1、第六章第六章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术Common Molecular Biology Technique陈耕夫陈耕夫生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系基础学院基础学院 广东药学院广东药学院主要内容主要内容一、分子杂交技术一、分子杂交技术二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立四、四、RNA干扰技术干扰技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术一、分子杂交技术一、分子杂交技术（一）什么是核酸杂交？（一）什么是核酸杂交？（二）核酸探针（二）核酸探针（三）（三）DNA杂交技术杂交技术（四）其他杂交技术（四）其他杂交
2、技术（五）生物芯片（五）生物芯片（六）核酸杂交技术的应用（六）核酸杂交技术的应用（一）什么是核酸杂交？（一）什么是核酸杂交？ 核酸杂交核酸杂交（nucleic acid hybridization）是指）是指碱基序列互补但来源不同的单链碱基序列互补但来源不同的单链DNA和和DNA、DNA和和RNA、RNA和和RNA，根据碱基配对原则，借助氢，根据碱基配对原则，借助氢键相连而形成的双链杂交分子的过程。键相连而形成的双链杂交分子的过程。核酸的变性与复性核酸的变性与复性核酸杂交核酸杂交（二）核酸探针（二）核酸探针1. 什么是核酸探针？什么是核酸探针？ 核酸探针核酸探针（probe）是指为了检测核酸样
3、品中）是指为了检测核酸样品中是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与是否存在某段核酸特征序列而人工设计的、能够与靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段靶分子核酸按碱基互补原则特异性相互作用的一段已知序列的寡核苷酸或核酸。已知序列的寡核苷酸或核酸。（二）核酸探针（二）核酸探针2. 核酸探针的标记核酸探针的标记 核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能核酸探针的标记是指探针以共价键形式结合能够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强够产生强烈信号的基团、原子或能够与一些产生强烈信号分子特异性结合的配体。烈信号分子特异性结合的配体。核酸探针标记的目的核酸探针标记的目的 利用探针的标记物特
4、定性质来跟踪检查探针，利用探针的标记物特定性质来跟踪检查探针，从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子从而确定是否存在核酸靶序列或者确定核酸靶分子所在位置。所在位置。非同位素标记核酸探针检测原理非同位素标记核酸探针检测原理（二）核酸探针（二）核酸探针3. 核酸探针标记的常用方法核酸探针标记的常用方法u放射性同位素标记法放射性同位素标记法 如如3H、32P、35S、125I等等u非放射性标记法非放射性标记法l半抗原：生物素、地高辛半抗原：生物素、地高辛l荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明l配体：生物素配体：生物素l光密度或电子密度标记物：光密度或电子密度标记物： 金
5、、银金、银（三）（三）DNA杂交技术杂交技术 DNA杂交技术杂交技术是一种以是一种以DNA的特异序列（探针）的特异序列（探针）检测目标检测目标DNA样品中是否存在能与探针碱基配对的样品中是否存在能与探针碱基配对的核酸杂交技术。核酸杂交技术。 该方法在该方法在1975年由年由Southern首先创建，故该首先创建，故该方法又称为方法又称为Southern印迹印迹（Southern blot）。）。待检测核酸样品的制备待检测核酸样品的制备标记探针的制备标记探针的制备检测样品中是否存在目标序列检测样品中是否存在目标序列（三）（三）DNA杂交技术杂交技术1. 样品的制备样品的制备 核酸样品的提取分离核
6、酸样品的提取分离 酶切、电泳分离、核酸变性等酶切、电泳分离、核酸变性等 样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜样品核酸转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结预杂交：封闭硝酸纤维膜或尼龙膜上核酸结合位点，防止探针直接与膜结合合位点，防止探针直接与膜结合2. 探针的制备探针的制备3. 待测样品核酸序列的检测待测样品核酸序列的检测 杂交杂交待测样品与探针的复性待测样品与探针的复性 洗膜洗膜除去多余未杂交探针除去多余未杂交探针 检测检测依据探针特点检测探针信号依据探针特点检测探针信号组织或细胞组织或细胞转移到硝酸纤维膜转移到硝酸纤维膜或尼龙膜或尼龙膜预杂交预杂交含已知的重组含已知的
7、重组质粒菌落质粒菌落提取质粒提取质粒DNA限制性内切酶降解限制性内切酶降解及电泳分离及电泳分离基因组基因组DNA限制性内切酶降解限制性内切酶降解及电泳分离、变性及电泳分离、变性回收含已知基因的回收含已知基因的DNA片段，并标记片段，并标记基因探针基因探针杂杂 交交 (待测样品与探针的复性待测样品与探针的复性)杂杂交交样样品品的的制制备备标标记记探探针针的的制制备备洗洗 膜膜( 除去多余未杂交探针除去多余未杂交探针 )放射自显影放射自显影检测检测样品样品核酸核酸序列序列检测检测核酸杂交技术的基本过程核酸杂交技术的基本过程分离分离转膜转膜杂交杂交自显影自显影（四）其他杂交技术（四）其他杂交技术1.
