分子杂交与印迹技术以及应用实例课件.ppt

1、分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术以及应用以及应用实例实例 在分子生物学操作上，分子杂交与印迹技在分子生物学操作上，分子杂交与印迹技术实质上是术实质上是两个不同的技术两个不同的技术，下面首先予以，下面首先予以单独介绍，然后介绍其关联和区分。单独介绍，然后介绍其关联和区分。分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术 区别区别1.1.杂交杂交(hybridization(hybridization） 从遗传的角度来说从遗传的角度来说, ,杂交指杂交指基因型不同的个体基因型不同的个体之间进行的交配之间进行的交配。 遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不遗传学中经典的也是常用的实验方法。通过不同的基因型

2、的个体之间的交配而取得某些双亲基因同的基因型的个体之间的交配而取得某些双亲基因重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过重新组合的个体的方法。一般情况下，把通过生殖生殖细胞相互融合而达到这一目的过程称为细胞相互融合而达到这一目的过程称为杂交杂交；而把；而把由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞由体细胞相互融合达到这一结果的过程称为体细胞杂交。杂交。一、分子杂交的概念一、分子杂交的概念2.2.分子杂交（分子杂交（moleucularmoleucular hybridizationhybridization） 分子杂交在分子生物学上一般即指核酸分子杂分子杂交在分子生物学上一般即指核酸分子杂交，

3、是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来交，是指核酸分子在变性后再复性的过程中，来源不同但互补配对的源不同但互补配对的DNADNA或或RNARNA单链（包括单链（包括DNADNA和和DNADNA，DNADNA和和RNARNA和和RNARNA和和RNARNA）相互结合形成杂合）相互结合形成杂合双链的特性或现象。双链的特性或现象。 依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行依据此特性建立的一种对目的核酸分子进行定性和定量分析的技术则称为定性和定量分析的技术则称为分子分子/核酸分子杂核酸分子杂交技术交技术(通常是将一种核酸单链用同位素或非同通常是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记即探针，再与另一种核酸单

4、链进行分位素标记即探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交，通过对探针的检测而实现对未知核酸子杂交，通过对探针的检测而实现对未知核酸分子的检测和分析分子的检测和分析)。3.3.核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid moleucularnucleic acid moleucular hybridizationhybridization）是指具有互补序列的两条核酸是指具有互补序列的两条核酸单链单链在一定条件下按在一定条件下按碱基配对原则碱基配对原则形成形成双链双链的过的过程。杂交的双方分别称为程。杂交的双方分别称为探针探针与与待测核酸待测核酸，杂交，杂交后形成的异源双链分子称为后形成的

5、异源双链分子称为杂交分子杂交分子。 DNADNA杂交分子杂交分子DNARNA杂交分子杂交分子 DNA分子分子DNA分子分子复性复性RNADNA分子杂交分子杂交和和印迹技术印迹技术是目前生物医学研究中最是目前生物医学研究中最为常用的基本分子生物学技术，在生物医学为常用的基本分子生物学技术，在生物医学基基础研究础研究以及以及临床诊断临床诊断应用等方面广泛应用，譬应用等方面广泛应用，譬如用于基因克隆的筛选、基因的定量和定性分如用于基因克隆的筛选、基因的定量和定性分析及基因突变的检测等。析及基因突变的检测等。二、核酸分子杂交的用途二、核酸分子杂交的用途 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是目前生命科学研

6、究领域中应用最是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一。广泛的技术之一。用途：用途：1.1.是是定性定性或或定量检测定量检测特异特异DNADNA或或RNARNA序列片段的有力工具；序列片段的有力工具；2.2.在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的寡核苷酸或寡核苷酸或cDNAcDNA探针进行菌落杂交，探针进行菌落杂交，可从可从cDNAcDNA文库或基文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；3.3.用克隆化的用克隆化的DNADNA片段作探针进行片段作探针进行SouthernSouthe

