1、分子生物分子生物学常用技学常用技术术 第十七章第十七章分子生物学常用技术分子生物学常用技术 凝胶电泳凝胶电泳 分子杂交分子杂交 聚合酶链反应聚合酶链反应( (PCR)PCR)技术技术 DNA DNA的物理图谱的物理图谱 DNA DNA序列测定序列测定 基因芯片基因芯片第一节第一节 凝胶电泳凝胶电泳( (gel electrophoresis)gel electrophoresis) 电泳概念电泳概念 基本原理基本原理 Q Q 6 6rr : : 迁移率迁移率 Q : Q : 电荷量电荷量 r : r : 粒子半径（分子量）粒子半径（分子量） : : 介质粘介质粘度度 电泳的用途电泳的用途分离分
2、离鉴定纯度鉴定纯度测定分子量测定分子量 凝胶电泳的种类凝胶电泳的种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳一、琼脂糖凝胶电泳( (agarose gel electrophoresis)agarose gel electrophoresis) 分离核酸原理分离核酸原理 操作要点操作要点 应用范围应用范围（一）分离核酸原理（一）分离核酸原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应 分子构象分子构象1. 1. 电荷效应电荷效应 核酸是两性电解质核酸是两性电解质 pH = 3.5 , pH = 3.5 , 正电荷正电荷 pH = 8.0 pH = 8.
3、08.3 8.3 , , 负电荷，正极负电荷，正极2.2.分子筛效应分子筛效应 小分子移动快小分子移动快 ，大分子移动慢，大分子移动慢3. 3. 分子构象分子构象 闭环超螺旋闭环超螺旋 线状线状DNADNA开环开环DNA DNA +-（二）操作要点（二）操作要点 支持物支持物 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 DNADNA分子量标准分子量标准 电泳缓冲液电泳缓冲液 样品制备样品制备 电泳条件电泳条件 DNADNA电泳染色电泳染色 DNADNA片段的回收片段的回收 1. 1. 支持物支持物商品化的琼脂糖商品化的琼脂糖琼脂糖种类琼脂糖种类普通普通低熔点低熔点高纯高纯高筛分高筛分熔点熔点8090 几十几
4、十V/cmV/cm 温度：温度：1525 1525 潜水电泳潜水电泳7.7.电泳染色电泳染色 溴乙锭溴乙锭( (ethidium bromide, ethidium bromide, EBEB) ) 结构及染色原理结构及染色原理 染色方法染色方法加入凝胶液中加入凝胶液中 电泳结束后染色电泳结束后染色 EBEB染色原理染色原理紫外灯下显色紫外灯下显色8. 8. DNADNA片段的回收片段的回收 低熔点琼脂糖法低熔点琼脂糖法 透析袋电洗脱法透析袋电洗脱法(5(5kb) kb) DEAE- DEAE-纤维素膜法纤维素膜法(0.55(0.55kb)kb)（三）应用范围（三）应用范围 DNADNA的分离
5、、纯化和鉴定的分离、纯化和鉴定 限制性酶切图谱分析限制性酶切图谱分析 重组体的分离、鉴定重组体的分离、鉴定 杂交分析杂交分析 PCRPCR产物的分离鉴定产物的分离鉴定 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳( (p polyacrylolyacryla amide mide g gel el e electrophoresis, lectrophoresis, PAGEPAGE) ) 分离原理分离原理 操作要点操作要点 优点优点 应用范围应用范围（一）分离原理（一）分离原理 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应PAGEPAGE支持物支持物 单体丙烯酰胺单体丙
6、烯酰胺( (AcrAcr) ) 交联剂甲叉双丙烯酰胺交联剂甲叉双丙烯酰胺( (BisBis) ) 催化剂过硫酸胺催化剂过硫酸胺( (APAP) ) 加速剂加速剂N,N,N,N-N,N,N,N-四甲基乙二四甲基乙二胺胺( (TEMEDTEMED) )聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（二）操作要点（二）操作要点 凝胶的分类凝胶的分类 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择 凝胶液的配制凝胶液的配制 凝胶中凝胶中DNADNA的检测的检测 DNADNA片段的回收片段的回收 1. 1. 凝胶的分类凝胶的分类 非变性凝胶：非变性凝胶：dsDNAdsDNA 变性凝胶变性凝胶: : ssDNAssDNA尿素尿素甲酰胺甲酰胺
