1、现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法本章内容介绍第一节第一节 概概 述述第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第三节第三节 高效液色谱法的基本理论高效液色谱法的基本理论第四节第四节 各类高效液色谱法各类高效液色谱法第五节第五节 固定相固定相第六节第六节 流动相流动相第七节第七节 HPLC分析条件的选择分析条件的选择第八节第八节 定性与定量分析定性与定量分析第九节第九节 LC-MS联用技术简介联用技术简介第十节第十节 超临界流体色谱法简介超临界流体色谱法简介现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第一节第一节 概概 述述HPLC是在经典液相色谱基础上引入GC的理论和技术,采用：高速高
2、压泵高效固定相；高灵敏度检测器现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法HPLC与经典液相色谱的比较与经典液相色谱的比较高高 速：速： HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。成一次分析需时数小时。高高 效：效： 填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。种物质的分离。高高 灵敏度：灵敏度： 检测器灵敏度
3、极高：检测器灵敏度极高：UV10-9g, 荧光检测器荧光检测器10-11g。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法HPLC 和和GC的比较的比较流动相：流动相： HPLC 液体种类多，可选范围多液体种类多，可选范围多 GC 气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少气体，种类少，改变载气影响柱效和分离少固定相：固定相： HPLC 新型吸附剂，化学键合相，粒度小新型吸附剂，化学键合相，粒度小 GC 吸附剂，担体吸附剂，担体+吸附剂，粒度大吸附剂，粒度大n应用范围：应用范围： HPLC 高沸点，难挥发，对热不稳定物质高沸点，难挥发，对热不稳定物质 GC 低沸点，易挥发，对热稳定物质低沸点，易挥发，
4、对热稳定物质 此外，此外，HPLC流出组分可以收集，检测器灵敏度高。流出组分可以收集，检测器灵敏度高。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法高效液相色谱仪高效液相色谱仪现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪HPLC仪组成：输液系统仪组成：输液系统; 进样系统进样系统; 分离系统分离系统; 检测系检测系统统; 数据处理系统。数据处理系统。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法流程及主要部件流程及主要部件 process and main assembly of HPLC1.1.流程流程现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法主要部件主要部件
5、1输液系统输液系统（一）（一） 流动相贮器流动相贮器 耐酸碱的瓶子（棕色耐酸碱的瓶子（棕色或无色），高于泵体，或无色），高于泵体，保持输液静压差。保持输液静压差。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（二）脱气装置（二）脱气装置 液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。液体流动相使用前要脱气，除去其溶解的气体。 （基线噪音，氧化组分！）（基线噪音，氧化组分！）方法：方法：（1）超声波振动脱气）超声波振动脱气（2）抽真空脱气）抽真空脱气（3）加热回流脱气）加热回流脱气（4）吹氦脱气）吹氦脱气（5）真空在线脱气）真空在线脱气现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法(三三) 高压输液泵高压输
6、液泵要求：流量准确可调，耐高压（要求：流量准确可调，耐高压（30M Pa ），液流稳定），液流稳定，泵的死体积小，泵的死体积小 。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。流动相高速通过时，将产生很高的压力。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法双泵串联补偿法 将两个柱塞杆往复泵串联,泵1比泵2体积大一倍,柱塞杆运动方向相反。（目的是：减少输液脉冲）泵1泵2色谱柱吸（排）排（吸）排（吸）现代仪器分
7、析现代仪器分析之之HPLC 法法(四四)梯度淋洗装置梯度淋洗装置梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变梯度洗脱：分离过程中，随时间函数程序地改变流动相的组成（极性，流动相的组成（极性，PH或离子强度）。或离子强度）。类型：类型： 高压梯度高压梯度 低压梯度低压梯度现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法外梯度（二元高压外梯度（二元高压梯度）梯度）: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度内梯度（四元低压梯度）（四元低压梯度） : 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。现代仪器分析现代仪器
8、分析之之HPLC 法法二二. 进样系统进样系统 （一）（一）六通进样阀六通进样阀 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：六通阀进样装置，其结构如图所示：优点：进样精确，重现性好。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法三. 色谱分离系统（一）保护柱 n位置：接在色谱柱之前，保护色谱柱。n柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长5 cm。填料跟分析柱一样，粒径大。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（二）色谱柱柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。常用的分析