8、 Northern印迹（印迹（northern blot） 应用应用DNA探针检测特异探针检测特异mRNA的一种杂交技术。的一种杂交技术。（四）其他杂交技术（四）其他杂交技术2. Western印迹（印迹（Western blot） 又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测又称蛋白质印迹，是用于目的蛋白质定位检测的实验方法。的实验方法。 其过程与其过程与Southern印迹相似：印迹相似： 将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼将电泳分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离龙膜上，再以免疫反应或亲和反应检测经电泳分离的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配
9、体特异的样品中能与免疫反应或亲和反应的标记配体特异性结合的蛋白质区带。性结合的蛋白质区带。Western Blot（四）其他杂交技术（四）其他杂交技术3. 原位杂交（原位杂交（in-situ hybridization） 在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内在组织或细胞水平，使用标记探针与细胞内DNA或或RNA杂交的方法。杂交的方法。原位杂交原位杂交人类端粒人类端粒DNA荧光原位杂交相片荧光原位杂交相片（五）生物芯片（五）生物芯片 生物芯片（生物芯片（biochip）是将核酸、多肽、蛋白）是将核酸、多肽、蛋白质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先设计质分子、组织切片和细胞等制成探针，以预先
10、设计的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体的方式有序地、高密度地排列在玻片或硅片等载体上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分上，构成二维分子阵列，然后与待测生物样品靶分子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通子杂交，通过检测杂交信号实现快速、高效、高通量样品检测。量样品检测。 依据待检测样品的性质，生物芯片又分为依据待检测样品的性质，生物芯片又分为基因基因芯片（芯片（DNA芯片）芯片）、蛋白质芯片蛋白质芯片、细胞芯片细胞芯片、组织组织芯片芯片等。等。基因芯片基因芯片 又称为又称为DNA芯片，是将芯片，是将DNA以大规模阵列的形以大规模阵列的形式排列，形成了可与目的分子相互作用的
11、固相表面。式排列，形成了可与目的分子相互作用的固相表面。基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光，基因芯片与目的分子作用后激发出不同波长荧光，通过计算机分析结果。通过计算机分析结果。基因芯片检测原理基因芯片检测原理蛋白质芯片及其应用蛋白质芯片及其应用From the following article:Protein analysis on a proteomic scale, Eric Phizicky, et al.,Nature 422, 208-215(13 March 2003)（六）核酸杂交技术的应用（六）核酸杂交技术的应用1. 在个体识别中的应用在个体识别中的应用（六）核酸杂交
12、技术的应用（六）核酸杂交技术的应用1. 在个体识别中的应用在个体识别中的应用S 嫌疑人嫌疑人DNAE 现场现场DNA证据证据V 受害人受害人DNA（V右侧是另一嫌疑人）右侧是另一嫌疑人）（六）核酸杂交技术的应用（六）核酸杂交技术的应用（2）在产前诊断中的应用）在产前诊断中的应用等位基因全缺陷等位基因全缺陷为患病胎儿为患病胎儿应终止妊娠应终止妊娠带一缺陷基因带一缺陷基因可继续妊娠可继续妊娠带一缺陷基因带一缺陷基因可继续妊娠可继续妊娠基因正常基因正常可继续妊娠可继续妊娠缺陷基因缺陷基因正常基因正常基因缺陷基因缺陷基因正常基因正常基因父亲父亲母亲母亲子子 代代主要内容主要内容一、分子杂交技术一、分子
