1、.2本章学习目的与要求掌握：n 生殖、发育毒性试验的基本概念n 生殖毒性和发育毒性的表现n 生殖毒性试验和发育毒性试验的观察指标理解：n 生殖毒性和发育毒性评价的试验方法和设计原理了解：n 生殖发育毒性试验的体外代替试验 n 生殖是使种族延续的各种生理过程的总称。n 生殖过程一般是指从配子形成直到胎儿娩出的整个过程。其中包括精子的发生、卵的形成、配子的释放、受精、卵裂和胚泡发育、着床、胚胎发生、胎儿发育、分娩。n 胎儿的娩出也并不意味着胎儿发育成熟的终止，从广义上说生殖还应包括胎儿娩出后的新生儿期、哺乳期、直到性成熟的整个过程。生殖毒性发育（子体）毒性生殖系统（亲体）毒性胚胎发育胚胎发育胎儿发
2、育胎儿发育产后发育至性成熟产后发育至性成熟性欲、性行为性欲、性行为配子产生配子产生生殖结局生殖结局激素水平激素水平一、外源化学物对生殖发育的影响n 干扰生殖发育的任何环节，并造成损害作用。n 可以通过对内分泌系统，特别是对性腺的作用，发生间接的影响。n 神经系统对内分泌功能也有调节作用，通过下丘脑-垂体-睾丸轴(下丘脑-垂体-卵巢轴)两条途径作用于生殖发育过程 。 二、外源化学物对生殖发育损害作用的特点n 生殖发育过程较机体其他系统更为敏感 例如：妊娠期接触过不足以引起肿瘤的低剂量二乙基亚硝胺，仔鼠成年后再次接触，则肿瘤发生率增加。 n 外源化学物对生殖发育过程影响的范围较为广泛和深远。 例如
3、：母鼠接触高浓度二硫化碳引起致畸作用，其子一代既使不再接触二硫化碳，交配后所生的子二代仔鼠也出现与子一代仔鼠几乎完全相同的畸变类型。n 生殖发育毒理学：研究出生前暴露于环境有害因子导致的异常发育结局及有关的作用机制、发病原理、影响因素和毒物动力学等的学科。n 生殖毒理学(reproductive toxicology)主要研究外源化学物对生殖细胞发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的损害作用。 评定方法即为生殖毒性试验。n 发育毒理学(developmental toxicology)主要研究外源化学物对胚胎发育、胎仔发育以及出生幼仔发育的影响。 评定方法称为发育毒性试验，其中主要
4、为致畸试验。三、基本概念n 1940年澳大利亚风疹大流行，次年流行婴儿先天性白内障、耳聋、智力不全、先天性心脏病。n 1945年广岛长崎原子弹爆炸，受辐射儿童小头畸形、智力低下，一年内死亡率25%。n 1960年反应停事件（thalidomide incident）， 欧洲出生8000多海豹畸形或海豹症（phocomelus）儿童。n 1968年日本多氯联苯污染米糠油事件，孕妇出现死产、早产、“油症儿”。n 1961-1970年美国在越战中使用落叶剂2,4,5-T（含TCDD），孕妇流产、产下小头和Downs综合征畸形儿。n 1966-1972年美国孕妇服用己烯雌酚，女性后代青春期阴道癌，男性
5、后代成年后性功能低下、精子数下降。四、历史上的教训反应停thalidomide一、基本概念n 指出生前经父体和(或)母体接触外源性理化因素引起的在子代到达成体之前出现的有害作用。n 胚胎期、胎儿期、产后生长发育期 发育毒性的表现（1）生长迟缓（2）致畸作用发育毒性的表现（3）功能不全或异常n 肝、肾、心功能不全。n 环境激素类物质（邻苯二甲酸酯） ，不仅关闭了胎儿Y染色体上的Sry基因，并且还转变成了促进胚胎出现女性表征的雌性激素。（4）胚胎或胎仔致死作用 流产、死产或死胎n 畸形(malformation)：器官形态的异常。n 畸胎(terate)：n 致畸物(teratogen)：在一定剂
6、量下，能通过母体对胚胎或胎儿正常发育过程造成干扰，使子代出生后具有畸形的化合物。二、致畸作用的毒理学特点n 受精卵发育为成熟个体的过程，包括：胚泡形成、着床、器官发生、胎儿发育、新生儿发育。n 大鼠器官发生期约为9-17天；小鼠器官发生期为7.5-16天；家兔为11-20天 ；人为3-12周。n 剂量增加，毒性作用增强，但与致畸性不成一定的比例。 胚胎致死作用增强，致畸作用降低。n 某种致畸物可以引起一定的畸形，但在给予更高的剂量，并不出现同一类型的畸形。 例如环磷酰胺：低剂量多趾，中等剂量肢长骨缩短，高剂量缺肢或无肢。n 许多致畸物除具有致畸作用外，还可能同时出现胚胎死亡和生长迟缓，不同表现
