： 急性心肌梗塞急性心肌梗塞 （病毒性）心肌炎（病毒性）心肌炎 心外膜炎心外膜炎
18、2 2）肌性疾病：）肌性疾病： 进行性肌营养不良、多发性肌炎、皮肌炎进行性肌营养不良、多发性肌炎、皮肌炎 肌萎缩肌萎缩3 3）中枢神经系统疾病）中枢神经系统疾病 脑血管意外、脑膜炎、颅脑外伤脑血管意外、脑膜炎、颅脑外伤4 4）肺疾病）肺疾病 肺栓塞等肺栓塞等（2 2）引起血清）引起血清CKCK活性降低的疾病（较少）活性降低的疾病（较少） 甲状腺功能亢进甲状腺功能亢进 全身性红斑狼疮全身性红斑狼疮 严重感染、败血症等严重感染、败血症等7 7、注意事项、注意事项（1 1）本实验的许多试剂都易失效，故最好在每）本实验的许多试剂都易失效，故最好在每次实验前临时配制。次实验前临时配制。（2 2）肌酸呈色
19、不稳定，振荡充分与否直接影响）肌酸呈色不稳定，振荡充分与否直接影响呈色的深浅及过程，用旋涡混合器充分振荡呈色的深浅及过程，用旋涡混合器充分振荡15s15s，3737水浴水浴5min5min后，颜色可达最高点，并后，颜色可达最高点，并持续持续30min30min以上。以上。 原理CK 分子是由 M 和 B 两种亚单位组成的二聚体。在细胞质内存在三种 CK 同工酶：CK-BB 脑型CK-MM 肌型CK-BM 混合型CK-Mt（线粒体内）CK同工酶CKCK同工酶同工酶测定原理测定原理 磷酸肌酸 ADP CK 肌酸 ATP ATP 葡萄糖 己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸 ADP 葡萄糖-6-磷酸 NADP
20、+ 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸葡萄糖酸 NADPH H+ 1. 电泳法测定CK-MB 琼脂糖介质，醋酸纤维素薄膜琼脂糖介质，醋酸纤维素薄膜 酶定位酶定位: : CK-BB CK-BB 白蛋白区白蛋白区 CK-MB CK-MB 2 2 区区 CK-MM CK-MM 区区 CK-Mt CK-Mt 后后 参考值：参考值： CK-BB 0%CK-BB 0% CK-MB 0 CK-MB 0 3%3% CK-MM 97 CK-MM 97 100%100% CK-Mt 0% CK-Mt 0% CK-MB CK-MB 阳性决定水平为阳性决定水平为5%5%CK-MBCK-MB测定测定n试剂试剂n（1 1）5
21、050mmol/L Tismmol/L Tis- -巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH 8.0pH 8.0）n（2 2）30mmol/L Tis30mmol/L Tis- -巴比妥缓冲液（巴比妥缓冲液（pH 8.6pH 8.6）n（3 3）5g/L 5g/L 琼脂糖琼脂糖n（4 4）400400mmol/L Bis-Tismmol/L Bis-Tis缓冲液（缓冲液（pH 7.0pH 7.0）n（5 5）辅酶溶液）辅酶溶液n（6 6）底物显色液）底物显色液n（7 7）混合底物显色液）混合底物显色液n操作操作n（1 1）制备凝胶玻片）制备凝胶玻片n（2 2）加样）加样n（3 3）电泳）电泳n（4 4
22、）显色）显色n（5 5）固定和漂洗）固定和漂洗n（6 6）观察结果）观察结果n参考值n（1）CK-BB： 0%n（2）CK-MB： 0% 3%n（3）CK-MM： 97% 100%n（4）CK-Mt： 0%n引起引起CK-BBCK-BB升高的疾病升高的疾病n急性颅脑外伤急性颅脑外伤n脑血管疾病脑血管疾病n急性细菌性脑膜炎急性细菌性脑膜炎n引起引起CK-BMCK-BM升高的疾病升高的疾病n急性心肌梗塞急性心肌梗塞n心肌炎心肌炎n进行性肌营养不良进行性肌营养不良注意事项n（1 1）电泳需较高的）电泳需较高的pHpH值，酶反应需较低值，酶反应需较低pHpH。n（2 2）CKCK不稳定，对光、热及高不
23、稳定，对光、热及高pHpH敏感，最好将及时分敏感，最好将及时分出的血清充出的血清充COCO2 2后塞紧管口，置冰室或后塞紧管口，置冰室或-30-30保存，至保存，至少可稳定半个月，及时测定效果更好。少可稳定半个月，及时测定效果更好。n（3 3）血清）血清CKCK活性随温度升高而升高，直至活性随温度升高而升高，直至4545，更高，更高温度时温度时CKCK活性迅速下降，活性迅速下降，5656很快失活，琼脂糖电泳很快失活，琼脂糖电泳法测法测CKCK同工酶时，决不能像作同工酶时，决不能像作LDLD同工酶用温度较高的同工酶用温度较高的琼脂糖底物显色液，否则琼脂糖底物显色液，否则CKCK活性丧失，而非脱氢