7、rn杂交杂交，可确，可确定基因组定基因组DNADNA上上特定区域的核苷酸同源顺序特定区域的核苷酸同源顺序；4.4.用用S1S1核酸酶或核酸酶或RNARNA酶消化酶消化DNADNA/ /RNARNA或者或者RNARNA/ /RNARNA杂交杂交体是分析体是分析基因转录或基因转录或RNARNA加工加工的重要方法；的重要方法；5.5.对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸对某一已知基因或已克隆测序的基因可利用核酸杂交技术进行染色体定位；杂交技术进行染色体定位；6.6.可用于遗传病的可用于遗传病的基因诊断基因诊断，用于限制性片段长度，用于限制性片段长度多态性作疾病的相关分析，基因连锁分析，多态性作

8、疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学法医学上的上的性别分析和亲子鉴定性别分析和亲子鉴定。7.7.在人类学研究中也有应用价值。在人类学研究中也有应用价值。核酸分子杂交的基本原理是：核酸分子杂交的基本原理是：具有互补序列的两条单具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下链核酸分子在一定条件下（适宜的（适宜的温度温度及及离子强度离子强度等等）碱基互补配对结合，重新形成双链碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中；在这一过程中，核酸分子经历了，核酸分子经历了变性变性和和复性复性的变化，以及复性过程的变化，以及复性过程中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是中分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核

9、酸待测核酸序列和序列和已知核酸已知核酸序列。在杂交体系中序列。在杂交体系中已知已知的的核酸序列核酸序列称作称作探针探针（probe ），探针通常用于进行核素或非核），探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。素示踪标记。三、核酸分子杂交的原理三、核酸分子杂交的原理探针的意义：探针的意义：要检测某一样品或基因组要检测某一样品或基因组DNADNA中特中特定的定的DNADNA顺序或基因片段，首先必须获得相应的顺序或基因片段，首先必须获得相应的探针，即已知顺序的探针，即已知顺序的DNADNA或或RNARNA片段，并使它带上片段，并使它带上可检测到的示踪可检测到的示踪标记标记。 A T C G G T A

10、C A T T A G C C A T G T A 探针探针序列序列待测样本待测样本序列序列分子杂交的形式：分子杂交的形式： 固固液相杂交液相杂交 一般在进行某一核酸顺序的检测一般在进行某一核酸顺序的检测时，先将待测的单链靶核酸时，先将待测的单链靶核酸固定在适当的载体固定在适当的载体上，然后置于上，然后置于含相应单链核酸探针的含相应单链核酸探针的杂交反应体系杂交反应体系中，通过碱基互补配对中，通过碱基互补配对原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结原则，两条单链的同源顺序通过氢键互相结合，形成双链结构。经过对标记探针的检测可以判断待检测样品中相应顺序构。经过对标记探针的检测可以判断

11、待检测样品中相应顺序的的存在与否存在与否及及分子量大小分子量大小。 液相杂交液相杂交 有时也将待测核酸和已知核酸同时放有时也将待测核酸和已知核酸同时放在在液体中液体中进行杂交反应。进行杂交反应。 两种杂交形式的两种杂交形式的基本原理都是一样的。基本原理都是一样的。 从发展历史来看从发展历史来看, ,先有先有液相杂交液相杂交, ,后有后有固固液相杂交液相杂交. . 1.1.变性变性：在：在物理或化学因素物理或化学因素作用下，例如作用下，例如加热加热、酸酸碱碱或或紫外线紫外线照射，可以导致两条照射，可以导致两条DNADNA链之间的链之间的氢键断氢键断裂裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、，

12、而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为糖苷键等）则不受影响，称为DNADNA变性变性（DNA DNA denaturationdenaturation）。）。 四、核酸分子杂交的过程四、核酸分子杂交的过程DNADNA的的变性变性与与复性复性导致导致DNADNA变性的常用方法有三种：变性的常用方法有三种：热变性热变性碱变性碱变性化学试剂变性。化学试剂变性。变性的情况：变性的情况：a. T70a. T700 0C C，DNADNA几乎不变性；几乎不变性；b. 70b. 700 0CT90CT90c. T900 0C C，DNADNA变性使双链打开，成为单链分子；变性使双