9、柱是内径24.6mm，柱长1025cm现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（三）柱恒温箱精确控制柱温可以提高保留时间的重现性。柱温升高，保留时间减少。常用温度：室温-65度现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（四）色谱柱柱效的评价中国药典05版规定：建立HPLC法时，需要进行“色谱条件与系统适应性”实验。最佳分离状态下色谱柱应达到的：n理论？分离度R？拖尾因子T？现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法四四. 检测系统检测系统检测器检测器：检测器分为溶质性检测器（只对流动相中的被分离分析组分的物理或物理化学性质有响应）和总体型检测器（对流动相的总的物理或物理化学性质有响应）。（1
10、）溶质性检测器）溶质性检测器：紫外（UVD）、荧光（FLD）、电化学（ECD）检测器等。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法紫外检测器紫外检测器基于被测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，且吸收符合光吸收定律。因此可以进行定性定量分析。a固定波长型检测器固定波长型检测器是一种光源波长固定的紫外光度计，一般由低压汞灯作光源，发射波长为254nm波长的光。对在254nm波长附近有吸收的物质有响应。b可变波长型检测器可变波长型检测器是一台紫外可见分光光度计，波长任意可调。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法 a. b. 紫外检测器紫外检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，
11、对大部分有机化合物有响应。 特点：特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法c. c. 光电二极管阵列检测器（光电二极管阵列检测器（PDADPDAD）n一种新型记录方式的紫外检测器，紫外检测器的紫外检测器的重要进展；重要进展；n光电二极管阵列检测器组成：光电二极管阵列检测器组成：它由光源、光栅、 1024个二极管阵列（各检测特定波长），计算机。n光源发射的光被组分选择性吸收，经光栅分光后照射到二极管阵列上，使每纳米光波的光强变成相应的
12、电信号，经累积和计算机处理后得到试样或每个组分的吸收光谱。可以获得t、A、的三维图光谱和色谱图的加合图。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 应用应用三维时间三维时间-色谱色谱-光谱图光谱图除了定量外，可以综合定性分析除了定量外，可以综合定性分析:(1)色谱峰的纯度检查 (2) 色谱峰的分离状况现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（二）蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detec
13、tor, ELSD ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。ELSD属通用型和质量型检测器由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光电转换器等部件构成。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法检测过程： 流出液 雾化成微细液滴 通过加热漂移管时 溶剂被蒸发掉，留下溶质 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。散射光强度正比组分的量散射光强度正比组分的量现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法蒸发光散射检测器ELSD 应 用散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电
14、活性和不发荧光的样品的检测。（糖类，甾体皂甙，脂肪酸等）（糖类，甾体皂甙，脂肪酸等）其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（三）（三） 荧光检测器荧光检测器（fluorescence detector）n高灵敏度、高选择性；n能在紫外光激发下能产生荧光的物质。 多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（四）（四） 示差折光检测器示差折光检测器（differential refractive in
15、dex detector）除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比差值与浓度呈正比通用型检测器（每种物质通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）；具有不同的折光指数）； 灵敏度低、对温度敏灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱；感、不能用于梯度洗脱； 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法五 数据处理系统记录仪+工作站六 仪器性能指标 分离性能：流量精度，噪声，漂移，线性检测性能：比如UV有波长的准确度现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第三节 高效液色谱法的高效液色谱法的基