13、杂交技术二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立四、四、RNA干扰技术干扰技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术（一）什么是目的基因（一）什么是目的基因（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应（三）基因组（三）基因组DNA文库文库（四）（四）cDNA文库文库（五）化学合成（五）化学合成二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术（一）什么是目的基因（一）什么是目的基因（target gene） 目的基因目的基因即是我们需要进行研究的基因。在构即是我们需要进行研究的基因。在构建重组体时，目的基因又称
14、为建重组体时，目的基因又称为插入基因插入基因或或靶基因靶基因。 对于原核生物或病毒，其基因组较小，可以直对于原核生物或病毒，其基因组较小，可以直接从细胞中提取目的基因。接从细胞中提取目的基因。 但对于人类基因组，由于有但对于人类基因组，由于有23对染色体组成，对染色体组成，直接从染色体中提取基因的效率极低，故往往是首直接从染色体中提取基因的效率极低，故往往是首先采用适当的方法使目的基因扩增后才进行目的基先采用适当的方法使目的基因扩增后才进行目的基因的提取。因的提取。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应 聚合酶链反应技术的发明者聚合酶链反应技术的发明者Dr Kary Banks Mullis，获
15、，获1993年化学诺贝尔奖。年化学诺贝尔奖。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应1. 聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）的原理）的原理 是一种在体外扩增核酸的技术，模拟了细胞内是一种在体外扩增核酸的技术，模拟了细胞内天然天然DNA的复制过程。的复制过程。 其基本原理是在有其基本原理是在有模板模板、引物引物、4种种dNTP和和耐耐热热DNA聚合酶聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。区段的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特技术的特异性取
16、决于引物与模板结合的特异性。异性。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应2. PCR体系的基本成分体系的基本成分uDNA模板模板u特异性引物特异性引物uDNA聚合酶（耐热聚合酶（耐热DNA聚合酶）聚合酶）u脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP）u二价阳离子二价阳离子 常用常用Zn2+、Mg2+，维持，维持Taq活性活性u缓冲液缓冲液 常用常用10mmol/L、pH8.38.8 Tris-HCl缓缓冲液冲液u一价阳离子一价阳离子 常用常用50mmol/L的的KCl溶液溶液（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应3. PCR的基本过程的基本过程 变性变性 通过加热使通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，
17、双双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链链解离形成单链DNA。退火退火 当温度突然降低时，反应体系中引物和其当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的互补的DNA模板在局部形成杂交链。模板在局部形成杂交链。 延伸延伸 在在DNA聚合酶（耐热聚合酶（耐热DNA聚合酶）和聚合酶）和4种种NTP存在条件下，以引物为起始点进行的存在条件下，以引物为起始点进行的DNA链链的延伸反应。的延伸反应。 不断重复上述三个步骤，直至达到所需目的不断重复上述三个步骤，直至达到所需目的基因的数量。基因的数量。PCR的基本过程的基本过程变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR的基本过程的基本过程5 Primer