7、SDSSDS2. 2. 凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择3. 3. 凝胶液的配制凝胶液的配制 试剂(ml)制备浓度(%) 3.5 5.08.0122030%Acr11.6 16.6 26.640.066.6ddH2O67.7 62.7 52.739.312.75XTBE20.0 20.0 20.020.020.010%AP0.70.70.70.70.7TEMED35ul/100mlPAGEPAGE装置装置电电 泳泳4. 4. 凝胶中凝胶中DNADNA的检测的检测 溴乙锭染色法溴乙锭染色法 银盐染色法银盐染色法 甲醛甲醛 还原还原 放射自显影法放射自显影法 AgAg+ +DNADNA AgAg（黑褐
8、色）黑褐色） 5.5.DNADNA片段的回收片段的回收 压碎浸泡法压碎浸泡法 1 1kbkb 纯度高，回收率低纯度高，回收率低（三）（三）PAGEPAGE优点优点 机械强度好、化学稳定性高机械强度好、化学稳定性高 分辨率高分辨率高 载样量大载样量大 回收的回收的DNADNA纯度高纯度高 （四）（四）PAGEPAGE应用范围应用范围 分离、纯化和鉴定分离、纯化和鉴定RNARNA和小分子和小分子DNA DNA DNADNA序列分析序列分析 PCRPCR产物鉴定产物鉴定 蛋白质的检测和分析蛋白质的检测和分析 第二节第二节 分子杂交分子杂交 分子杂交的基本原理分子杂交的基本原理 固相支持物固相支持物
9、探针探针 几种常用杂交技术几种常用杂交技术一、分子杂交的基本原理一、分子杂交的基本原理 核酸的变性和复性核酸的变性和复性分分子子杂杂交交DNA-DNADNA-DNADNA-RNADNA-RNA杂交条件杂交条件 靶分子靶分子 探针探针 杂交袋杂交袋 杂交炉杂交炉杂交种类杂交种类 被检核酸种类和方法被检核酸种类和方法 原位杂交原位杂交斑点杂交斑点杂交SouthernSouthern杂交杂交NorthernNorthern杂交杂交WesternWestern杂交杂交 反应介质反应介质 液相杂交液相杂交 固相杂交固相杂交( ( ) )二、固相支持物二、固相支持物 固相支持物的特性固相支持物的特性结合能
10、力强结合能力强不影响杂交反应不影响杂交反应结合牢固结合牢固 非特异性吸附少非特异性吸附少 机械性能良好机械性能良好 固相支持物的种类固相支持物的种类 硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 ( (nitrocellulose filter nitrocellulose filter membrane)membrane) 尼龙膜尼龙膜( (nylon membrane)nylon membrane)1.1.硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜 特点特点吸附吸附ssDNAssDNA和和RNA RNA 杂交信号本底低杂交信号本底低 不足不足不适于重复杂交不适于重复杂交滤膜较脆滤膜较脆 不适于电转移印迹法不适于电转移印
11、迹法 对对DNADNA小片段小片段(200( 缺口翻译缺口翻译 操作简便操作简便 DNA/cDNA DNA/cDNA 探针探针 DNADNA的的55末端标记末端标记(5(5end end labeling)labeling) 碱性磷酸酶碱性磷酸酶T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶 标记原理标记原理 制备寡核苷酸探针制备寡核苷酸探针 制备短的制备短的DNA/RNADNA/RNA探针探针 DNADNA的的55末端标记末端标记四、四、Southern Southern 杂交杂交 Southern blotting/DNA blottingSouthern blotting/DNA blotting
12、 19751975年，年，Edwen SouthernEdwen Southern等等 印迹印迹( (blotting) : blotting) : 转移转移 blot: a spot or mark, esp. of blot: a spot or mark, esp. of ink ink blotting blotting 1. 1. 印迹的方法印迹的方法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法 真空转移法真空转移法 毛细管转移法毛细管转移法 电转移法电转移法真空转移法真空转移法2. 2. Southern Southern 杂交的步骤杂交的步骤3. 3. Southern Sout
13、hern 杂交的应用杂交的应用 基因的定性及定量分析基因的定性及定量分析 基因的酶切图谱分析基因的酶切图谱分析 基因突变分析基因突变分析 RFLP RFLP五、五、Northern Northern 杂交杂交 RNA blottingRNA blotting 步骤步骤 总总RNA/mRNARNA/mRNA变性电泳分离变性电泳分离转移转移杂杂交交放射自显影放射自显影/ /化学显色化学显色 应用应用检测组织检测组织/ /细胞中细胞中mRNAmRNA的大小的大小、量量 比较不同组织比较不同组织/ /细胞中基因的表达情况细胞中基因的表达情况 Northern Northern 杂交杂交六、六、West
