1、第五章第五章 DNA的生物合成的生物合成第一节第一节 原核生物的原核生物的DNA复制复制第二节第二节 真核生物的真核生物的DNA复制复制第三节第三节 DNA的损伤修复的损伤修复第四节第四节 DNA的重组的重组lDNA具有储存、传递（包括复制、转录、翻译）具有储存、传递（包括复制、转录、翻译）和接受（反转录）遗传信息的功能。和接受（反转录）遗传信息的功能。lDNA的生物合成包括的生物合成包括DNA的复制、损伤修复和重的复制、损伤修复和重组。组。lDNA复制是保持复制是保持DNA分子的忠实拷贝过程，具有分子的忠实拷贝过程，具有高度的忠实性，高度的忠实性，DNA修复和重组是影响遗传信息修复和重组是影
2、响遗传信息本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。第一节第一节 原核生物的原核生物的DNA复制复制u复制（复制（replication）是以亲代的）是以亲代的DNA为模板合成出相同为模板合成出相同DNA分子的过程，也是遗传信息从亲代向子代的传递过分子的过程，也是遗传信息从亲代向子代的传递过程，因此与细胞的增殖有关。程，因此与细胞的增殖有关。u染色体外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核生物的染色体外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核生物的细胞器及细胞内共生生物的细胞器及细胞内共生生物的DNA。它们的复制方式或受。它们的复制方式或受染色体复制的控制，与染色体
3、复制同步；或不受染色体染色体复制的控制，与染色体复制同步；或不受染色体复制的控制，在细胞周期中随时都可以进行。复制的控制，在细胞周期中随时都可以进行。u如果病毒如果病毒DNA整合到宿主染色体中，则该整合到宿主染色体中，则该DNA作为宿作为宿主染色体的一部分而被复制。主染色体的一部分而被复制。 一一. DNA的半保留复制的半保留复制（一）概念（一）概念DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两股单解开为两股单链，各自作为模板链，各自作为模板(template)按碱基配对规按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。律，合成与模板互补的子链。子代细胞的子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地，一
4、股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制半保留复制亲亲代代第第一一代代第第二二代代（二）半保留复制的实（二）半保留复制的实验证据验证据 1958年年Meselson和和Stahl用同位素用同位素15N标标记大肠杆菌记大肠杆菌DNA，首，首先证明了先证明了DNA的半保的半保留复制。留复制。重重轻轻杂和杂和 DNA杂和杂和 DNA新链新链旧链旧链 按半保留复制方式，子按半保留复制方式，子代代DNA与亲代与
5、亲代DNA的的碱碱基序列一致基序列一致，即子代保留，即子代保留了亲代的全部遗传信息，了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的体现了遗传的保守性保守性. 遗传的保守性，是物种遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但稳定性的分子基础，但不不是绝对的是绝对的。子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 （四）（四） 复制的起点和方向复制的起点和方向1.概念概念 复制子复制子(replicon)：基因组能基因组能独立进行复制的单位。独立进行复制的单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复
6、制复制子子. . 起点起点(origin)：也称原点，：也称原点，控制复制起始，是含有控制复制起始，是含有100200个碱基对的一段个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识。细胞内存在着能识别起点的特殊蛋白质别起点的特殊蛋白质(大肠杆菌中称为大肠杆菌中称为Dna A蛋白蛋白)。终点终点(terminus)：终止复制的序列位点终止复制的序列位点.复制叉复制叉(replication fork)：复制开始后由于：复制开始后由于DNA双链解开，在双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。A. 环状双链环状双链DNA及复制起始点及