16、本理论基本理论基本理论及色谱流程与气相色谱法相似；如塔板理论、速率理论、保留值、分离度等都可用于高效液相色谱法。两者不同的是流动相，因而在基本理论方面需要考虑这些特点。其影响最大的是速率理论。速率理论。描述其板高与影响因素关系的范氏方程如下： 涡流涡流 纵向纵向 传质阻力传质阻力 HAB/uCu现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法但在液相色谱中流动相是液体，黏度大，柱温低，扩散系数小，所以B/u很小可以忽略，则： HACu因此：（1）从A项考虑： A A = 2 = 2ddp p 减小d dp p，小粒固定相，可以提高柱效；降低 采用球形，颗粒均匀分布的固定相，有利于提高柱效；现代仪器分
17、析现代仪器分析之之HPLC 法法（2）从C项考虑：在HPLC中： C=Cm+Csm+Cs通常采用化学键合相，固定液被键合到载体的表面。所以 C=Cm+Csm HA+Cm+Csm范式方程提高柱效的方法：（1）减小d dp p，采用球形小粒固定相，化学键合相（2）低黏度流动相，低流量（1ml/Min）（3）柱温25-30现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第四节第四节 各类高效液色谱法各类高效液色谱法一一 、 液液-液分配色谱法液分配色谱法二、二、 液液-固吸附色谱法固吸附色谱法三、三、 离子交换色谱法离子交换色谱法四、四、 离子色谱离子色谱五、五、 离子对色谱离子对色谱六、六、 排阻色谱色
18、谱排阻色谱色谱现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法一、一、 液液-液分配色谱液分配色谱 固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；固定相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，采用化学键合固定相化学键合固定相（一）正相分配色谱（一）正相分配色谱 亲水性固定液+疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性；分离物质分离物质：强极性化合物（糖类和多肽类糖类和多肽类）；极性大的后出峰； 氰基化学键合相：诱导力，分离可极化的物质 氨基化学键合相：诱导力+氢键作用力 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（二）反相分配色谱（二）反相分配色谱 疏水性固定液+
19、亲水性流动相，流动相的极性大于固定液的极性。n分离物质分离物质：非极性化合物（广泛广泛）；极性小的后出峰； 十八烷基键合相十八烷基键合相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（ ODS反相柱反相柱）。疏溶剂理论：疏溶剂理论： 烃基键合相，强疏水性，组分中非极性部分与烃基键合相烃基键合相，强疏水性，组分中非极性部分与烃基键合相结合。亲水性流动相使组分分离。结合。亲水性流动相使组分分离。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法二、二、 液液-固吸附色谱固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography固定相固定相：固体吸
20、附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用：适用： 分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法三、三、 离子交换色谱离子交换色谱 ion-exchange chromatography 固定相固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；早期采用的离子交换树脂被离子离子键合相键合相代替。 流动相流动相：阳离子离子交换色谱，采用碱性水溶液；阴离子离子交换色谱，采用
21、酸性水溶液； 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法基本原理基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-应用应用：离子及可离解的化合物，有机和无机分离，氨基酸、核酸等。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法四、四、 离子色谱离子色谱ion chromatography （IC） 离子色谱是与离子交换色谱的区别：离子色谱是与离子交换色谱的区别： 采用了特制的、具有极低交换容
22、量的离子交换树脂作为柱填采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。有效方法。 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法一、离子色谱法原理一、离子色谱法原理 以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。洗脱后
23、的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法离子交换原理，与传统离子交换的离子交换原理，与传统离子交换的不同点：不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法2.2.离子色谱具有以下优点离子色谱具有以下优点（1 1）分析速度快）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；（2 2）分离能力高）分离能力高 在
24、适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法 离子色谱装置类型离子色谱装置类型抑制型：抑制柱型、连续抑制型抑制型：抑制柱型、连续抑制型 非抑制型非抑制型: : 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量，使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法离子色谱抑制装置图离