13、链打开，成为单链分子；d .T100d .T1000 0C C，DNADNA双链分离。双链分离。 所以，一般核酸变性的温度都选在所以，一般核酸变性的温度都选在90901001000 0C C之间。之间。 （1 1）热变性）热变性：当升高核酸溶液的温度时，核酸当升高核酸溶液的温度时，核酸双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。双链间的氢键发生断裂，核酸的双链逐渐打开。（2 2）酸碱变性）酸碱变性：当核酸溶液的：当核酸溶液的pHpH低于低于3 3或高于或高于1010时，核时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。在分子杂交中，中，最常用最常用的核

14、酸变性方法是的核酸变性方法是碱变性碱变性。因通常需要的核。因通常需要的核酸的载体如酸的载体如凝胶凝胶或或膜膜对热都不稳定对热都不稳定。（3 3）化学试剂变性）化学试剂变性：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂：当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如如尿素、甲醛尿素、甲醛等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核等时，两条链之间的氢键可以断裂而形成单链核酸分子。酸分子。 除物理、化学因素外，除物理、化学因素外，DNADNA分子的组成也影响变性。最主分子的组成也影响变性。最主要的因素是要的因素是DNADNA分子中的分子中的GCGC含量，含量，GCGC含量高的含量高的DNADNA不易变性，而不易变性，而

15、ATAT含量高的含量高的DNADNA容易变性。容易变性。另外另外, ,环状环状DNADNA比线性比线性DNADNA难于变性难于变性. . DNADNA的变性是可逆的的变性是可逆的，即两条互补的单链，即两条互补的单链DNADNA分分子在变性条件除去后子在变性条件除去后重新重新按碱基互补原则以氢键相按碱基互补原则以氢键相连连形成双链形成双链DNADNA分子分子，这一过程称作，这一过程称作DNADNA复性复性（DNA DNA renaturationrenaturation） 。如果是如果是异源双链分子的结合异源双链分子的结合则称为则称为杂交杂交(hybridization) 。 相似的复性或杂交反

16、应可以发生在任何具有互补相似的复性或杂交反应可以发生在任何具有互补核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如核苷酸顺序的两条单股核酸链之间，如DNA/DNA/DNADNA，DNA/DNA/RNARNA，RNA/RNA/RNARNA或人工合成的寡核苷酸片段与或人工合成的寡核苷酸片段与DNADNA、RNARNA等。等。2.2.复性复性1.1.核酸分子的浓度和长度：核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快；分子浓度越大，复性速度越快；分子 量越大，复性速度越慢。量越大，复性速度越慢。 一般情况下：探针浓度为一般情况下：探针浓度为0.10.10.5g0.5g；长度为；长度为5050300 bp300 bp

17、2.2.温度：温度：适宜温度为适宜温度为 比比TmTm值值低低 25250 0C C TmTm双链双链DNADNA变性一半所需要的温度变性一半所需要的温度(DNA(DNA的溶解温度，的溶解温度，meltingmelting temperature,Tm temperature,Tm）3.3.离子强度：离子强度： 低离子（低离子（NaNa+ +）强度下，核酸杂交非常缓慢，）强度下，核酸杂交非常缓慢，离离 子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的子强度增加，杂交反应率增提高。所以，必须维持较高的 杂交反应液和洗膜液的盐浓度杂交反应液和洗膜液的盐浓度 五、影响核酸分子杂交的因素五、影响核酸

18、分子杂交的因素 核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性核酸分子杂交实际上就是两条互补的单链核酸分子通过复性重新缔合形成双链的过程。这一过程受到重新缔合形成双链的过程。这一过程受到诸多因素诸多因素的影响。的影响。4 4. .杂交液中的甲酰胺：杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的甲酰胺能降低核酸杂交的TmTm值，从而使得：（值，从而使得：（1 1）在低温下探针更稳定；）在低温下探针更稳定； （2 2）能更好地保留非共价结合）能更好地保留非共价结合 的核酸。的核酸。 一般是：一般是：50%50%甲酰胺甲酰胺 353542420 0C C5 5. .核酸分子的复杂性：核酸分子的复杂性