7、复制起始点B. 复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C原核生物：原核生物：只有一个复制子只有一个复制子真核生物：真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个多个复制子，多个起点，形成多个 “复制眼复制眼”或或“复制泡复制泡”53oriorioriori535533553复制子复制子32.起始点和方向起始点和方向 1）原核生物和真核生物复制都是在）原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和和TTATCC
8、ACA，多次出现，可被酶识别。，多次出现，可被酶识别。 2）方向：大多是双向、对称复制）方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或不对也有单向或不对称的。称的。 3）速度：原核复制叉移动快）速度：原核复制叉移动快(约约1000个核苷酸个核苷酸/ s); 真核生物复制叉移动慢真核生物复制叉移动慢(约约50个核苷酸个核苷酸/s) 。典型动物细。典型动物细胞所含胞所含DNA是细菌中的是细菌中的50倍左右，但两者倍左右，但两者DNA的复制的复制时间差异不很大（大肠杆菌时间差异不很大（大肠杆菌40min，真核通常几小时），真核通常几小时），因为真核生物为多复制子。因为真核生物为多复制子。二二. . DNA
9、DNA聚合酶聚合酶 ( DNA polymerase, ( DNA polymerase, DNA-pol DNA-pol ) )(一一)DNA聚合酶的反应特点聚合酶的反应特点lDNA聚合酶是一种催化依赖模板的以脱氧核聚合酶是一种催化依赖模板的以脱氧核苷三磷酸为前体合成苷三磷酸为前体合成DNA的酶。的酶。l1956 年年 Arthur kornberg 等首先从大肠杆菌等首先从大肠杆菌中发现中发现DNA聚合酶，其后在不同的生物中都找聚合酶，其后在不同的生物中都找到有这种酶。到有这种酶。DNA聚合酶的反应特点：聚合酶的反应特点： 4 4种种dNTP底物：底物：(dATP dGTP dCTP dT
10、TP)； 接受模板指导接受模板指导: 解开成单链的解开成单链的DNA母链；母链； 需引物提供需引物提供3-OH； 新链生长方向：新链生长方向： 53； 产物产物DNA性质性质与模板相同。与模板相同。 此外此外, DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.模板模板DNA链链引引 物物新加入的新加入的dNTP脱氧核糖脱氧核糖亲核攻击亲核攻击53生长的生长的DNA链链* * 引物引物 (primer) 是一和模板链互补的线性片段是一和模板链互补的线性片段, 其上带有其上带有能与核苷酸相结合的游离能与核苷酸相结合的游离3-OH. 引物通常是寡聚引物通常是寡聚RNA.（二）
11、大肠杆菌（二）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 有五种，即有五种，即DNA聚合酶聚合酶、和和。1. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol 也称也称Kornberg酶酶, 是各种是各种DNA聚合酶中研究的最透聚合酶中研究的最透彻的，它的一些特点代表了彻的，它的一些特点代表了DNA聚合酶的基本特点：聚合酶的基本特点：1） pol 的性质的性质 分子量：分子量：103 000，单链，球形，活性部位含，单链，球形，活性部位含 Zn2, 每个细胞有每个细胞有400个酶分子。个酶分子。323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨
12、基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进，进行分子生物学研究中常用的工具酶。行分子生物学研究中常用的工具酶。 模模 板板聚合酶活聚合酶活性位点性位点引物引物3 5 外外切酶位点切酶位点2）功能：）功能： 53聚合酶活性（大片段上）；聚合酶活性（大片段上）； 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用；（错误率发挥聚合作用；（错误率10-5） 3 5外切酶活性（大片段上）；外切酶活性（大片段上）； 仅对短的
13、单链仅对短的单链DNA起作用，主要是对新生起作用，主要是对新生DNA链进行链进行校对，防止校对，防止“错配错配”； （错误率（错误率5*10-2） 53外切酶活性（小片段上）。外切酶活性（小片段上）。 仅作用于双链仅作用于双链DNA，可切除由紫外线照射形成的嘧啶二，可切除由紫外线照射形成的嘧啶二聚体，也可切除冈崎片段聚体，也可切除冈崎片段5端端RNA引物。引物。2）功能：）功能： 53聚合酶的选择作用和聚合酶的选择作用和3 5外切酶的校对作用使外切酶的校对作用使DNA复制过程受到双重核对，大大减少了错误率。复制过程受到双重核对，大大减少了错误率。 可见，可见，DNA pol是是1 1个多功能酶
