1、放射自显影的定义、基本类型和材料l本章重点：l放射自显影的定义l放射自显影的基本类型和基本方法l放射自显影的感光材料一 概述l 1 1、定义：、定义：l 放射自显影放射自显影: :利用射线使感光材料感光形成潜影，利用射线使感光材料感光形成潜影，经显影定影后形成图像；判断放射性示踪剂的分经显影定影后形成图像；判断放射性示踪剂的分布部位和数量（半定量）的技术。布部位和数量（半定量）的技术。2、放射自显影的发展、放射自显影的发展l 18671867年年: :铀盐可以使银离子感铀盐可以使银离子感光；光；l 19241924年年 Lacassagne Lacassagne 应用于研应用于研究钚在生物标本
2、中的分布究钚在生物标本中的分布l 19461946年，年，BelangerBelanger和和LeblondLeblond首次建立现代放射自显影的方首次建立现代放射自显影的方法。法。3、放射自显影的优点、放射自显影的优点1 1）灵敏度高。）灵敏度高。2 2）定位准确，能把定位和定量结合分析）定位准确，能把定位和定量结合分析3 3）感光材料具有累积成像的效应，所需的放射性物质可极微量。）感光材料具有累积成像的效应，所需的放射性物质可极微量。4 4）操作简单易行，不需要复杂昂贵的设备。）操作简单易行，不需要复杂昂贵的设备。5 5）形态、机能和代谢的综合分析）形态、机能和代谢的综合分析 6 6）结果
3、可以长期保存）结果可以长期保存l局限性：局限性：1 1、实验周期长。、实验周期长。2 2、定量不准确，只能半定量。、定量不准确，只能半定量。4 4、应用举例、应用举例l 药物、营养物质、毒物等在器官、组织、细胞中的分布、运转l 研究特异性标记前体的参入部位、特点、影响因素l 标记抗体或药物在离体标本上进行抗原研究或受体的定位示踪二 放射自显影的原理l（一）潜影形成的原理：（一）潜影形成的原理：l和普通光学摄影原理相同；和普通光学摄影原理相同；l利用射线使感光材料感光在标本中放射性利用射线使感光材料感光在标本中放射性存在的原位置出现银颗粒的沉积。存在的原位置出现银颗粒的沉积。1 1、电离：释放电
4、子、电离：释放电子l感光乳胶中每颗溴化银感光乳胶中每颗溴化银结晶由许多结晶由许多AgBrAgBr分子组分子组成。成。l制造乳胶时，都使晶体制造乳胶时，都使晶体发生点阵上的缺陷发生点阵上的缺陷敏化中心。敏化中心。具有缺陷的晶格排列l 完整的晶格排列l当核射线作用于溴化当核射线作用于溴化银结晶时，使某些分银结晶时，使某些分子电离射出电子，向子电离射出电子，向敏化中心移动形成阴敏化中心移动形成阴电层。电层。lAgBr+AgBr+-Ag-Ag+ +Br+e+Br+e- -2 2、AgAg+ +离子向敏化中心移动：离子向敏化中心移动：lAgAg+ +离子向敏化中心移动，与电子结合，即离子向敏化中心移动，
5、与电子结合，即射出的电子被带正电荷的银离子俘获，形射出的电子被带正电荷的银离子俘获，形成银原子。成银原子。lAgAg+ +e e+ +-Ag-Ag3 3、形成潜影、形成潜影l许多带正电荷的银离子被显影剂还原成银许多带正电荷的银离子被显影剂还原成银原子，在该溴化银结晶颗粒中形成潜影。原子，在该溴化银结晶颗粒中形成潜影。l（二）潜影的消退：（二）潜影的消退：l已经还原的银原子在水、氧的作用下重新已经还原的银原子在水、氧的作用下重新变成离子，使已经形成的潜影消退。变成离子，使已经形成的潜影消退。l放射自显影的曝光过程应在干燥、低温或放射自显影的曝光过程应在干燥、低温或充氮气的环境下进行。充氮气的环境