19、：不同顺序的总长度不同顺序的总长度( (碱基数）碱基数）6 6. .非特异性杂交反应：非特异性杂交反应： 须在杂交前封闭非特异性杂须在杂交前封闭非特异性杂 交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用交位点，以减少其对探针的非特异性吸附作用1. Southern1. Southern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotSouthern blot） 鉴别鉴别DNADNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是DNADNA）六、核酸分子杂交的基本方法六、核酸分子杂交的基本方法3. 3. 斑点杂交、斑点杂交、4. 4. 原位杂交、原位杂交、5. 5. 核酸酶保护实验等。核酸酶保护实验等。2. No

20、rthern2. Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot） 鉴别鉴别RNARNA靶分子（待测核酸是靶分子（待测核酸是RNARNA）根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：根据其用途可将核酸分子杂交分为几种基本类型：SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交是指是指DNADNA与与DNADNA的杂交，将电泳分的杂交，将电泳分离的待测离的待测DNADNA片段转印并结合到一定的固相支持物片段转印并结合到一定的固相支持物上，然后用标记的上，然后用标记的DNADNA探针检测待测探针检测待测DNADNA的一种方法。的一种方法。这是这是197519

21、75年英国爱丁堡大学的年英国爱丁堡大学的SouthernSouthern建立的方法，建立的方法，因此而得名。因此而得名。 基本步骤：基本步骤：（一）（一）SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 1.1.待测核酸样品的制备待测核酸样品的制备（1 1）制备待测）制备待测DNADNA：从样本的细胞或组织中制备从样本的细胞或组织中制备DNADNA（2 2）DNADNA的限制酶消化：的限制酶消化：将将DNADNA切割成大小不同的片段切割成大小不同的片段 2.2.待测待测DNADNA样品的电泳分离：样品的电泳分离：将将DNADNA样品在样品在0.80.81.0%1.0%琼脂琼脂糖凝胶中电泳，以对

22、糖凝胶中电泳，以对DNADNA片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼片段进行分离（琼脂糖凝胶是由琼脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，脂糖形成的网状物质，具有分子筛的作用，DNADNA因其分子大因其分子大小小而在琼脂糖凝胶中的泳动而在琼脂糖凝胶中的泳动速度不同速度不同达到分离）。达到分离）。 3.3.凝胶中核酸的变性：凝胶中核酸的变性：对凝胶中的对凝胶中的DNADNA进行碱变性，使其进行碱变性，使其形成较短的单链片段。形成较短的单链片段。 4.Southern 4.Southern 转膜：转膜：将凝胶中的将凝胶中的DNADNA片段转移到硝酸纤维片段转移到硝酸纤维膜（膜（NCNC）等固相支持物上。各个

23、）等固相支持物上。各个DNADNA片段在膜上的相对位置片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为与在凝胶中的相对位置是一样的，故称为印迹印迹（blotblot）。）。 （1 1）毛细管虹吸印迹法：）毛细管虹吸印迹法：利用浓盐转移缓冲液的推动利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的作用，将凝胶中的DNADNA转移到固相支持物上。转移到固相支持物上。 （见下页图见下页图）（2 2）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的）电转印法：通过电泳作用将凝胶中的DNADNA转移到滤转移到滤膜上。膜上。（3 3）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。）真空转移法：其原理与毛细管虹吸印迹法相同。So

24、uthern Southern 转膜的方法转膜的方法重物重物湿滤纸湿滤纸吸水纸吸水纸玻璃板玻璃板胶胶膜膜湿滤纸湿滤纸湿滤纸桥湿滤纸桥支持平台支持平台玻璃容器玻璃容器20SSC毛细管虹吸法毛细管虹吸法Southern转膜示意图转膜示意图5. 5. 探针的制备：探针的制备：用缺口平移或随机引物标记的方法用缺口平移或随机引物标记的方法 制备探针、标记。制备探针、标记。7.7. 杂交结果的检测杂交结果的检测（1 1） 放射线标记放射线标记放射自显影，感光胶片，显出黑放射自显影，感光胶片，显出黑 色杂交带；色杂交带；（2 2） 非放射线标记非放射线标记直接显出杂交带，进行检测。直接显出杂交带，进行检测。