25、子色谱抑制装置图阴离子交换：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法离子色谱连续抑制原理图离子色谱连续抑制原理图现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法离子色谱的应用离子色谱的应用 阴离子分析阴离子分析: : 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm), 流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法五、五、 离子对色谱离子对色谱 ion pair ch
26、romatography原理原理：将一种与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配，从而控制被分离组分的保留值的色谱法。（LLC法基础上演变来的！）法基础上演变来的！） A+ + B- = (A + B- )org离子对的体积较大，又无净电荷，所以有显著的疏水性；离子有亲水性，离子对有疏水性（亲油性）；故可将萃取原理用来讨论离子对色谱的分离问题。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法选择合适的反离子和浓度，就能有效地将被分离组分萃取进有机相。正相离子对色谱：如以水作为固定相，有机溶剂为流动相，离子对容易流出色谱
27、柱；反离子对色谱：反之，则离子对被保留。常用离子对试剂：常用离子对试剂：阴离子分离阴离子分离：常采用烷基胺类烷基胺类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲胺作为对离子；阳离子分离阳离子分离：常采用烷基磺酸类烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法六、六、 排阻色谱色谱排阻色谱色谱size- exclusion chromatography 固定相固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
28、VRV0 +K Vi 流动相：流动相：四氢呋喃、二甲基甲酰胺等四氢呋喃、二甲基甲酰胺等）。应用：应用：可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法七、七、 胶束色谱（胶束色谱（MC）流动相：胶束水溶液，胶束水溶液， 多了一个胶束相，所以有三个界面，三个分配系多了一个胶束相，所以有三个界面，三个分配系数，有比较好的选择性。数，有比较好的选择性。 现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法高压液相色谱法高压液相色谱法的特点高压液相色谱仪高压输入系统进样系统分离系统检测器高压液相色谱法分类高压泵梯度洗脱装置色谱柱固定相固体吸附剂化学键合固定相离
29、子交换树脂凝胶溶质型检测器：紫外、荧光总体型检测器：折光及差示折光分配色谱法吸附色谱法离子交换色谱法凝胶渗透色谱法现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法HPLC固定相：硅胶，化学键合相，凝胶，离子交换剂固定相：硅胶，化学键合相，凝胶，离子交换剂一一. 硅硅 胶胶 吸附色谱常用，应用广（极性至弱极性物质）。吸附色谱常用，应用广（极性至弱极性物质）。类型：表面多孔硅胶，无定形全多孔，球形全多孔，堆积类型：表面多孔硅胶，无定形全多孔，球形全多孔，堆积硅珠硅珠第五节第五节 固定相固定相表面多孔型型球形全多孔型表面多孔表面多孔现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法二化学键合相二化学键合相 以硅胶
30、为载体，经化学反映后，将固定液的官能团键合在载体的表面上。化学键合相优点：化学键合相优点：（1）减少固定液的流失，增加色谱柱的使用寿命；（2）化学稳定，PH2-8溶液（3）传质快，柱效高，载样量大封尾：封尾：化学反应将载体表面硅醇基出去。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法键合类型：键合类型： 硅氧碳型（Si-O-C）键合相醇与硅羟基进行酯化反应得到；易发生水解，目前少用。SiOH+HORSi-O-R +H2O15038h 硅氧硅碳型（Si-O-Si-C）键合相硅羟基与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应得到，稳定多用：Si-OH+ X-Si-R2R1R3
31、Si-O-Si-R2+HXR1R3现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法键合类型有：键合类型有：（一）（一）非极性键合相疏水基团不同链长的烷基，甲基和苯基等；最广：最广：十八烷基键合相十八烷基键合相（C-18柱或柱或ODS柱柱） ：将十八烷基十八烷基通过化学反应键合到硅胶（担体）表面上。影响因素：影响因素：1.载体性质：比表面大，键合基团多，k大，t长 YWG-C18 ， YQG-C182.表面覆盖度：表面覆盖度大，残留硅醇基少，则分配占主导地位。3.键合基团的链长： 链长增加，极性低，k大载体官能团现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法（二）中等极性键合相 醚基键合相（ROR），如：
32、YWG-ROR（三）极性键合相 分析糖类 极性基团 氨基、氰基、醚基和醇基等； （1）氰基化学键合相：中强极性 YWG-CN （2）氨基化学键合相：强极性 YWG-NH2三三. 凝凝 胶胶（一）半硬质凝胶：苯乙烯和二乙烯苯交联，压缩性，易装柱（一）半硬质凝胶：苯乙烯和二乙烯苯交联，压缩性，易装柱（二）硬质凝胶：（二）硬质凝胶： 多孔硅胶等无机材料，易碎，柱效低多孔硅胶等无机材料，易碎，柱效低（三）（三） 主要性能参数：主要性能参数： 分子量排斥极限，平均孔径分子量排斥极限，平均孔径 原则：全渗透点的分子量原则：全渗透点的分子量样品分子量样品分子量分子量排斥极限分子量排斥极限现代仪器分析现代仪器