18、 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR的基本过程的基本过程Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含的含量可以扩大量可以扩大1000万倍以上。万倍以上。（二）聚合酶链反应（二）聚合酶链反应4. 衍生的衍生的PCR技术技术 RT-PCR（逆转录（逆转录PCR） in situ PCR（原位（原位PCR） qPCR（定量（定量PCR） q-RT-PCR（定量逆转录（定量逆转录PCR） 等等等等荧光定量荧光定量PCR原
19、理示意图原理示意图（三）基因组（三）基因组DNA文库文库 用用限制性内切酶限制性内切酶切割细胞的切割细胞的整个基因组整个基因组DNA，可以得到大量的基因组可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些片段，然后将这些DNA片段与载体片段与载体连接连接，再，再转化转化到细菌中去，让宿主菌长到细菌中去，让宿主菌长成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都成克隆。这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包片段，整个克隆群体就包含含基因组的全部基因片段总和基因组的全部基因片段总和称为称为基因组基因组DNA文库文库或或基因组文库基因组文库。 基因文
20、库构建原理基因文库构建原理（四）（四）cDNA文库文库 是指某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞是指某一生物特定器官或特定发育阶段的细胞内总内总mRNA，应用逆转录酶逆转录成，应用逆转录酶逆转录成cDNA；cDNA与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖，并能繁殖扩增。这样包含着细胞全部扩增。这样包含着细胞全部mRNA信息的信息的cDNA克克隆集合称为该器官或该组织细胞的隆集合称为该器官或该组织细胞的cDNA文库文库（cDNA library） 。 （四）（四）cDNA文库
21、文库1. cDNA文库构建的基本原理与方法文库构建的基本原理与方法（1）细胞内总）细胞内总mRNA的提取的提取（2）以寡聚脱氧胸苷酸（）以寡聚脱氧胸苷酸（oligo dT）为引物进行逆）为引物进行逆转录得到转录得到cDNA的第一链的第一链（3）用）用RNase H降解降解mRNA模板模板（4）以）以cDNA第一链为模板合成第一链为模板合成cDNA第二链第二链（5）将双链）将双链cDNA克隆到载体克隆到载体（6）将克隆有）将克隆有cDNA的载体转化进宿主菌扩增的载体转化进宿主菌扩增（7）对）对cDNA文库进行鉴定和筛选文库进行鉴定和筛选质粒为载体的质粒为载体的cDNA文库构建文库构建（四）（四）
22、cDNA文库文库2. cDNA文库目的基因的筛选文库目的基因的筛选u依据目的基因核苷酸序列设计核酸探针依据目的基因核苷酸序列设计核酸探针u依据氨基酸排列顺序推导核酸序列，设计相应的依据氨基酸排列顺序推导核酸序列，设计相应的核酸探针核酸探针u差异显示杂交筛选组织特异性差异显示杂交筛选组织特异性cDNA 即用同一套探针系统对两个相关组织（如正即用同一套探针系统对两个相关组织（如正常组织与癌变组织）的常组织与癌变组织）的cDNA文库进行核酸杂交，文库进行核酸杂交，了解两个相关组织基因表达的差异性。了解两个相关组织基因表达的差异性。（四）（四）cDNA文库文库3. cDNA文库的优越性文库的优越性l