25、6. Southern6. Southern杂交杂交（1 1） 预杂交预杂交 封闭膜上所有能与封闭膜上所有能与DNADNA结合的位点转印后结合的位点转印后 的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）的膜在预杂交液（不含探针的杂交液）4 46 6小时小时（2 2） 杂交杂交 （过夜）（过夜）分子杂交实验过程分子杂交实验过程目目 录录放放射射自自显显影影照照片片目目 录录分分子子杂杂交交电电泳泳图图目目 录录8.8.SouthernSouthern印迹杂交在医学中的应用印迹杂交在医学中的应用9.9. SouthernSouthern印迹杂交技术已有印迹杂交技术已有3030多年的历史，多年的历史，在核酸的结

26、构和功能研究中作出过重要贡献。在核酸的结构和功能研究中作出过重要贡献。10.10. 如：发现成熟如：发现成熟B B细胞中免疫球蛋白基因重细胞中免疫球蛋白基因重排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定排现象；进行克隆基因的酶切图谱分析；特定基因的定性和定量；基因的定性和定量；DNADNA多态性多态性(RFLP,RAPD,AFLP(RFLP,RAPD,AFLP等等) )分析分析11.11. NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交是指将待测是指将待测RNARNA样品经电泳分离后样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固固液相杂

27、交，以检测液相杂交，以检测RNARNA（主要是（主要是mRNAmRNA）的方法。其）的方法。其基本原理和基本过程与基本原理和基本过程与SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交基本相同基本相同。只是在以下几点有所不同。只是在以下几点有所不同。（二）（二）NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交1. 1. 靶核酸靶核酸RNARNA2. RNA2. RNA电泳电泳在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单在变性胶中进行（加入变性剂，以维持单 链线性状态）链线性状态）3. 3. 转膜转膜电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛电泳后不需要再进行变性和中和，直接用毛 细管虹吸法细管虹吸法等方法转

28、移。转移。 （三）斑点及狭缝印迹杂交（三）斑点及狭缝印迹杂交特点：特点：简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个简单、快速，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；样品的检测； 但不能鉴别分子量，且特异性不高，但不能鉴别分子量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。有一定比例的假阳性。 将将RNARNA或或DNADNA变性后变性后直接点样直接点样于硝酸纤维膜和尼龙于硝酸纤维膜和尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为量研究，称为斑点印迹斑点印迹( (dot blotdot blot) )。 如如印迹印迹是线状则为是线状则为狭缝印迹狭缝印迹

29、或或狭线印迹狭线印迹( (slot slot blotblot） （四）原位杂交（四）原位杂交 核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细核酸保持在细胞或组织样本中，经适当的方法处理细胞或组织后，将标记的核酸胞或组织后，将标记的核酸探针探针与与细胞或组织中的核酸细胞或组织中的核酸进行进行杂交杂交，称为，称为原位杂交（原位杂交（in situin situ hybridization hybridization）。 这是一种标记这是一种标记DNADNA与整个染色体杂交并且发生杂交的与整个染色体杂交并且发生杂交的区域可通过显微镜观察的技术。区域可通过显微镜观察的技术。特点：特点：（1 1）不受

30、组织成分的影响；不受组织成分的影响；（2 2）灵敏度高；灵敏度高；（3 3）可完可完整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及整保持细胞或组织形态，准确反映组织细胞的相互关系及功能；功能；（4 4）可检测多个探针。可检测多个探针。 核酸原位杂交包括核酸原位杂交包括组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲组织细胞的固定、预杂交、杂交、冲洗洗及及信号检测信号检测等基本步骤。等基本步骤。1. 1. 组织或细胞的固定组织或细胞的固定2. 2. 组织细胞杂交前的预处理（预杂交）组织细胞杂交前的预处理（预杂交）3. 3. 探针的选择和标记探针的选择和标记4. 4. 杂交杂交5. 5. 杂交结果检测杂交结果

31、检测 重点介绍重点介绍荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence fluorescence in situin situ hybridization,FISH hybridization,FISH）概念：概念：液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于液相杂交是指待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。杂交分子。种类：种类： A. RNAA. RNA酶保护分析法酶保护分析法(RNase protection assay, RPA)(RNase protection assay, RPA) 用