14、。但它不是个多功能酶。但它不是DNADNA合成合成的主要酶，持续合成能力（指的主要酶，持续合成能力（指DNADNA聚合酶解离前所能加上聚合酶解离前所能加上的核苷酸的平均数目）较低。的核苷酸的平均数目）较低。 故其功能主要是：对复制中的错误进行校读，对故其功能主要是：对复制中的错误进行校读，对DNA损伤进行修复，以及在损伤进行修复，以及在DNA复制时复制时RNA引物的切除及其引物的切除及其空隙的填补。空隙的填补。2. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol 1） 多亚基，多亚基， 聚合酶亚基聚合酶亚基 (单链单链) 分子量为分子量为88 000, 每个细胞有每个细胞有100个酶分子个酶分子
15、2）功能：）功能： 53聚合酶活性；聚合酶活性； 35外切酶活性。外切酶活性。 （该酶无该酶无53外切酶活性外切酶活性; ;且活性低，表明该且活性低，表明该酶仍不是主要的复制酶，可能是一种修复酶。一酶仍不是主要的复制酶，可能是一种修复酶。一般在无般在无DNADNA聚合酶聚合酶和酶和酶时，该酶才起作用，具时，该酶才起作用，具体功能仍不清楚）体功能仍不清楚） 目前认为该酶主要参与目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。损伤的修复。3. 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 pol 真正的真正的DNA复制酶，复制酶，1971年发现年发现 1）pol 是真正起复制作用的酶是真正起复制作用的酶，由由10种亚
16、基组种亚基组成成不对称二聚体不对称二聚体, 含含Zn2+，、组成核心酶组成核心酶 2）功能：）功能： 53聚合酶活性（聚合酶活性（ 亚基）；亚基）； 35外切酶活性（外切酶活性（ 亚基）。亚基）。 该酶在原核细胞中主要负责该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸，是链的延伸，是复制延长中真正起催化作用的酶。复制延长中真正起催化作用的酶。 (该酶该酶无无53外切酶活性外切酶活性) E. coli DNA 聚合酶聚合酶不对称二聚体不对称二聚体 可滑动的可滑动的 夹持器亚基夹持器亚基催化亚基催化亚基3 5 外切酶亚基外切酶亚基前导链前导链 合成合成后随链后随链 合成合成 夹持器夹持器装置装置催化亚基催
17、化亚基 亚基保持核心酶亚基保持核心酶 的二聚体结构的二聚体结构酶酶的的各各个个亚亚基基的的作作用用见见表表5-1.亚基具有亚基具有53方向合成方向合成DNA的催化活性的催化活性亚基具有亚基具有35外切酶活性，起校对功能，外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶可提高聚合酶复制复制DNA的保真性的保真性 亚基可能亚基可能起组建的作用起组建的作用亚基犹如夹子，亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动分子向前滑动 亚基亚基起着促使核心酶二聚化的作用起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成其余的亚基构成 -复合物，复合物，主要功能是帮助主要功能是帮助 亚基夹住亚基夹住D
18、NA（也称夹子装置器），并有（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用增强核心酶活性的作用DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 4 105 3 聚合酶活性聚合酶活性 + + + 3 5 外切酶活性外切酶活性 + + +5 3 外切酶活性外切酶活性 + - - - -聚合速度聚合速度(核苷酸核苷酸/分分) 1 0001 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3200 1 500 500 000分子数分子数/细胞细胞 400 100 1020功能功能 切除引物切除引物,修复修复 修复修复 复制复制表表 大肠杆菌大肠杆菌3种种DN