23、在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在基因组水平上研究某基因对器官、组织和细胞在个体发育中的影响在个体发育中的影响l cDNA文库筛选比较简单易行文库筛选比较简单易行l cDNA文库基因的筛选中假阳性率较低文库基因的筛选中假阳性率较低l 可用于可用于mRNA的测序及外显子基因结构的分析的测序及外显子基因结构的分析（五）化学合成（五）化学合成 受有机合成反应产率的影响，化学合成得到的受有机合成反应产率的影响，化学合成得到的核酸链长度一般不超过核酸链长度一般不超过60个核苷酸，故化学合成法个核苷酸，故化学合成法主要用于寡核苷酸（如引物、探针等）的合成。主要用于寡核苷酸（如引物、探针等）的合成
24、。每一步反每一步反应的产率应的产率50步反应后的步反应后的总收率总收率60步反应后的步反应后的总收率总收率99%0.9950 = 60.6%0.9960 = 54.7%98%0.9850 = 36.4%0.9860 = 29.8%97%0.9750 = 21.8%0.9760 = 16.1%96%0.9650 = 13.0%0.9660 = 8.6%95%0.9550 = 7.7%0.9560 = 4.6%主要内容主要内容一、分子杂交技术一、分子杂交技术二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立四、四、RNA干扰技术干扰技术五、蛋白组学研究常用
25、技术五、蛋白组学研究常用技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立（一）基因敲除技术（一）基因敲除技术（二）转基因技术（二）转基因技术（三）动物整体克隆技术（三）动物整体克隆技术（一）基因敲除技术（一）基因敲除技术For their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells（一）基因敲除技术（一）基因敲除技术 基因敲除基因敲除（gene knockout）技术也称基因靶）技术也称基因靶向灭活，是一种
26、有目的去除动物体内某种基因的技向灭活，是一种有目的去除动物体内某种基因的技术。术。 基因敲除是在基因敲除是在基因同源重组技术基因同源重组技术及及胚胎干细胞胚胎干细胞技术技术基础上形成的一种分子生物学技术。基础上形成的一种分子生物学技术。 基因同源重组基因同源重组胚胎干细胞（胚胎干细胞（ES） 胚胎干细胞（胚胎干细胞（Embryonic Stem cell，ES）是）是从着床前胚胎从着床前胚胎(孕孕35天天)分离出的内细胞团（分离出的内细胞团（Inner cellmass，ICM）细胞，它具有向各种组织细胞分）细胞，它具有向各种组织细胞分化的多分化潜能，能在体外培养并保留发育的全能化的多分化潜能
27、，能在体外培养并保留发育的全能性。性。 ES在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠在体外进行遗传操作后，将它重新植回小鼠胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。胚胎，它能发育成胚胎的各种组织。基因敲除技术的工作原理基因敲除技术的工作原理1. 构建基因敲除的重组体构建基因敲除的重组体2. 将重组体导入胚胎干细胞（将重组体导入胚胎干细胞（ES）3. 筛选发生了同源重组的筛选发生了同源重组的ES4. 筛选出的筛选出的ES导入小鼠胚胎细胞导入小鼠胚胎细胞5. 将胚胎植入假孕雌鼠子宫将胚胎植入假孕雌鼠子宫6. 生产得到嵌合体小鼠生产得到嵌合体小鼠7. 嵌合体小鼠与正常小鼠交配嵌合体小鼠与正常小鼠交配8. 筛选基
28、因敲除的杂合子筛选基因敲除的杂合子9. 杂合子之间进行交配杂合子之间进行交配10. 筛选基因敲除的纯合子，即得到基因敲除小鼠筛选基因敲除的纯合子，即得到基因敲除小鼠基因敲除技术的工作原理基因敲除技术的工作原理条件性基因敲除条件性基因敲除 一种快速的基因敲除方法一种快速的基因敲除方法（二）转基因技术（二）转基因技术 指用人工分离和修饰过的外源基因导入生物体指用人工分离和修饰过的外源基因导入生物体的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的的基因组中，从而使生物体的遗传性状发生改变的技术。技术。 转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指将特定）是指将特定的外源基因导入动物受