32、于用于mRNAmRNA定量、定量、mRNAmRNA末端定位及确定内含子在相应基末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。因中的位置等。（五）液相杂交（五）液相杂交1. 1. 制备待测制备待测RNA; 2. RNARNA; 2. RNA探针的标记探针的标记3. 3. 杂交杂交; 4. ; 4. 除去单链除去单链RNARNA5. 5. 电泳分析电泳分析 B.B.核酸酶核酸酶S1S1保护分析法保护分析法(nuclease S1 (nuclease S1 protection assay)protection assay) 用于基因转录起始位点分析及内含子剪切用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分

33、析。位点分析。 其原理与其原理与RNARNA酶保护分析法类似酶保护分析法类似. . 分子杂交技术最早始于分子杂交技术最早始于Benjamin HallBenjamin Hall等于等于19611961年的探索，他将探针与靶序列在溶液中杂年的探索，他将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心来分离杂交体，这交，通过平衡密度梯度离心来分离杂交体，这实际为实际为液相杂交液相杂交。 由于杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去由于杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难，同时误差较高且操作繁琐复杂，因较为困难，同时误差较高且操作繁琐复杂，因此其应用较少。此其应用较少。 一般都用固固液相杂交液相杂交

34、1. cDNA1. cDNA探针探针：逆转录：逆转录 cDNA cDNA 克隆于载体克隆于载体 扩增重组扩增重组 质粒质粒 提取质粒提取质粒 消化重组质粒消化重组质粒 切割切割cDNAcDNA片段片段 分离纯化分离纯化 cDNAcDNA探针探针 cDNAcDNA探针应用最广泛探针应用最广泛2. 2. 基因组基因组DNADNA探针探针：从基因组文库：从基因组文库 筛选特定基因（或基筛选特定基因（或基 因片段）因片段） 克隆克隆 扩增扩增 纯化纯化 切取片段切取片段 分离纯化分离纯化 探针探针3. 3. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针：一定长度的寡核苷酸片段（十几个核苷酸：一定长度的寡核苷酸片段（十几个

35、核苷酸 以上）以上）4. RNA4. RNA探针探针：以：以RNARNA作为探针作为探针 （基因克隆和体外转录获得）（基因克隆和体外转录获得）七、探针的标记七、探针的标记（一）探针的种类（一）探针的种类1.1.核素标记物核素标记物一般用一般用-3232P,P,但但55末端必须用末端必须用-3232P P。2.2.非核素标记物非核素标记物（1 1）半抗原：）半抗原：生物素生物素(biotin)(biotin)和和地高辛地高辛(digoxin, digacin, DIG)（2 2）配体：）配体：生物素既是生物素既是半抗原半抗原，又是，又是亲和素亲和素( (avidinavidin， 抗生物素蛋白抗

36、生物素蛋白) )，故可用生物素，故可用生物素- -亲和素反亲和素反 应进行杂交信号检测应进行杂交信号检测（3 3）荧光素：）荧光素：异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素( FITC)( FITC)（4 4）化学发光探针）化学发光探针（二）标记物（二）标记物1. 1. 缺口平移法缺口平移法(nick translation) (nick translation) (见图见图) ) 2. 2. 随机引物法随机引物法(randon primer) (randon primer) （见图）（见图）3. PCR3. PCR标记法标记法4. 4. 末端标记法末端标记法 （三）标记方法（三）标记方法缺口平移法标记缺

37、口平移法标记DNADNA探针探针DNase；Mg2+53 模板模板DNADNA35533 随机打开缺口随机打开缺口5DNA聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs标记的探针标记的探针随机引物法标记随机引物法标记DNADNA探针探针53 模板模板DNADNA3553变性变性53Klenow聚合酶；聚合酶；-32P-dCTP；dNTPs变性变性标记的探针标记的探针随机引物随机引物1.1.乙醇沉淀法乙醇沉淀法2. Sephadex G-502. Sephadex G-50柱层析法柱层析法3.3.微柱离心法微柱离心法 （四）探针的纯化（四）探针的纯化 印迹技术不仅可用于核酸的分子检测，也可以用印