19、A聚合酶性质比较聚合酶性质比较4）大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 和和l1999年发现年发现DNA聚合酶聚合酶 和和，参与，参与DNA的错误的错误倾向修复。倾向修复。l当当DNA受到严重损伤时，正常的受到严重损伤时，正常的DNA聚合酶在该聚合酶在该处不能形成正确的碱基配对而停止修复，此时诱处不能形成正确的碱基配对而停止修复，此时诱导产生这两种酶，能在损伤部位继续复制，但修导产生这两种酶，能在损伤部位继续复制，但修复的准确性较差，会造成较高的突变率，这虽然复的准确性较差，会造成较高的突变率，这虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细
20、胞得以存活，从而延续种系。少数突变的细胞得以存活，从而延续种系。（三）与（三）与DNA的复制过程有关的其他酶和蛋白质的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子因子 （以大肠杆菌为例 ）l除除DNA聚合酶外，还需要聚合酶外，还需要20多种不同的酶和蛋白多种不同的酶和蛋白质因子的参与，整个复合物统称为质因子的参与，整个复合物统称为DNA复制酶系复制酶系统统(DNA replicase system)或者复制体或者复制体(replisome)。l解旋酶解旋酶（helicase） ：DNA复制时，解旋酶沿着复制时，解旋酶沿着DNA母链滑动使之解旋，同时打开双链之间的氢母链滑动使之解旋，同时打开双链之间的氢键，
21、这一过程所消耗的化学能通过键，这一过程所消耗的化学能通过ATP水解提供。水解提供。（三）与（三）与DNA的复制过程有关的其他酶和蛋白质的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子因子 （以大肠杆菌为例 ）l拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase） ：用于消除螺旋状：用于消除螺旋状DNA解旋时产生的拓扑应力。拓扑异构酶解旋时产生的拓扑应力。拓扑异构酶I主要集主要集中在活性转录区，与转录有关；拓扑异构酶中在活性转录区，与转录有关；拓扑异构酶II分布分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。 l单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（single strand
22、DNA binding protein, SSB） l引物酶引物酶（primase） ：促使引物合成：促使引物合成 。 lDNA连接酶连接酶（DNA ligase）可分为三个阶段：合成的可分为三个阶段：合成的起始，延伸，终止起始，延伸，终止。（一）起始（以大肠杆菌为例，图（一）起始（以大肠杆菌为例，图5-9）l至少有至少有9种酶或蛋白质参与复制的起始。种酶或蛋白质参与复制的起始。l起始位点是起始位点是245bp构成的高度保守序列，有两个关键构成的高度保守序列，有两个关键序列，一个由序列，一个由13bp组成的组成的3次重复片段和一个由次重复片段和一个由9bp组成的组成的4次重复片段。次重复片段。
23、l合成起始阶段的关键部分是合成起始阶段的关键部分是DnaA蛋白（只与负超螺蛋白（只与负超螺旋的旋的DNA相结合）。相结合）。l原核生物的原核生物的SSB与与DNA的结合有明显的协同效应。的结合有明显的协同效应。三、双链三、双链DNADNA复制的分子机制复制的分子机制图图5-9. 大肠杆菌起始点大肠杆菌起始点oriC的复制引发模型的复制引发模型A. 约约20个各带个各带1个个ATP 的的DnaA蛋白蛋白 结合于结合于 9bp序列，使序列，使DNA围围 绕着复合物卷成一圈绕着复合物卷成一圈B.三个富含三个富含A=T的的 13bp重复序列被变性重复序列被变性C.在在DnaC蛋白蛋白 的帮助的帮助 下
24、下DnaB蛋白进一步蛋白进一步 使使DNA解螺旋，以解螺旋，以 备引物和备引物和DNA的合成的合成3组13个碱基对重复DnaA+ATP4组9个碱基对重复oriCHU+ATPDnaBDnaC+ ATPDnaB解旋酶引发与复制ACB表表5-3大肠杆菌复制起始点引发大肠杆菌复制起始点引发DNA复制所需的蛋白质复制所需的蛋白质蛋白质蛋白质 亚基数亚基数功能功能DnaA蛋白质蛋白质 1识别起始点序列，在起始点特异部识别起始点序列，在起始点特异部位解开起始点双链位解开起始点双链DnaB蛋白质（解旋酶）蛋白质（解旋酶）6使使DNA解旋，解开解旋，解开DNA双链双链 DnaC蛋白质蛋白质1帮助帮助DnaB结合