7、相互影响，又无一定规律。n 同一种致畸物对不同的动物并不一定都具有致畸作用，并且引起畸形的类型也不一致。 例如：反应停对人类以及其它灵长类动物具有强烈致畸作用，但对小鼠和家兔即使接触较大剂量，其致畸作用仍极为轻微。n 同一物种动物的不同品系对一种致畸物敏感性的差别很大。 例如：口服反应停，个体差异较大。三、致畸作用机理n 干扰基因干扰基因n 表达基因突变与染色体畸变表达基因突变与染色体畸变n 损伤细胞和分子水平的翻译损伤细胞和分子水平的翻译n 细胞调亡细胞调亡n 干扰细胞干扰细胞n 通过胎盘毒性引起发育毒性通过胎盘毒性引起发育毒性n 干扰母体稳态干扰母体稳态n 内分泌干扰作用内分泌干扰作用 四
8、、外源化学物发育毒性的评价n 动物选择n 剂量分组n 动物交配处理n 胎仔检查n 数据处理n 结果评定（1）动物选择n 食性和对受试物代谢过程与人类接近；n 体型小，驯服，容易饲养、繁殖及价廉；n 妊娠过程较短、每窝产仔数较多、胎盘构造及厚度与人类接近。 大鼠（12-2012-20只只/ /组组）（2）剂量分组n 先进行预试验，找出引起母体中毒的剂量；n 最高剂量组，可以引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%；n 最低剂量组不应观察到任何中毒症状；n 中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状。（3）动物交配处理n 将性成熟雌雄动物按雌雄l：1或2：1比例同笼交配。每日将
9、已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。 受孕日确定n 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌握动物接触受试物的时间，必须在器官发生期。 （4）胎仔检查自然分娩前自然分娩前1-21-2日将受孕动物处死，剖腹取出活产胎仔日将受孕动物处死，剖腹取出活产胎仔（畸形检查只限活产胎仔）。（畸形检查只限活产胎仔）。n 外观畸形肉眼检查外观畸形肉眼检查，例如露脑；，例如露脑；n 肉眼检查内脏及软组织畸形，肉眼检查内脏及软组织畸形，例如腭裂；例如腭裂；n 骨骼畸形检查骨骼畸形检查，例如颅顶骨缺损，例如颅顶骨缺损， 分叉肋等。分叉肋等。 （5）数据处理n 活产幼仔平均畸形出现数n 畸形出现率 n 母体畸胎出现
10、率n 致畸指数= 雌鼠LD50/最小致畸剂量观察指标致畸性大小：n 致畸指数 10以下为不致畸 10-100致畸 100以上强致畸（6）结果评定是否具有致畸性：n 活产幼仔平均畸形出现数n 畸形出现率 n 母体畸胎出现率n 大鼠全胚胎培养n 胚胎细胞微团培养n 小鼠胚胎干细胞试验n 发育毒性的体内预筛试验(C .K.试验) 一、生殖毒性n 包括：生殖细胞的发生、配子的释放、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程。生殖毒性的表现n 雌性 排卵规律改变、经期失调或闭经、卵巢萎缩、生殖能力的降低、受孕减少或不孕、胚胎死亡等。n 雄性 睾丸萎缩或坏死、精子数目减少。 n 一项统计显示，目前，我国有
11、育龄夫妇约2.3亿人，其中有近1000万不孕不育症患者，而且每年以数十万的速度递增。也就是说，我国每10对育龄夫妇中就有1对遭遇生育问题，比30年前翻了10倍多！n 自发流产率可达全部妊娠中的50%。n 着床后的自发流产率为32%34%。n 2008年，解放军174医院生殖中心调查显示，四成男性精子数量、质量不正常。n 我国人口和计划生育委员会科学技术研究所，整理分析了北京、上海等39个市、县的数据，结果显示，近25年来，我国男性的精液质量正以每年1%的速度下降，精子数量降幅达40%以上；且工业化程度越高，该地区的精子质量降低越明显。 n 精子质量降低已经有低龄化的趋势。2009年，武汉一家计
12、生研究所曾经在高校公开征精，但意外的是，前来捐精的400名大学生志愿者，精子合格的不到50人。n 2004年，全国人大代表钟南山院士在广州分组讨论会上说：“食品安全日趋严重，50年后广东的大多数人将丧失生育能力。”n 生育危机，随科技进步和化学革命已经降临到人类头上的。食品安全已成为破坏男女生育能力的祸首。n 对于直接和间接用于食品的化学物质进行安全性评价是一项极为重要的任务。 精原细胞精原细胞(休止状态休止状态) 2n 有丝分裂有丝分裂(青春期青春期)初级精母细胞初级精母细胞 2n 减数分裂减数分裂次级精母细胞次级精母细胞 n 精细胞精细胞 n精细胞转变成成熟精子精细胞转变成成熟精子精子生成