38、迹技术不仅可用于核酸的分子检测，也可以用于蛋白质的检测。蛋白质在电泳分离之后也可以转于蛋白质的检测。蛋白质在电泳分离之后也可以转移并固定于膜上，相对应于移并固定于膜上，相对应于DNADNA的的SouthernSouthern印迹和印迹和RNARNA的的NorthernNorthern印迹，该印迹方法则被称为印迹，该印迹方法则被称为WesternWestern印迹印迹（Western blotWestern blot或或Western blottingWestern blotting）或）或蛋白蛋白印迹印迹。八、八、WesternWestern印迹印迹 蛋白质印迹技术的过程与蛋白质印迹技术的过程

39、与DNADNA和和RNARNA的印迹技术基本类的印迹技术基本类似，但也有很多似，但也有很多不同之处不同之处，譬如，譬如Western BlotWestern Blot是采用变是采用变性聚丙烯酰胺性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离凝胶电泳进行蛋白质分离，利用，利用免疫学的免疫学的抗原抗原- -抗体反应来检测被转印的蛋白质抗体反应来检测被转印的蛋白质，被检测物是蛋，被检测物是蛋白质，白质，“探针探针”是抗体是抗体，“显色显色”用标记的二抗。因为用标记的二抗。因为蛋白质印迹技术涉及到利用免疫学的抗原蛋白质印迹技术涉及到利用免疫学的抗原- -抗体反应来抗体反应来检测被转印的蛋白质，故也被称为检测被转印

40、的蛋白质，故也被称为免疫印迹技术免疫印迹技术（immuno-blottingimmuno-blotting）。）。Western blot 原理：原理： WesternWestern印迹的基本步骤：印迹的基本步骤：1 1蛋白质样品的制备：蛋白质样品的制备： 根据样品的组织来源、细胞类型和待测蛋白质的性质来根据样品的组织来源、细胞类型和待测蛋白质的性质来选择合适的蛋白质样品制备方法。不同来源的组织、细胞、选择合适的蛋白质样品制备方法。不同来源的组织、细胞、目标蛋白，蛋白质样品的制备方法也不仅相同。譬如细菌、目标蛋白，蛋白质样品的制备方法也不仅相同。譬如细菌、酵母、组织培养的哺乳动物细胞、哺乳动物

41、组织来源的蛋酵母、组织培养的哺乳动物细胞、哺乳动物组织来源的蛋白质样品制备的方法明显不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性白质样品制备的方法明显不同，膜蛋白、核蛋白和可溶性蛋白的制备方法也明显不同。蛋白质样品制备好后可用蛋白的制备方法也明显不同。蛋白质样品制备好后可用BradfordBradford比色法、比色法、LowryLowry法、二喹啉甲酸（法、二喹啉甲酸（BCABCA）比色法等）比色法等来测定蛋白质浓度，其中以来测定蛋白质浓度，其中以BradfordBradford比色法最为常用。比色法最为常用。2 2蛋白质样品的分离：蛋白质样品的分离： 主要采用不连续主要采用不连续SDS-SDS-聚丙烯酰胺

42、凝胶（聚丙烯酰胺凝胶（PAGEPAGE）电泳对蛋白质样品按照分子量大小进行分离。通常电泳对蛋白质样品按照分子量大小进行分离。通常同时使用强阴离子去污剂同时使用强阴离子去污剂SDSSDS与某一还原剂（如巯与某一还原剂（如巯基乙醇），并通过加热使蛋白质变性解离成单个的基乙醇），并通过加热使蛋白质变性解离成单个的亚基后再加样于电泳凝胶上。亚基后再加样于电泳凝胶上。3 3转印：转印： 将经过电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜将经过电泳分离的蛋白质样品转移到固相膜载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性且能保持电泳分离的多

43、肽类型及其生物学活性不变。不变。 转印方法主要采用电转印法，主要有水浴式电转印方法主要采用电转印法，主要有水浴式电转印即湿转和半干式转印两种方式。转印即湿转和半干式转印两种方式。4 4检测与结果分析：检测与结果分析： 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体起体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶标记的第二抗体起反应，最后通过化学发光来检测目的蛋白的有无和所在反应，最后通过化学发光来检测目的蛋白的有无和所在位置及分子量大小。位置及分子量大小。 需要注意的是，在进行抗原需要注意的是，在进行抗原- -抗体反