25、在起点结合在起点 HU2类组蛋白；使类组蛋白；使DNA弯曲，刺激复制弯曲，刺激复制的引发的引发引物酶（引物酶（DnaG蛋白质）蛋白质）1合成合成RNA引物引物 单链单链DNA结合蛋白质结合蛋白质（SSB） 4结合单链结合单链DNARNA聚合酶聚合酶 5有利于提高有利于提高DnaA的活性的活性DNA旋转酶（旋转酶（DNA拓扑拓扑异构酶异构酶） 4消除因消除因DNA解旋而产生的应力解旋而产生的应力 Dam甲基化酶甲基化酶 1使使ori C处（处（5）GATC序列甲基化序列甲基化 （二）延伸（二）延伸lDNA的两条链都能作为模板。的两条链都能作为模板。l由于由于DNA分子的一条链的走向为分子的一条链
26、的走向为35，另一条，另一条链为链为53；而所有已知；而所有已知DNA聚合酶的合成方向聚合酶的合成方向都是都是53。l为了解决这个矛盾，为了解决这个矛盾，1968年，日本学者年，日本学者Okazaki等提出了等提出了DNA的不连续复制模型，认为：的不连续复制模型，认为：l沿沿35模板链合成的子链是连续合成，而沿模板链合成的子链是连续合成，而沿53方向合成的子链是分段合成，由许多方向合成的子链是分段合成，由许多DNA片段连接起来的。片段连接起来的。1、冈崎片段和半不连续复制、冈崎片段和半不连续复制l以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是35走走向，在
27、其上向，在其上DNA能以能以53 方向连续合成，称为方向连续合成，称为前导链前导链（leading strand）；）；l另一条模板链是另一条模板链是53走向，在其上走向，在其上DNA也是从也是从53 方方向合成，但是与复制叉移动的方向正好相反，所以随着复向合成，但是与复制叉移动的方向正好相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后连成一条完整制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后连成一条完整的的DNA链，该链成为链，该链成为滞后链或后随链滞后链或后随链（lagging strand）。）。 l冈崎片段冈崎片段(Okazaki fragment)： 在不连续的后随链在不连续的后随链D
28、NA合成中形成的合成中形成的DNA短短片段片段，在原核生物为，在原核生物为10002000核苷酸，真核生核苷酸，真核生物约物约100200核苷酸。核苷酸。1968年冈崎发现。年冈崎发现。DNA的半不连续复制的半不连续复制: DNA双链复制时，一条链是连续合成的双链复制时，一条链是连续合成的(前前导链导链, leading strand)，另一条链是不连续合成，另一条链是不连续合成的的(滞后链或后随链滞后链或后随链, lagging strand)，这种前导，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。的半不连续复制。3 5 3 5
29、3 5 3 5 解链方向解链方向领头链领头链(leading strand)后随链后随链(lagging strand)DNADNA的半不连续复制的半不连续复制3 5 复制叉复制叉起点起点复制叉复制叉延伸延伸延伸延伸起点起点领头链领头链领头链领头链随后链随后链随后链随后链3535DNA的双向复制的双向复制5555555533333332、DNA半不连续复制中的半不连续复制中的RNA引物引物 （1）前导链和滞后链的合成都需要）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。引物。 （2）引物合成酶）引物合成酶(Dna G)：是以：是以DNA为模板的为模板的RNA聚合聚合酶（合成方向酶（合成方向53），与）
30、，与DNA聚合酶不同的是，它不需聚合酶不同的是，它不需要引物，只需要要引物，只需要DNA模板，就可以在其上合成新的模板，就可以在其上合成新的RNA链。链。 (3) 引物引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。板顺序及其二级结构的影响。 （4）DNA聚合酶聚合酶切除前导链及冈崎片段的引物后切除前导链及冈崎片段的引物后, 填补填补空缺，由空缺，由DNA连接酶将切口连接。连接酶将切口连接。 RNA引物的合成称作引物的合成称作“引发引发” 。 后随链的合成需多次引发作用，而发动前后随链的合成需多次引发作用，而发动前导链的合成只需一
31、次引发。导链的合成只需一次引发。 前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，前者大约为些，前者大约为1060核苷酸，后者通常为核苷酸，后者通常为510核苷酸。核苷酸。 成熟的成熟的DNA是不含是不含RNA的，的，RNA引物最终被引物最终被DNA所置换。所置换。3、DNA连接酶（连接酶（ligase）催化两段催化两段DNA之间的连接之间的连接:35535353HOP DNA ligaseNADATPNMNAMP+PPi+lDNA连接酶（连接酶（1967年发现）：年发现）：若双链若双链DNA中一条链有中一条链有切口切口, 一端是一端是3-OH，另一端是，另一端