14、ern Western 杂交杂交 免疫印迹免疫印迹( (immunoblotting) immunoblotting) SDS-PAGESDS-PAGE转移转移蛋白第一抗体蛋白第一抗体标记的第二抗体标记的第二抗体( (探针探针)检测检测 应用应用-蛋白质的定性定量分析蛋白质的定性定量分析免疫印迹免疫印迹 Southern,Northern & Southern,Northern & WesternWestern待测物质待测物质 支持物支持物 探针探针 转移方式转移方式Southern DNANC 单链核酸单链核酸 毛细管毛细管/电电/真空真空 Northern RNANC/尼龙尼龙 单链核酸单
15、链核酸 毛细管毛细管/电电/真空真空 Western 蛋白质蛋白质NC/PVDF 抗体抗体电转移电转移 七、原位杂交七、原位杂交( (in situ hybridization)in situ hybridization) 定义定义 种类种类细胞内原位杂交细胞内原位杂交组织切片原位杂交组织切片原位杂交 基本程序基本程序 细胞细胞/ /组织固定组织固定预杂交预杂交杂交杂交冲冲洗洗 杂交信号检测杂交信号检测 分析结果分析结果 组织切片组织切片八、斑点杂交八、斑点杂交( (dot hybridization)dot hybridization)第三节第三节 PCRPCR技术技术 聚合酶链反应聚合酶链
16、反应 ( (polymerase chain reaction, PCR)polymerase chain reaction, PCR) PCRPCR的发展简史的发展简史 PCRPCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤 PCRPCR的影响因素的影响因素 PCRPCR的种类的种类 PCRPCR的应用的应用一、一、PCRPCR的发展简史的发展简史 1971 1971年年, ,KoranaKorana提出核酸体外扩增提出核酸体外扩增的设想的设想 1985 1985年年, , Mullis Mullis 等发明了等发明了PCRPCR技术技术 1988 1988年年, , PE-CetusPE-Cetus
17、公司推出了第一公司推出了第一台台PCRPCR仪仪 二、二、PCRPCR的基本原理和步骤的基本原理和步骤 基本原理基本原理DNADNA复制复制 三个步骤三个步骤变性变性( (denaturation) denaturation) 退火退火( (annealing) annealing) 延伸延伸( (extension) extension) PCRPCR的原理的原理PCRPCR的扩增产物的扩增产物cycle 12345n长片段长片段 246810短片段短片段 002822长短长短 21222324252n标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系 10 10X X 扩增缓冲液：扩增缓冲液： 10
18、 10ulul 模板模板DNA: 0.12ugDNA: 0.12ug 引物：引物： 各各0.210.21umol/Lumol/L 4 4种种dNTP: dNTP: 各各200200umol/Lumol/L Mg Mg2+2+: : 1.5mmol/L1.5mmol/L Taq DNA Taq DNA聚合酶：聚合酶： 2.5 2.5U U 总体积：总体积： 100100ulul三、三、PCRPCR的影响因素的影响因素 模板模板 引物引物 Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 4 4种种dNTPdNTP Mg Mg2+2+ 循环条件循环条件 模板模板 DNADNA RNA RNAcDNAcDN
19、A 对模板的纯度要求低对模板的纯度要求低引物引物 长度：长度：15153030nt nt G+CG+C含量：含量：4060% 4060% 碱基的随机分布碱基的随机分布 避免引物自身和引物之间的互补避免引物自身和引物之间的互补 引物的引物的33端端 引物的引物的55端端 引物浓度：引物浓度：0.210.21umol/L umol/L Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5 2.5U/100ul U/100ul 2020保存保存 最后加最后加 底物底物 4 4种种dNTP dNTP 的浓度相等的浓度相等 终浓度：终浓度：200200umol/L umol/L MgMg2+2+ 浓度浓度:
20、 1.5: 1.52.02.0mmol/L mmol/L 过高过高: : 非特异扩增非特异扩增 过低过低 : : 反应产物减少反应产物减少 循环条件循环条件 变性温度和时间变性温度和时间: 9096, 3060: 9096, 3060s s 退火温度和时间退火温度和时间: 4060, 3060: 4060, 3060s sTm=4(G+C)+2(A+T)Tm=4(G+C)+2(A+T) 延伸温度和时间延伸温度和时间707075 (72 )75 (72 )11kb, 1min; kb, 1min; 3 34 4kb , kb , 3 34 4min; min; 1010kb,kb,1515min
21、min 循环次数循环次数: 25: 253535 四、四、PCRPCR的种类的种类 反转录反转录PCRPCR 原位原位PCR(in situ PCR)PCR(in situ PCR) 实时实时PCR(real time PCR)PCR(real time PCR) 重组重组PCR(recombinant PCR)PCR(recombinant PCR) 锚定锚定PCR(anchored PCR)PCR(anchored PCR) 反向反向PCR(inverse PCR)PCR(inverse PCR)原位原位PCRPCR 原位杂交原位杂交PCRPCR 程序程序 固定细胞固定细胞/ /组织样品组
22、织样品PCRPCR前处理前处理PCRPCR扩增扩增原位杂交及检测原位杂交及检测 实时实时PCRPCR的原理的原理五、五、PCRPCR的应用的应用 分子生物学研究分子生物学研究 临床医学临床医学分子生物学研究分子生物学研究 基因克隆基因克隆 DNADNA序列测定序列测定 基因的体外定点突变基因的体外定点突变 突变分析突变分析( (PCR-SSCP)PCR-SSCP) 基因定量基因定量 临床医学临床医学 病原体诊断病原体诊断 遗传病的基因诊断遗传病的基因诊断 肿瘤检测肿瘤检测 法医学法医学 第四节第四节 DNADNA序列测定序列测定 Sanger Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法(197
23、7)(1977) Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法(1977) (1977) Sanger Sanger 双脱氧链终止法双脱氧链终止法 原理原理DNADNA复制复制 反应条件反应条件 模板模板引物引物 dNTP dNTP（其中一种带放射性标记）其中一种带放射性标记） ddNTPddNTP DNA DNA聚合酶聚合酶DNADNA的复制的复制2,3-2,3-双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸( (ddNTP)ddNTP)DNADNA测序操作测序操作DNADNA自动测序自动测序 DNADNA自动测序仪自动测序仪第六节第六节 生物芯片生物芯片( (Biochip)Bioc
24、hip) 20 20世纪世纪9090年代末年代末 生物分子之间相互作用的特异性生物分子之间相互作用的特异性 种类种类 细胞芯片、组织芯片、微生物芯细胞芯片、组织芯片、微生物芯片、片、基因芯片基因芯片、蛋白质芯片、蛋白质芯片 基因芯片基因芯片 概念概念 种类种类 应用领域应用领域 表达谱基因芯片及其检测原理表达谱基因芯片及其检测原理 应用举例应用举例什么是基因芯片？什么是基因芯片？ 基因芯片基因芯片( (Gene chip, DNA chip)Gene chip, DNA chip), ,又又称为称为DNADNA微阵列微阵列( (DNA Microarray)DNA Microarray)，是指
25、固定在载体上的高密度是指固定在载体上的高密度DNADNA微点微点阵。具体地说就是将大量阵。具体地说就是将大量寡核苷酸寡核苷酸或或cDNAcDNA有序地、高密度地排列在玻有序地、高密度地排列在玻璃、硅等固相载体上。璃、硅等固相载体上。基因芯片基因芯片芯片的制备芯片的制备基因芯片的种类基因芯片的种类 表达谱基因芯片表达谱基因芯片 诊断芯片诊断芯片 检测芯片检测芯片 基因芯片的应用领域基因芯片的应用领域基因芯片基因芯片基因表达谱疾病诊断药物筛选新基因寻找 测序基因分型基因突变表达谱基因芯片及其检测原理表达谱基因芯片及其检测原理 研究在不同组织或细胞、不同发育研究在不同组织或细胞、不同发育阶段中基因的表达差异，进而阐明阶段中基因的表达差异，进而阐明基因的功能基因的功能 检测原理检测原理表达谱基因芯片表达谱基因芯片应用举例应用举例 用基因表达谱芯片研究人正常和肝用基因表达谱芯片研究人正常和肝细胞癌中差异表达的基因细胞癌中差异表达的基因 肿瘤的分型及预测肿瘤的分型及预测 1999 1999年，年，GulopGulop等等 急性白血病的分型急性白血病的分型 AML(13/10)AML(13/10) ALL(25/24) ALL(25/24)THANK YOUSUCCESS2022-6-6可编辑