29、精卵或胚胎，使之稳定整合的外源基因导入动物受精卵或胚胎，使之稳定整合于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。于动物的染色体基因组并能遗传给后代的一类动物。转基因动物制备的一般过程转基因动物制备的一般过程带人生长激素的转基因鼠带人生长激素的转基因鼠非转基因鼠非转基因鼠 转基因鼠转基因鼠转基因植物的培育过程转基因植物的培育过程1.分离目的基因；分离目的基因；2.目的重组入载体基因；目的重组入载体基因；3.载体基载体基因转化植物细胞；因转化植物细胞；4.培育转基因植物。培育转基因植物。（三）动物整体克隆技术（三）动物整体克隆技术 将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的将动物体细胞核全部导入另
30、一个体的去胞核的卵细胞内，使之发育成个体即克隆，这一技术也称卵细胞内，使之发育成个体即克隆，这一技术也称为体细胞核转移技术（为体细胞核转移技术（Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT）。）。核转移技术的基本过程核转移技术的基本过程第一个克隆生物第一个克隆生物多利羊多利羊生物科学界再爆丑闻生物科学界再爆丑闻克隆羊之父承认剽窃克隆羊之父承认剽窃 每日电讯报每日电讯报报道，有克隆羊报道，有克隆羊“多利多利”缔造者之称的缔造者之称的苏格兰籍科学家伊恩苏格兰籍科学家伊恩维尔莫特也承认，维尔莫特也承认，“多利多利”并不是由并不是由他克隆的。克隆羊他克隆的。克隆羊“多利多利”的
31、诞生这一成果名列美国的诞生这一成果名列美国科学科学杂志评选出的该年度世界十大科技进步的榜首位置。杂志评选出的该年度世界十大科技进步的榜首位置。主要内容主要内容一、分子杂交技术一、分子杂交技术二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立四、四、RNA干扰技术干扰技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术四、四、RNA干扰技术干扰技术（一）什么是（一）什么是RNA干扰（干扰（RNAi）（二）（二）RNAi的作用机制的作用机制（三）（三）RNAi的作用特点的作用特点（四）（四）siRNA的设计与制备的设计与制备（五）（五）RNA干扰技术的在药
32、学领域的应用干扰技术的在药学领域的应用（一）什么是（一）什么是RNA干扰（干扰（RNAi） Dicer对双链对双链RNA水解后产生的、通常只有水解后产生的、通常只有20 25个核苷酸的个核苷酸的RNA片段。这些片段片段。这些片段具有同蛋白质调具有同蛋白质调节因子一样的能够使相应的基因表达产生下调作用，节因子一样的能够使相应的基因表达产生下调作用，称为称为RNA干扰干扰；而这些；而这些RNA则称为则称为小干扰小干扰RNA （siRNA或或iRNA）。 Dicer是一种能使特异是一种能使特异RNA双链断裂的双链核双链断裂的双链核酸水解酶。酸水解酶。（二）（二）RNAi的作用机制的作用机制1. RN
33、Ai通过通过RNA诱导的诱导的DNA甲基化，使得与甲基化，使得与iRNA同源的同源的DNA序列甲基化，导致甲基化序列下游的序列甲基化，导致甲基化序列下游的基因沉默；基因沉默；2. 通过双链通过双链RNA（dsRNA）诱导的）诱导的RNAi作用。即作用。即双链双链RNA诱导生成的诱导生成的iRNA能与特定的能与特定的mRNA结结合而抑制合而抑制mRNA的翻译功能。的翻译功能。usiRNA与与mRNA5端或端或3端结合，抑制翻端结合，抑制翻译的正确起始、终止过程；译的正确起始、终止过程；usiRNA与特定的与特定的mRNA结合后，结合后，mRNA被被核酸内切酶被降解。核酸内切酶被降解。RNAi作用