33、分析之之HPLC 法法四. 离子交换剂 离子键合相 阴离子交换基团胺基、季铵基、阳离子交换基团磺酸基。以含有离子交换基团（磺基、氨基、羧基等）的键合相为固定相。例如: YWG-SO3H, YWG-R3NCl Zipax-SCX(薄壳型阳离子键合相)现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法一一. HPLC对流动相的要求：对流动相的要求： 不与固定相发生不可逆化学变化；溶解样品；与检测器相配；粘度小，有利于获得高柱效；廉价、毒性小、易于纯化等。选择原则：选择原则：“相似相溶”。试样极性、固定相极性及流动相极性之间的配合与经典色谱法相似。被分离物的极性 吸附剂的极性 流动相的极性 大 小 大 小
34、大 小第六节 流动相现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法二. 常用流动相溶剂的性质（一）沸点（b.p）：低沸点（二）黏度：黏度太大，C项大，柱效低（三）互溶性：好（四）极性：用罗氏常数描述。 调节极性可以使样品组分的k在合适范围。极性参数P: Pab=aPa+ bPb极性参数与k关系: k2/k1=10 (P1-P2)/2 (正相色谱) k1/k2=10 (P1-P2)/2 (反相色谱)现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法三. 溶剂的选择性与分类四. 不同色谱选不同流动相(一)吸附色谱用流动相 通过实验选择。(二)分配色谱用流动相: 指导原则1k10正相:最常用的流动相：饱和烷烃，
35、如已烷，庚烷反相:最常用的流动相：水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等。水甲醇体系：大约50水的时候粘度最大水乙腈体系：35水的时候粘度最大。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法(三)离子交换色谱用流动相 缓冲溶液，可以解离离子。(四)尺寸排阻色谱用流动相 不需要改变流动相组成来改变分离，只要流动相能溶解样品，黏度低就可以。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第七节 HPLC分析条件的选择一.分离条件的选择(一)分离方法的选择现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：考虑分离方法的选择，主要考虑以下三个方面：（1）相对分子量相对分子量 分子量
36、小于200的一般选用气相法；2002000的选用液液、液固、或离子交换色谱法；大于2000的可用排斥色谱法。（2）溶解度溶解度 水溶性样品最好用离子交换或液液分配色谱法；微溶于水的，但在酸、或碱存在下能很好离解的，可用离子交换色谱法；油溶性、或相对极性较弱的混合物，可用液固色谱法。（3）化学结构化学结构 离子型、或易离子化、或易形成离子对的化合物宜用离子色谱法；异构体的分离，宜用液固色谱法；同系物的分离，宜用液液分配色谱法；高分子化合物宜用排阻色谱法。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法(二) 梯度洗脱 分离指导原则是组分:1k10等度洗脱（流动相比例不变）等度洗脱（流动相比例不变）:样
37、品组分少，性质差别不大。梯度洗脱：梯度洗脱：一个分析周期内，程序控制流动相的组成（极性，PH，离子强度）改变，使每个组分都能在适宜条件下分离。跟GC程序升温作用相似。 适用：适用：多组分复杂样品。 优点：优点： 缩短分析时间，提高分离度R，改善峰形，提高灵敏度。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法二. 检测器的选择选择UV，ELSD，荧光，电化学检测器？根据前面所讲的内容总结。三. 色谱条件的评价（一）理论塔板数（n）（二）分离度 R（三）重复性 重复进标准品5针，计算峰面积的 RSD2.0%（四）拖尾因子 T （0.95-1.05）现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第八节第八节
38、 定性与定量分析定性与定量分析一.定性分析定性分析（一）（一） 保留值保留值定性定性 在一定操作条件下，各组分的保留时间是一定值保留时间是一定值。（二）化学鉴定法（二）化学鉴定法 收集分离后组分定性。（三）HPLC-光谱联用技术 HPLC-MS，HPLC-FTIR，HPLC-NMR现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法二二. 定量分析定量分析与GC差不多。（一）外标法：以试样的标准品作对照物质，与对照物质对比求算试样含量的方法。 标准曲线法 ， 外标一点法，外标二点法。 用六通阀进样，进样误差小，故HPLC常用外标法。（二）内标法1.标准曲线法 Ci=bAi/As+a2.内标对比法（内标一
39、点法）现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法第九节第九节 LC-MS联用技术简介联用技术简介LC-MS技术飞速发展：一. 接口技术 主要是去除溶剂并使样品离子化。 大气压电离源（API）：（1）电喷雾电离源（ESI）（2）大气压化学电离源（APCI）LC-MS分离过程：样品经色谱分离，由ESI 或APCI离子化，进入MS分析。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法LC-MS现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法应用（一）定性分析 提供未知化合物的分子量，高分辨率的如飞行时间TOFMS可以得到化合物的信息。（二）定量分析 与HPLC方法差不多。采用与待测组分对应的特征离子得到的质量色谱图，减少干扰。现代仪器分析现代仪器分析之之HPLC 法法本章内容复习第一节第一节 概概 述述第二节第二节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪第三节第三节 高效液色谱法的基本理论高效液色谱法的基本理论第四节第四节 各类高效液色谱法各类高效液色谱法第五节第五节 固定相固定相第六节第六节 流动相流动相第七节第七节 HPLC分析条件的选择分析条件的选择第八节第八节 定性与定量分析定性与定量分析第九节第九节 LC-MS联用技术简介联用技术简介第十节第十节 超临界流体色谱法简介超临界流体色谱法简介