6、下进行。（三）显影和定影l 显影液将银离子还原成银颗粒的过程l 显影液=显影剂+促进剂+保护剂+抑制剂l 显影剂：还原作用，米吐尔、海德尔l 促进剂：提供碱性环境，增加显影作用，常用碳酸钠l 保护剂：中和还原产物，亚硫酸钠l 抑制剂：抑制未形成潜影的银盐分解，溴化钾l 定影：定影液溶解未形成潜影的银晶体。l 定影液=定影剂+保护剂+停显剂+坚膜剂l 定影剂：溶解银晶体，海波l 保护剂：抑制定影剂被酸分解，亚硫酸钠l 停显剂：终止显影液的继续作用，醋酸l 坚膜剂：防止乳胶膨胀、脱落、擦伤。钾矾三 放射自显影的材料（一）感光材料：（一）感光材料：l1 1、组成、组成l由由银盐和明胶银盐和明胶组成。
7、组成。l银盐多为银盐多为卤化银卤化银，如溴化银。，如溴化银。l明胶主要起支持作用；吸水膨胀后具有通明胶主要起支持作用；吸水膨胀后具有通透性透性l2 2、分类：、分类：（1 1）原子核乳胶：）原子核乳胶：l溴化银和明胶按照一定的比例混匀制备而溴化银和明胶按照一定的比例混匀制备而成；成；l常温下呈粘稠液状，低温下则为胶冻状，常温下呈粘稠液状，低温下则为胶冻状，温度升至温度升至4040左右时为液态。左右时为液态。l可以根据使用需要制备成各种形态可以根据使用需要制备成各种形态l液体核乳胶：液体核乳胶：由溴化银和明胶按照由溴化银和明胶按照8080：2020的比例混合制备，的比例混合制备，可制备成不同形状
8、和厚度。可制备成不同形状和厚度。l核乳胶干板：核乳胶胶片核乳胶干板：核乳胶胶片l揭膜核乳胶：揭膜核乳胶： 中国原子能科学研究院物理生产的核乳胶中国原子能科学研究院物理生产的核乳胶乳胶型号 核-2核-4HW-3HW-4银晶直径（m）0.170.240.10-0.110.14适用范围 粒子11MeV以下的质子所有带电粒子所有带电粒子（电镜自显影）l（2）氚片：l由溴化银、碘化银和明胶组成。l银晶体颗粒平均直径为1ml单面涂胶l主要用于3H标记化合物的自显影l（3）X线片：l由溴化银、碘化银和明胶组成。l银晶体颗粒平均直径为2.5ml双面或单面涂胶l主要用于射线能量较高的宏观自显影乳胶类型乳胶类型溴
9、化银直径溴化银直径（m）乳胶层的厚乳胶层的厚度（度（m）用途用途原子核乳胶原子核乳胶0.10.24 光镜、电镜光镜、电镜自显影自显影氚片氚片1.0510宏观自显影宏观自显影X光片光片2.53.01530核素能量较核素能量较高宏观自显高宏观自显影影l （4 4）自显影增强剂：）自显影增强剂：l 在感光材料里面加入荧光材料或将荧光材料制作成薄膜覆盖在凝胶表在感光材料里面加入荧光材料或将荧光材料制作成薄膜覆盖在凝胶表面。面。l 感光材料在射线和光子的双重作用下面感光，可以缩短实验周期。感光材料在射线和光子的双重作用下面感光，可以缩短实验周期。暗盒和增强屏l（5）磷屏成像：）磷屏成像：l用可重复使用的
10、磷屏作为成用可重复使用的磷屏作为成像板像板l专门的读出装置。专门的读出装置。计算机磷屏成像系统计算机磷屏成像系统l 优点：优点：可用于多种核素的宏观自显影可用于多种核素的宏观自显影操作简便操作简便不需胶片和显影定影等照相处理步骤不需胶片和显影定影等照相处理步骤磷屏可以重复使用磷屏可以重复使用l 缺点：缺点：分辨率较低分辨率较低目前还不能用于高倍光镜和电镜自显影目前还不能用于高倍光镜和电镜自显影仪器价格比较昂贵仪器价格比较昂贵（二）放射自显影中常用的放射性核素（二）放射自显影中常用的放射性核素l 应考虑其射线的种类、能量和半衰期。应考虑其射线的种类、能量和半衰期。l3 3H H 、1414C C
11、 、3535S S 、4545Ca Ca 、3232P P、3333P P、131131I I、125125I I 、99m99mTcTc等。等。l 发射发射 射线的核素毒性都较大，一般不用于示踪研究。射线的核素毒性都较大，一般不用于示踪研究。l 单纯的发射单纯的发射 射线的放射性核素，难于在乳胶中形成潜影，自显影效射线的放射性核素，难于在乳胶中形成潜影，自显影效果差果差。核素半衰期-粒子最大的能粒子最大的能量（量（MeV）-粒子平均能量（粒子平均能量（MeV）3H14C32P35S45Ca59Fe89Sr125I131I12.33年年5730年年14.28天天87.4天天165天天44.6天