32、是5-磷酸基，连接酶可催磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 l但它不能将两条游离的但它不能将两条游离的DNA单链连接起来。单链连接起来。l磷酸基必需通过腺苷化激活。大肠杆菌和其它细菌的磷酸基必需通过腺苷化激活。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要连接酶需要NAD+提提供能量供能量; ;在高等生物和噬菌体在高等生物和噬菌体中，则要中，则要ATPATP提供能量。提供能量。3535OHOHP P4. 母本母本DNA双链的分离双链的分离 (1) DNA解链酶解链酶(解螺旋酶解螺旋酶, Dna B)：通过水解：通过水解ATP将复将复制叉前方的制
33、叉前方的DNA双链打开。每解开一对碱基需要水解双链打开。每解开一对碱基需要水解2个个ATP分子。分子。 (2) 单链结合蛋白单链结合蛋白(SSB)：稳定已被解开的：稳定已被解开的DNA单链，单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。 (3) DNA旋转酶或拓扑异构酶旋转酶或拓扑异构酶: 兼有内切酶和连接酶兼有内切酶和连接酶活性活性, 可迅速使可迅速使DNA两条链断开又接上两条链断开又接上, 消除解链酶产生消除解链酶产生的拓扑张力。的拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATP提供能量提供能量, 同同复制有关。复制有关。（三）终止（三）终止l复制的
34、最后，大肠杆菌染色体的两个复制叉在终复制的最后，大肠杆菌染色体的两个复制叉在终止区域相遇，这个区域含有止区域相遇，这个区域含有20个碱基对序列，叫个碱基对序列，叫做做Ter序列序列（Terminus，终止的意思）。该序列，终止的意思）。该序列排列在染色体上造成一种陷阱，即复制叉到此就排列在染色体上造成一种陷阱，即复制叉到此就停止不再向前进行。停止不再向前进行。lTer序列的功能是结合一种叫做序列的功能是结合一种叫做Tus的蛋白质的蛋白质(terminus utilization substance, 即终止利用物质即终止利用物质). Tus-Ter复合体能够阻止单方向前进的复制叉，该复合体能够
35、阻止单方向前进的复制叉，该复合体只能对一个复制叉起作用。复合体只能对一个复制叉起作用。（三）终止（三）终止l当一个复制叉遇到当一个复制叉遇到Tus-Ter复合体时，复制停止；另一复制复合体时，复制停止；另一复制叉在遇到已停止的复制叉时复制也随之停止。最后的数百叉在遇到已停止的复制叉时复制也随之停止。最后的数百个位于这些大的蛋白质复合体之间的碱基对尚没被复制。个位于这些大的蛋白质复合体之间的碱基对尚没被复制。l其后两条亲代母链解开，通过修复方式填补空缺，形成了其后两条亲代母链解开，通过修复方式填补空缺，形成了两个交联在一起的环状染色体。这种拓扑互联环称为两个交联在一起的环状染色体。这种拓扑互联环
36、称为连环连环体（体（catenane）, 大肠杆菌的交联大肠杆菌的交联DNA环的分离需要拓扑异环的分离需要拓扑异构酶构酶IV（一种（一种II型拓扑异构酶），分离开的染色体在细胞型拓扑异构酶），分离开的染色体在细胞分裂时分别进入子细胞。包括真核生物的分裂时分别进入子细胞。包括真核生物的DNA病毒在内的病毒在内的其他环状染色体复制的终止机制都与此类似。其他环状染色体复制的终止机制都与此类似。 细菌复制终止区含有多个约细菌复制终止区含有多个约20bp的终止子的终止子(terminator)位点，位点，E. coli 有有7个终止子位点。个终止子位点。 总结总结: : 原核生物原核生物DNA的复制过程
37、的复制过程:(以大肠杆菌为例以大肠杆菌为例) 起始起始-RNA引物的合成引物的合成 DNA链的延伸链的延伸 终止终止B. RNA引物的合成引物的合成 引发体先与引发体先与DNA起始部位双链结合，通过起始部位双链结合，通过引引物合成酶物合成酶形成前导链引物后，再沿形成前导链引物后，再沿53模板模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的冈崎片段的 RNA 引物。引物。A. 双链的解开双链的解开 DNA旋转酶旋转酶(拓扑异构酶拓扑异构酶)、 DNA解链酶、解链酶、单链结合蛋白协同作用单链结合蛋白协同作用C. DNA链的延伸链的延伸 在在DNA po