44、应之前，一般需抗体反应之前，一般需用去脂奶粉等作为封闭剂对固相膜载体和一些无关蛋白用去脂奶粉等作为封闭剂对固相膜载体和一些无关蛋白质的潜在结合位点进行封闭处理，以降低背景信号和非质的潜在结合位点进行封闭处理，以降低背景信号和非特异性结合。特异性结合。 作为分子生物学的经典实验方法，该技术已经被作为分子生物学的经典实验方法，该技术已经被广泛广泛应用于分子医学领域用于检测蛋白水平的表达应用于分子医学领域用于检测蛋白水平的表达，是当代是当代分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一分析和鉴定蛋白质的最有效的技术之一。这一技术的灵。这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而又无需像敏度能达到标准的固

45、相放射免疫分析的水平而又无需像免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。此外，免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标记。此外，由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此，由于蛋白质的电泳分离几乎总在变性条件下进行，因此，也不存在溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等也不存在溶解、聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等诸多问题。诸多问题。 印迹技术的类别及应用印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹技术印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNADNA、重组质粒和噬菌体的、重组质粒和噬菌体的分析。分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern

46、blotting) 用于用于RNARNA的定性定量分析的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 Western Blot 图片图片western blot 结果：结果：GAPDHBmi-1M 1 2 3 4 5 6 Bmi-1- actinCon GFPsi Bmi-1si M: Marker ; 1, 2: MCF-7/Bmi-1si (Bmi-1si); 3, 4: MCF-7/GFPsi (GFPsi); 5, 6: MCF-7 (con)博士论文答辩博士论文答

47、辩western blotp53Bcl-2BaxpAkt(ser473)tAkt-actin 1 2 3 4 5 6 沉默沉默Bmi-1基因对相关蛋白表达的影响基因对相关蛋白表达的影响 1, MCF-7; 2, MCF-7+DOX; 3, MCF-7/GFPsi; 4, MCF-7/GFPsi+DOX; 5, MCF-7/Bmi-1si; 6, MCF-7/Bmi-1si + DOX。博士论文答辩博士论文答辩WB检测检测-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化 Fig 2-1. 骨髓中骨髓中-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化 Vs NL, *P0.01*Fig

48、 2-2. 外周血中外周血中-arrestin1/2 蛋白水平的变化蛋白水平的变化 Vs NL, *P0.01*三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较九、荧光原位杂交（九、荧光原位杂交（FISH）技术）技术及其在医学上的应用及其在医学上的应用（一）荧光原位杂交技术的概念（一）荧光原位杂交技术的概念 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence (Fluorescence in situ in situ hybridization , FISH) FISH) 是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射是一种在放射性原位杂交基础上发展起来的非放射性原位杂交技术，是把性原位杂交技术，是把生物素

49、生物素或或地高辛地高辛(DIG)(DIG)等标记等标记物质标记的物质标记的DNADNA片段作为片段作为探针探针（probeprobe），与染色体），与染色体DNADNA进行进行分子杂交分子杂交，利用，利用荧光色素荧光色素为检测信号，在为检测信号，在荧荧光显微镜光显微镜下直接检测探针互补的下直接检测探针互补的DNADNA片段的存在部位。片段的存在部位。 实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而实际上是分子生物学与细胞生物学交叉结合而形成的一种现代生物技术，属于形成的一种现代生物技术，属于分子细胞生物学分子细胞生物学的范畴。的范畴。 FISHFISH技术技术现已成为现已成为分子生物学分子生物学与与

50、分子细胞遗传分子细胞遗传学学研究中的重要手段。研究中的重要手段。（二）（二）FISHFISH的基本原理的基本原理 依据依据碱基互补碱基互补原理，将原理，将DNADNA探针用特殊修饰的核苷探针用特殊修饰的核苷酸酸分子标记分子标记（如（如biotin-dUTPbiotin-dUTP或或digoxigenin-dUTPdigoxigenin-dUTP），），然后将标记然后将标记探针直接探针直接杂交杂交到染色体或到染色体或DNADNA纤维切片上，纤维切片上，再通过直接再通过直接检测检测（荧光素直接标记的探针）或用荧光（荧光素直接标记的探针）或用荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来间素分子藕