34、机制作用机制Dicer 一种特异核酸内切酶一种特异核酸内切酶dsRNA 双链双链RNARISC RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复合物（三）（三）RNAi的作用特点的作用特点u具有高度特异性具有高度特异性u具有高效性具有高效性u受多基因控制受多基因控制u需需siRNA介导介导u对靶基因位点有选择性对靶基因位点有选择性 不同的不同的siRNA与相同与相同mRNA结合后有些结合后有些siRNA能诱导基因沉默，但有些不能。故能诱导基因沉默，但有些不能。故siRNA的人工设的人工设计应遵循一定的原则。计应遵循一定的原则。u具有放大效应具有放大效应（四）（四）siRNA的设计与制备的设计与制备确定目的基
35、因确定目的基因设计设计siRNA的序列的序列获得获得siRNA产物产物siRNA的转染的转染RNAi效果检测效果检测化学合成化学合成体外转录体外转录siRNA表达载体表达载体siRNA表达框架表达框架（四）（四）siRNA的设计与制备的设计与制备siRNA设计的一般原则设计的一般原则l 从靶从靶mRNA的的AUG起始密码开始，寻找起始密码开始，寻找“AA”二二连序列，并记录其连序列，并记录其3端的端的19个碱基序列，作为潜个碱基序列，作为潜在的在的siRNA靶位点。靶位点。 AA(N19)TT最理想最理想,或或NA (N21)或或NAR(N17)YNN；GC含量在含量在30-50%；不要；不要
36、针对针对5和和3端的非编码区（端的非编码区（UTRs）。）。l 将候选序列与相应的基因组数据库进行将候选序列与相应的基因组数据库进行BLAST比比对，以排除同源序列。对，以排除同源序列。l 选择合适的目标序列进行合成。通常一个基因需选择合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的，以找到最有效的siRNA序列。序列。 （五）（五）RNA干扰技术的在药学领域的应用干扰技术的在药学领域的应用RNAi在病毒防护中的作用在病毒防护中的作用RNAi在抗肿瘤中的作用在抗肿瘤中的作用主要内容主要内容一、分子杂交技术一、分子杂交技术二、目的基因制备技术二
37、、目的基因制备技术三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立四、四、RNA干扰技术干扰技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术（一）双向凝胶电泳（一）双向凝胶电泳（二）生物质谱（二）生物质谱（三）酵母双杂交（三）酵母双杂交（四）蛋白质芯片（见前述，略）（四）蛋白质芯片（见前述，略）（一）双向凝胶电泳（一）双向凝胶电泳 是一种平板电泳技术，即样品各组分先在第是一种平板电泳技术，即样品各组分先在第一方向分离，然后再与第一方向成一方向分离，然后再与第一方向成90的第二方的第二方向作电泳分离。向作电泳分离。常用的双向电泳常用的双向电
38、泳第一向电泳第一向电泳 等电聚焦电泳，是依据等电点不同等电聚焦电泳，是依据等电点不同分离蛋白质的电泳方法分离蛋白质的电泳方法第二向电泳第二向电泳 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠-聚聚丙烯酰胺凝胶电泳），是依据蛋白质分子量大小丙烯酰胺凝胶电泳），是依据蛋白质分子量大小不同分离蛋白质的电泳方法不同分离蛋白质的电泳方法双向电泳的基本过程双向电泳的基本过程蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳等电聚焦电泳的蛋白质分离凝胶等电聚焦电泳的蛋白质分离凝胶分离凝胶置平衡液中平衡分离凝胶置平衡液中平衡SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE的蛋
39、白质分离凝胶的蛋白质分离凝胶固定、染色固定、染色分析电泳结果分析电泳结果双向电泳的基本过程双向电泳的基本过程蛋白质双向电泳图谱的分析蛋白质双向电泳图谱的分析图片来源：龙云铸，中国科学院上海冶金研究所; 材料物理与化学(专业) 博士论文 2000年度（二）生物质谱（二）生物质谱 利用蛋白质分离技术分离蛋白质后，对有兴趣利用蛋白质分离技术分离蛋白质后，对有兴趣的未知蛋白质进行质谱分析，以了解该蛋白质的分的未知蛋白质进行质谱分析，以了解该蛋白质的分子量、氨基酸组成数量等基本信息的实验技术手段。子量、氨基酸组成数量等基本信息的实验技术手段。生物质谱在蛋白质组学研究中的应用生物质谱在蛋白质组学研究中的应