38、l 的催化下，以四种的催化下，以四种dNTP为底物，在为底物，在RNA引物的引物的3 端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和后随链链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。的合成。 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol前导链的延长：前导链的延长： DNA pol 全酶二聚体的一个亚基与前导链全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。滞后链的延长滞后链的延长l滞后链上合成的冈崎
39、片段是多种酶共同作用的结果。滞后链上合成的冈崎片段是多种酶共同作用的结果。DnaB解旋酶和解旋酶和DnaG引物酶组成了一个复制的功能单元，引物酶组成了一个复制的功能单元，称为引发体称为引发体(primosome)。lDNA聚合酶聚合酶以其一套核心部分（核心聚合酶）连续合成以其一套核心部分（核心聚合酶）连续合成前导链，同时，另一套核心聚合酶在滞后链环上从一个冈前导链，同时，另一套核心聚合酶在滞后链环上从一个冈崎片段滑动到另一个冈崎片段。崎片段滑动到另一个冈崎片段。l当冈崎片段合成到一定长度，其当冈崎片段合成到一定长度，其3-OH遇到上一个遇到上一个冈崎片段时即停止合成，冈崎片段时即停止合成，DN
40、A聚合酶聚合酶III的核心部分的核心部分与与滑动夹滑动夹(及完成的冈崎片段）分离，然后再俘获及完成的冈崎片段）分离，然后再俘获新的新的滑动夹，新的冈崎片段的合成开始。滑动夹，新的冈崎片段的合成开始。l一旦冈崎片段合成完成，通过一旦冈崎片段合成完成，通过DNA聚合酶聚合酶I去除其去除其RNA引物，以前一个冈崎片段的引物，以前一个冈崎片段的3-羟基为引物，催羟基为引物，催化合成化合成DNA取而代之，并形成一个切口，这个切口取而代之，并形成一个切口，这个切口由由DNA连接酶连接封闭。连接酶连接封闭。l合成过程中复制复合物本身并没有不断移动，而合成过程中复制复合物本身并没有不断移动，而是靠与质膜结合的
41、是靠与质膜结合的DNA移动通过固定的复合物来移动通过固定的复合物来实现。实现。l这个合成的过程是相当快速的，新这个合成的过程是相当快速的，新DNA的每条链的每条链(前导链和滞后链前导链和滞后链)大约每秒添加大约每秒添加1000个核苷酸。个核苷酸。 DNADNA聚合酶聚合酶催化领头链和随从链同时合成催化领头链和随从链同时合成D. 复制终止复制终止 细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。在终止区相遇而停止复制，复制体解体。 这样这样, 以两条亲代以两条亲代DNA链为模板，各自形链为模板，各自形成一条新的成一条新的DNA互补链，结
42、果形成了两个互补链，结果形成了两个DNA双股螺旋分子。双股螺旋分子。复制的保真性复制的保真性 ( fidelity ) 主要依赖主要依赖 3 种机制：种机制： 聚合酶对碱基的选择；聚合酶对碱基的选择； 3 5方向的方向的外切核酸酶活性起校正作用外切核酸酶活性起校正作用; ; 复制后错配现象的特异性修复机制。复制后错配现象的特异性修复机制。5. DNA聚合酶的聚合酶的“校对校对”(proofreading)作用作用 大肠杆菌大肠杆菌DNA复制错配率约复制错配率约10-910-10。其染。其染色体中有色体中有4.5106bp，平均每，平均每1 00010 000个细个细胞经过一次分裂才会插入一个不
43、正确的碱基。胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。小结小结维持维持DNA复制准确性的因素：复制准确性的因素：内因内因: 按碱基配对原则按碱基配对原则 DNA聚合酶的作用聚合酶的作用 对碱基的识别作用对碱基的识别作用-选择正确的碱基掺入到引选择正确的碱基掺入到引物末端；物末端； 对底物的识别作用对底物的识别作用-先识别引物最后一个碱基先识别引物最后一个碱基是否正确是否正确, 后识别掺入的后识别掺入的dNTP是否正确；是否正确； 校正阅读校正阅读- 3 5外切酶的作用；外切酶的作用； RNA引物最终被切除引物最终被切除, 提高了复制准确性；提高了复制准确性； 复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统
44、。复制完成后对错配碱基进行修复的酶系统。外因：外因： 四种四种dNTP要平衡；要平衡； Mn2+和和Mg2+的比例、浓度（酶活）的比例、浓度（酶活）DNA复制的分子机制的基本特点复制的分子机制的基本特点 l复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。l复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。l复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。l复制时，复制时，DNA的两条链都从的两条链都从5端向端向3端延伸。端延伸。l前导链是连续合成，而后续