12、天50.5天天60.2天天8.04天天0.01880.1551.710.1670.2580.461（51%）0.269（47%）1.4880.6070.0050.050.6950.0550.100.120.570.0037 内内 0.0227俄俄0.205放射自显影常用的放射性核素放射自显影常用的放射性核素四 放射自显影的基本技术和方法l（一）主要类型：（一）主要类型：l宏观自显影：整体水平宏观自显影：整体水平l光镜自显影：细胞水平光镜自显影：细胞水平l电镜自显影：亚细胞水平电镜自显影：亚细胞水平l1 1、宏观自显影：、宏观自显影：l常用肉眼、放大镜或低倍显微镜观察常用肉眼、放大镜或低倍显微镜
13、观察l用灰度或黑度对比来判断示踪剂的部位和用灰度或黑度对比来判断示踪剂的部位和数量数量l优点是可以同时观察各脏器、组织中放射优点是可以同时观察各脏器、组织中放射性示踪剂的分布，多用于小动物的整体标性示踪剂的分布，多用于小动物的整体标本，大动物的脏器或肢体，以及各种电泳本，大动物的脏器或肢体，以及各种电泳谱、色谱和免疫沉淀板等的示踪研究。谱、色谱和免疫沉淀板等的示踪研究。小鼠头部的宏观自显影小鼠头部的宏观自显影凝胶电泳的自显影结果凝胶电泳的自显影结果核酸电泳展开板的放射自显影核酸电泳展开板的放射自显影l2 2、光镜自显影：、光镜自显影：l以光学显微镜为工具进行观察，以镜下的以光学显微镜为工具进行
14、观察，以镜下的银颗粒分布及数量来判断放射性核素示踪银颗粒分布及数量来判断放射性核素示踪剂的部位和数量。剂的部位和数量。l镜下的银颗粒为黑色或深棕色的小圆点镜下的银颗粒为黑色或深棕色的小圆点l适用于冰冻组织切片、石蜡组织切片，血适用于冰冻组织切片、石蜡组织切片，血细胞涂片、骨髓细胞涂片等标本的示踪研细胞涂片、骨髓细胞涂片等标本的示踪研究。究。放射自显影检测寄生虫感染中的脾细胞放射自显影检测寄生虫感染中的脾细胞l3 3、电镜自显影：、电镜自显影：l以电子显微镜观察，以电镜下银颗粒的分以电子显微镜观察，以电镜下银颗粒的分布及数量来判断。布及数量来判断。l电镜下电子轨迹为蛇样扭曲电镜下电子轨迹为蛇样扭
15、曲l适用于细胞超微结构上的精确定位和定量适用于细胞超微结构上的精确定位和定量蛇毒素与乙酰胆碱受体结合（二）基本方法（二）基本方法1 1、基本步骤：、基本步骤：l 示踪示踪：向实验动物体内或离体标本上引入放射：向实验动物体内或离体标本上引入放射性核素标记物。性核素标记物。l 标本制备标本制备：取生物标本并制备成含放射性核素：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片的切片、涂片l 自显影制备自显影制备：暗室中在制备的标本上敷加感光：暗室中在制备的标本上敷加感光材料。材料。l 曝射曝射：避光条件下核射线作用于感光乳胶。：避光条件下核射线作用于感光乳胶。l 照相处理照相处理：显影、定影、水洗、干燥、
16、染色、：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。封固。l 阅读分析阅读分析。2 2、示踪剂引入的方法、示踪剂引入的方法体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔注射或直接脑内注射和灌胃等途径给入放注射或直接脑内注射和灌胃等途径给入放射性标记化合物。射性标记化合物。体外实验：可在培养瓶中给入、或将示踪体外实验：可在培养瓶中给入、或将示踪剂直接加在切片上进行结合反应，洗去多剂直接加在切片上进行结合反应，洗去多余的示踪剂后再进行自显影实验。余的示踪剂后再进行自显影实验。l3 3、标本制备：、标本制备：l组织切片：组织切片：冰冻切片：冰冻切片：石蜡切片：石蜡切片：l整体动物切