40、用MALDI-TOF-MS工作原理工作原理MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱电喷雾离子化质谱（电喷雾离子化质谱（ESI-MS）（三）酵母双杂交（三）酵母双杂交 酵母菌双杂交系统（酵母菌双杂交系统（yeast two hybridization）是利用在酵母菌的同一细胞中共同表达不同蛋白质，是利用在酵母菌的同一细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间相互作用的一种分析方法。以鉴定蛋白质之间相互作用的一种分析方法。酵母双杂交系统的主要应用酵母双杂交系统的主要应用l鉴定新的蛋白与蛋白相互作用鉴定新的蛋白与蛋白相互作用l鉴定蛋白级联底物鉴定蛋白
41、级联底物 l鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响l在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 l等等等等（三）酵母双杂交（三）酵母双杂交 酵母菌双杂交系统（酵母菌双杂交系统（yeast two hybridization）是利用在酵母菌的同一细胞中共同表达不同蛋白质，是利用在酵母菌的同一细胞中共同表达不同蛋白质，以鉴定蛋白质之间相互作用的一种分析方法。以鉴定蛋白质之间相互作用的一种分析方法。酵母双杂交系统的基本组成酵母双杂交系统的基本组成l 一对反式作用因子一对反式作用因子l 报告基因报告基因酵母双杂交系统中的反式作用因子酵母双杂交系统中的反式作用
42、因子 真核生物的真核生物的位点特异位点特异转录调节因子转录调节因子（统称（统称反式反式作用因子作用因子）通常具有两个可分割开的结构域，即）通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（特异结合域（DNA-binding domain，BD）与）与转录激活域（转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。）。（BD）（AD）+（有活性）（有活性）（失活性）（失活性）酵母双杂交系统中的反式作用因子酵母双杂交系统中的反式作用因子酵母双杂交系统的工作原理酵母双杂交系统的工作原理u构建构建BD与诱饵蛋白基因（与诱饵蛋白基因（Bait）重组体）重组体u构建构
43、建AD与猎物蛋白基因（与猎物蛋白基因（prey or fish）重组体）重组体u将将BD与与AD重组体导入基因缺陷性酵母菌重组体导入基因缺陷性酵母菌u通过报告基因检测出诱饵蛋白基因与猎物蛋白基通过报告基因检测出诱饵蛋白基因与猎物蛋白基因间是否存在相互作用因间是否存在相互作用酵母双杂交系统的工作原理酵母双杂交系统的工作原理利用酵母双杂交系统寻找靶蛋白的方法利用酵母双杂交系统寻找靶蛋白的方法（三）酵母双杂交（三）酵母双杂交酵母双杂交系统的优点酵母双杂交系统的优点快速获得相互作用蛋白的基因快速获得相互作用蛋白的基因只需单一步骤的质粒构建只需单一步骤的质粒构建在体内鉴定蛋白的相互作用在体内鉴定蛋白的相
44、互作用弱小的、暂时的相互作用也能鉴定弱小的、暂时的相互作用也能鉴定能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号本章的主要内容本章的主要内容一、分子杂交技术一、分子杂交技术介绍了介绍了Southern印迹、印迹、Northern印迹、印迹、Western印迹、原位杂交、基因芯片、蛋白质芯印迹、原位杂交、基因芯片、蛋白质芯片等技术。片等技术。二、目的基因制备技术二、目的基因制备技术介绍了聚合酶链反应（介绍了聚合酶链反应（PCR）、基因组文库、）、基因组文库、cDNA文库等技术。文库等技术。三、遗传修饰动物模型的建立三、遗传修饰动物模型的建立介绍了基因敲除、转基因、动物整体克隆技介绍了基因敲除、转基因、动物整体克隆技术等。术等。本章的主要内容本章的主要内容四、四、RNA干扰技术干扰技术介绍了介绍了RNAi的原理、的原理、siRNA设计的一般原则、设计的一般原则、应用等。应用等。五、蛋白组学研究常用技术五、蛋白组学研究常用技术介绍了双向凝胶电泳、生物质谱、酵母双杂介绍了双向凝胶电泳、生物质谱、酵母双杂交等技术。交等技术。