45、链是不连续合成。前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。lDNA的合成始于的合成始于RNA引物的合成，因此前导链只有一次引物的合成，因此前导链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每个都有合成，滞后链的冈崎片断每个都有RNA引物的合成。引物的合成。RNA引物随后由引物随后由DNA片段替换，相邻的片段替换，相邻的DNA片段连接形成片段连接形成一条完整的一条完整的DNA链。链。lDNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持DNA分分子的准确性和忠实性。子的准确性和忠实性。第二节第二节 真核生物的真核生物的DNA复制复制l真核生物中的真核生物中的DNA分子通常
46、比大肠杆菌分子通常比大肠杆菌等原核生物大；等原核生物大；l真核生物的真核生物的DNA通常都与组蛋白构成核通常都与组蛋白构成核小体，以染色质的形式存在于细胞核中；小体，以染色质的形式存在于细胞核中；l真核生物真核生物DNA复制的冈崎片段长约复制的冈崎片段长约200bp左右，相当于一个核小体左右，相当于一个核小体DNA的碱基对的碱基对长度。长度。 一、一、 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol 现认为其功能只是合成引物现认为其功能只是合成引物DNA-pol 在复制延长中起催化作用在复制延长中起催化作用DNA-pol 校对、修复、填补校对、修复、填补(类似类似E.coli DNA p
47、ol I )DNA-pol 线粒体线粒体DNA合成合成DNA-pol 核核DNA修复修复与原核生物的与原核生物的DNA聚合酶相似：均以聚合酶相似：均以4种脱氧核苷种脱氧核苷三磷酸为底物，需三磷酸为底物，需Mg2+激活，有模板和含有游离激活，有模板和含有游离3-OH引物存在，新链向引物存在，新链向53方向延伸。方向延伸。 484l细胞核染色体的复制由细胞核染色体的复制由DNA聚合酶聚合酶、和和共同完成共同完成 。聚合。聚合酶酶 合成引物，聚合酶合成引物，聚合酶是主要的复制酶，聚合酶是主要的复制酶，聚合酶可能相当可能相当于细菌于细菌DNA聚合酶聚合酶，是修复酶，是修复酶 ，也有报道它参与前导链，也
48、有报道它参与前导链的合成。的合成。lDNA聚合酶聚合酶与另一种称为与另一种称为增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的复制因子相结合，构成真核）的复制因子相结合，构成真核生物的复制复合体，该因子由四个相对分子量为生物的复制复合体，该因子由四个相对分子量为29 000的亚的亚基组成一个环状的同源四聚体。基组成一个环状的同源四聚体。PCNA相当于大肠杆菌相当于大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的的亚基亚基，它形成的环状夹子稳定，它形成的环状夹子稳定DNA聚合酶聚合酶和和DNA的相互作用，极大增加聚合酶的持续合成能力。的相互作用，极大
49、增加聚合酶的持续合成能力。l现也有报道一些新发现的现也有报道一些新发现的DNA聚合酶如聚合酶如DNA聚合酶聚合酶、和和Rev1, 他们主要参与他们主要参与DNA的损伤修复，因此保真性较低。的损伤修复，因此保真性较低。 l在真核生物的在真核生物的DNA复制中，复制中，复制蛋白复制蛋白-A（replication protein A, RPA）是真核生物的单）是真核生物的单链链DNA结合蛋白，相当于大肠杆菌的结合蛋白，相当于大肠杆菌的SSB蛋白。蛋白。l复制因子复制因子-C（replication factor C, RFC）由一个）由一个大亚基（大亚基（145kD）和四个小亚基（）和四个小亚基（
50、40，38，37和和36kD）组成，）组成，具有具有DNA依赖的依赖的ATP酶活性酶活性，是，是夹子装置器（夹子装置器（clamp loader），相当于大肠杆菌），相当于大肠杆菌的的复合体，帮助复合体，帮助PCNA因子在因子在DNA双链的装卸。双链的装卸。此外，它还促进复制体的装配。此外，它还促进复制体的装配。二、染色质复制二、染色质复制l也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。l也是也是DNA聚合酶和多种蛋白的协调作用的聚合酶和多种蛋白的协调作用的结果。结果。l在复制叉上有一个在复制叉上有一个DNA聚合酶聚合酶，以合成，以合成引物；引物； DNA聚合酶聚合酶