17、片：整体动物切片：l专用整体动物切片机上制成专用整体动物切片机上制成l牙齿、骨骼：制备磨片牙齿、骨骼：制备磨片l体液、细胞：制备涂片体液、细胞：制备涂片l电镜标本：超薄切片机电镜标本：超薄切片机l其它：电泳条、层析条等可干燥后使用其它：电泳条、层析条等可干燥后使用l 4 4、自显影片的制备方法：、自显影片的制备方法：l 液体乳胶浸膜法：液体乳胶浸膜法： 在暗室中将液体核乳胶置在暗室中将液体核乳胶置37 37 4040水浴融化，玻水浴融化，玻棒搅拌棒搅拌15min15min至均匀。将载玻片带标本的插入乳胶内，浸至均匀。将载玻片带标本的插入乳胶内，浸沾乳胶，约沾乳胶，约0.5min0.5min后缓
18、慢匀速地垂直提出。干燥过夜。在后缓慢匀速地垂直提出。干燥过夜。在有干燥剂的暗盒内，密封置有干燥剂的暗盒内，密封置44曝射。然后显影、定影、曝射。然后显影、定影、染色、封固等则在自显影结束后进行。染色、封固等则在自显影结束后进行。接触法：接触法： 将样品摆放在合适的载波片上，取与将样品摆放在合适的载波片上，取与载波片大小相同的核乳胶干板覆盖在载波载波片大小相同的核乳胶干板覆盖在载波片上，用橡皮筋固定，外面包上黑纸，然片上，用橡皮筋固定，外面包上黑纸，然后后4 4度密封保存充分曝光。度密封保存充分曝光。 注意：接触松紧要适当以免引起挤压注意：接触松紧要适当以免引起挤压效应效应 接触法示意图接触法示
19、意图湿贴法：湿贴法： 暗室中将冰冻切片直接贴在暗室中将冰冻切片直接贴在干板的乳胶面，冷冻干燥后曝射。干板的乳胶面，冷冻干燥后曝射。揭膜法：揭膜法： 将核乳胶制备成核乳胶将核乳胶制备成核乳胶揭膜，悬浮于液体中。用固定揭膜，悬浮于液体中。用固定好样品的载波片在液体中捞取好样品的载波片在液体中捞取揭膜，使揭膜覆盖在样品上。揭膜，使揭膜覆盖在样品上。l金属环法：电镜自显影金属环法：电镜自显影 在暗室内融化乳胶，按说明书要求稀释，在暗室内融化乳胶，按说明书要求稀释，降温至降温至2525，用不锈钢制成的金属环（直，用不锈钢制成的金属环（直径径4 4毫米）插入乳胶液中，轻轻垂直提取，毫米）插入乳胶液中，轻轻
20、垂直提取，金属环上即形成单层乳胶膜。将环套在载金属环上即形成单层乳胶膜。将环套在载有超薄切片的铺有火棉胶的铜网上，单层有超薄切片的铺有火棉胶的铜网上，单层乳胶膜即覆盖在切片表面。曝射后显影定乳胶膜即覆盖在切片表面。曝射后显影定影，干燥后即可在电镜下观察。影，干燥后即可在电镜下观察。l5 5、曝射、曝射l放射自显影的曝光时间与所使用的放射性放射自显影的曝光时间与所使用的放射性核素种类有关。核素种类有关。 125125I I需要感光需要感光4848小时以上。小时以上。 1414C C要数天几周。要数天几周。 3 3H H要要1010天以上，天以上，1 12 2个月。个月。 l6 6、显像处理：、显
21、像处理：l 显影：显影：18-2018-20，2-4min2-4minl 定影：定影：18-2018-20，8-15min8-15minl 水洗：清除残余显影、定影剂，水洗：清除残余显影、定影剂，20min20min以上以上l7 7、干燥、染色和封固：、干燥、染色和封固：l 干燥箱干燥干燥箱干燥l 常规苏木素常规苏木素- -伊红染色伊红染色l 盖玻片封固盖玻片封固五、放射自显影的影响因素l（一）放射自显影的分辩力l指2个相邻的放射性核素分子在标本中仍能显示为2个颗粒的最短距离。l分辩力的影响因素l1、乳胶中银颗粒的大小和密度：颗粒越小，密度约高，分辩力越高l2、乳胶厚度：越厚，分辩力越低l3、样品厚度：样品越厚，分辩力越低l4、样品与乳胶间的间隙：间隙越大，分辩力越低