13、或精子发生精子生成或精子发生 n 人：72-90天n 小鼠：35天n 大鼠：48天n 兔：43天二、雄性生殖毒性评价n 对睾丸生精细胞的影响 精子生成障碍、引起生殖细胞突变。n 对内分泌功能的影响 睾丸间质细胞功能异常，有关激素合成或作用 发生改变。（1）精子生成分析n 精子计数n 精子形态观测n 精子状态分析试验（2）精子穿透试验n 检测精子在体外能否成功穿透去透明带的金黄地鼠卵子而受精的试验。（3）体外试验n 睾丸支持细胞和间质细胞的分离培养。 （4）睾丸中标志酶活性的测定n 指标：乳酸脱氢酶X、山梨醇脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶；（5）雄性激素检测n 指标：促性腺激素、黄体生成素、雄激素
14、的含量正常细胞电泳图正常细胞电泳图受损细胞电泳图受损细胞电泳图（6）雄性生殖细胞的遗传毒性试验 单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）（7）病理学检查n 大体检查：睾丸、附睾、前列腺及精囊的重量和形态；n 病理组织学检查L：隐睾鼠的睾丸和附睾：隐睾鼠的睾丸和附睾 R：正常鼠的睾丸和附睾：正常鼠的睾丸和附睾A ：正常雄性正常雄性仔鼠的睾丸和附睾仔鼠的睾丸和附睾; B ：尿道下裂尿道下裂仔鼠的睾丸和附睾。仔鼠的睾丸和附睾。 (200）三、雌性生殖毒性评价卵原细胞卵原细胞(休止状态休止状态) 2n 有丝分裂有丝分裂(青春期青春期)初级卵母细胞初级卵母细胞 2n 减数分裂减数分裂次级卵母细胞次级卵母细胞 n
15、减数分裂减数分裂 卵细胞卵细胞 n 成熟卵子成熟卵子 n 对卵细胞的影响 卵母细胞数减少或突变n 对内分泌功能的影响 影响受精、着床、胚胎发育、分娩等n 其它毒性作用 如对子代造成畸形、死胎、功能发育不全等。生精细胞雌性生殖毒性的检测方法动物试验体外试验其他辅助试验繁殖毒性试验和致畸试验三段生殖试验妊娠前期及初期器官形成期围产期及授乳期四、生殖毒性的评价n 作用：全面反映外源化学物对性腺功能、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断乳后生长发育可能发生的影响。n 动物选择：多用性成熟大鼠， 雌雄比例1:1或2:1。n 染毒：接触受试物的方式可混入饲料或饮水中，由动物摄取，也可采用灌胃或腹
16、腔注射。n 剂量分组：设三个剂量组，以及一个空白和溶剂对照组。 高剂量组：以超过人类实际接触水平，能使新一代动物出现轻度中毒，死亡率不超过10%，不完全丧失生育能力。 低剂量组：新代动物仅能出现轻微的中毒症状。 中间剂量组：介于高剂量和低剂量之间的剂量。 n 三代两窝生殖试验n 两代一窝生殖试验n 一代一窝生殖试验（断奶或出生周）（断奶或出生周） 给予受试物到周给予受试物到周 观察三个月，喂饲普通饲观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况料，观察其生长发育情况 断乳后给予受试断乳后给予受试物到周物到周 观察三个月，喂饲普通饲观察三个月，喂饲普通饲料，观察其生长发育情况料，观察其生长发育情况
17、 断乳后给予受试断乳后给予受试物到周物到周 多代生殖毒性研究不仅能够检测受试物对成年动物生殖毒性的影响，还能检测外源化学物对子代生育力的影响。n 受孕率(%)： 反映雌性动物生育能力以及雌性动物受孕情况。 n 正常分娩率(%) ： 反映雌性动物妊娠过程是否受到影响。n 幼仔出生存活率(%) ： 反映雌性动物分娩过程是否正常。n 幼仔哺育成活率(%) ： 反映雌性动物授乳哺育幼仔的能力。 %100交配雌性动物数妊娠雌性动物数受孕率%100妊娠动物数正常分娩雌性动物数正常分娩率%1004分娩时出生幼子数天存活幼子数出生后幼子出生存活率%100421天幼子存活数出生后天断乳幼子存活数幼仔哺乳成活率n 如何快速敏感地检测环境激素样物质n 易感作用阶段n 动物和人体致畸性的差异、致畸性的机制当前存在的主要问题研究热点n 建立快速特异的环境激素测试方法n 检测环境激素的污染水平，阐明其危害n 人体和动物的致畸物的快速检测