24、酶活性丧失，而非脱氢酶（NDHNDH）反应显著。）反应显著。CK-MM亚型CK-MMCK-MM亚型亚型: : MMMM3 3基因型、组织型基因型、组织型 M M2 2M M2 2 MMMM2 2 -Lys -Lys M M1 1M M2 2 MM MM1 1 -2 Lys -2 Lys M M1 1M M1 1 CK-MBCK-MB亚型亚型: : CK-MBCK-MB1 1 -2Lys-2Lys, , CK-MBCK-MB2 2（组织型）（组织型）在电泳缓冲液中加入在电泳缓冲液中加入PolybufferPolybuffer, , 通电后形成一通电后形成一pHpH梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至
25、阴极依次梯度，进行等电聚胶电泳，自阳极至阴极依次为为CK-MMCK-MM1 1、CK-MMCK-MM2 2和和CK-MMCK-MM3 3。然后以常规。然后以常规CKCK同工同工酶电泳法原理进一步定量。酶电泳法原理进一步定量。 参考值CK-MMCK-MM1 1 57.057.04.7%4.7% CK-MM CK-MM2 2 26.526.55.3%5.3% CK-MM CK-MM3 3 15.8 15.82.5%2.5% CK-MM CK-MM3 3/CK-MM/CK-MM1 1 0.280.280.050.05（0.15-0.390.15-0.39）1 1诊断心肌坏死和损伤诊断心肌坏死和损伤
26、（1 1）早期诊断心肌梗死）早期诊断心肌梗死 心肌酶心肌酶 初次升高的初次升高的 峰值时间峰值时间 回复正常回复正常 通常采样通常采样 时间范围时间范围(h) (h) (非溶栓非溶栓) ) 时间时间 时间表时间表 CKCK 4 4 24 24 3 35d5d CK-MB 3 CK-MB 31212 24h 24h 48 4872h 72h 每每12h12h* *一次一次3 3 CK-MMCK-MM3 3 1 16 6 12h 12h 38h 38h胸痛后胸痛后6060minmin90min90min CK-MB CK-MB2 2 2 26 6 18h 18h 未知未知 同上同上 LDHLDH
27、12 121818 3d 3d 7 714d14d LDH LDH1 1 8 81010 24 2448h48h 10 1014d14d 胸痛后胸痛后24h24h一次一次 AST 6AST 68 8 48 486060 4 45d5d ASTm ASTm 1212 36h 36h 5d 5d 胸痛后胸痛后12h12h一次一次3 3 心肌酶谱测定的临床意义心肌酶谱测定的临床意义心肌梗死诊断的实验室指标的特性心肌梗死诊断的实验室指标的特性实验室实验室 分子量分子量 生理半衰期生理半衰期 升高时间升高时间 峰值时间峰值时间 恢复正常时恢复正常时间间 指标指标 (KD) (h) (h) (h) (d)
28、CK 86 17 312 1224 34CK-MB活性活性 86 13 312 1224 23CK-MB质量质量 86 13 26 1224 3早期急性心肌梗死的诊断灵敏度早期急性心肌梗死的诊断灵敏度 胸痛后时间胸痛后时间( (h)h) 指指 标标 - 0 02 32 34 54 56 6 - -CK 15 35 70 CK 15 35 70 CK-MBCK-MB活性活性 10 25 55 10 25 55 CK-MBCK-MB质量质量 30 70 90 30 70 90 - - 1 1诊断心肌坏死和损伤诊断心肌坏死和损伤 （1 1）早期诊断心肌梗塞）早期诊断心肌梗塞 （2 2）有助于非）有助
29、于非Q Q波急性心肌梗死的诊断波急性心肌梗死的诊断 （3 3）诊断梗塞延展或再梗死）诊断梗塞延展或再梗死 （4 4）估计心肌梗死面积）估计心肌梗死面积 （5 5）围手术期和围产期心肌损伤的诊断）围手术期和围产期心肌损伤的诊断 （6 6）监护心肌损害或药物对心肌的损害）监护心肌损害或药物对心肌的损害 心肌酶心肌酶 建议标准建议标准 敏感性（敏感性（% %） 特异性（特异性（% %） CKCK 达峰值时间达峰值时间4h 10 82 4h 10 82 达峰值时间达峰值时间16h 39 813.1%/3.1%/h 87 74h 87 749090 60min 60min内内CK-MMCK-MM3 3/
30、CK-MM/CK-MM1 10.35 60 100 0.35 60 100 CK-MM CK-MM3 3升高率升高率0.18%/min 92 1000.18%/min 92 100 CK-MB CK-MB 1h 1h升高率升高率0.040.04ULUL-1-1minmin-1 -1 92 2092 20 下壁心梗下壁心梗90min90min后增加后增加2.22.2倍倍 77 100 77 100 前壁心梗前壁心梗90min90min后增加后增加2.52.5倍倍 92 10092 100 CK-MB CK-MB亚型亚型 2 2h CK-MBh CK-MB2 2/CK-MB/CK-MB1 1峰值峰值3.8 823.8 82 78 78 2 2判断心肌再灌注判断心肌再灌注
