1、1 1Seminar 2 2主要内容主要内容uCaco-2细胞的介绍细胞的介绍uCaco-2细胞模型的建立与评价细胞模型的建立与评价uCaco-2细胞模型的应用细胞模型的应用uCaco-2细胞模型的发展细胞模型的发展3 3CacoCaco2 2 细胞单层模型简介细胞单层模型简介aco-2aco-2细胞：细胞： 人结肠癌细胞（人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line)the human colon carcinoma cell line) Caco-2 Caco-2细胞的形态学特征：细胞的形态学特征： Caco-2 Caco-2 细胞具有与小肠上皮细胞
2、相同的微绒毛结构和紧密连接。细胞具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接。 微绒毛微绒毛紧密连接紧密连接细胞核细胞核4 4Caco-2Caco-2细胞生化性质特征：细胞生化性质特征： 主动转运系统主动转运系统: :糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B12B12内源性内源性 因子的主动转运载体。因子的主动转运载体。 酶酶: : 小肠细胞刷状缘的酶；小肠细胞刷状缘的酶； 相代谢酶相代谢酶:CYP1A1 :CYP1A1 相代谢酶相代谢酶: :谷胱甘肽谷胱甘肽S-S-转移酶转移酶,-,-葡萄糖醛酸糖苷酶及葡萄糖醛酸糖苷酶及 磺基转移酶。磺基转移酶。 由于形态学及生化性
3、质都与小肠上皮很相似由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,Caco-2 ,Caco-2 细细胞模型已广泛的用于体外药物分子肠吸收的研究。胞模型已广泛的用于体外药物分子肠吸收的研究。CacoCaco2 2 细胞单层模型简介细胞单层模型简介5 5CacoCaco2 2 细胞单层模型建立细胞单层模型建立aco-2aco-2细胞模型的建立细胞模型的建立 6 6Caco-2Caco-2细胞模型的平面图细胞模型的平面图Caco-2Caco-2细胞模型的切面图细胞模型的切面图7 7CacoCaco2 2 细胞单层模型的评价细胞单层模型的评价细胞形态学细胞形态学( (小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接小肠微绒毛
4、结构及细胞间紧密连接) ; ) ; 小肠刷状缘细胞标志酶小肠刷状缘细胞标志酶碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶的活性; ;CacoCaco2 2 细胞单层的跨膜电阻细胞单层的跨膜电阻( transepithelial elect( transepithelial elect rical resistance ,TEER) ; rical resistance ,TEER) ; 漏出标志物漏出标志物( (甘露醇、荧光黄等甘露醇、荧光黄等) ) 被动扩散的跨膜通量被动扩散的跨膜通量; ; CacoCaco2 2 细胞的胞饮功能细胞的胞饮功能( (用辣根过氧化物酶测定用辣根过氧化物酶测定) ;) ; 8 8
5、药物肠道吸收的方式药物肠道吸收的方式 被动扩散穿细胞间载体转运胞吞被动扩散穿细胞间载体转运胞吞 外排系统（如外排系统（如P-gp、MRP）9 9CacoCaco2 2 细胞单层模型的药物转运机理细胞单层模型的药物转运机理药物的转运过程药物的转运过程:药物分子从Caco-2 单细胞层的顶侧肠腔侧(AP侧) 跨过Caco-2 单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧(BL 侧)Caco-2 单层细胞模型示意图AP 侧: 肠腔侧; BL 侧: 基底侧 1010CacoCaco2 2 细胞单层模型药物吸收实验参数细胞单层模型药物吸收实验参数Papp =dQ (dt A C0)Papp：表观渗透系数表观渗透系数
6、dQ/dt：接受药物侧待测药物出现的速率，即渗透速率接受药物侧待测药物出现的速率，即渗透速率A：细胞单层表面积细胞单层表面积（cm2)C0:给药侧的初始药物给药侧的初始药物1111细胞培养条件细胞培养条件: :细胞种植密度是否达到融合细胞种植密度是否达到融合, ,细胞分化的阶细胞分化的阶 段段, ,重要营养物质或生长因子的存在或缺失。重要营养物质或生长因子的存在或缺失。转运介质的组成溶液的浓度、温度、转运介质的组成溶液的浓度、温度、pHpH值等。值等。某种代谢来源的能量或离子的存在或缺失某种代谢来源的能量或离子的存在或缺失, ,竞争性溶质的竞争性溶质的 在或缺失。在或缺失。影响细胞转运和代谢性
7、质的因素影响细胞转运和代谢性质的因素1212CacoCaco2 2 细胞单层模型在药物吸收研究中的应用细胞单层模型在药物吸收研究中的应用v研究药物结构研究药物结构- - 吸收转运关系吸收转运关系11v预测药物的体内吸收预测药物的体内吸收: :被动扩散药物的口服生物利用度与表观被动扩散药物的口服生物利用度与表观 渗透系数间有良好的相关关系渗透系数间有良好的相关关系2,32,3 。Tab 1 Relationship between apparent permeability coefficients( Papp) and Bioavailabilityv研究药物剂型对吸收的影响研究药物剂型对吸收
8、的影响44 v确定药物在肠腔吸收的最适确定药物在肠腔吸收的最适pH pH 值值55 v评价前体药物的口服吸收评价前体药物的口服吸收66 Apparent permeability coefficients/ cms - 1 Bioavailability/ % 1 10 - 6 100 0.110 61.010 6 1100 1 10 - 7 1 1313CacoCaco2 2 细胞单层模型在药物吸收机制研究中的应用细胞单层模型在药物吸收机制研究中的应用vCaco-2 Caco-2 细胞模型用于被动转运的研究细胞模型用于被动转运的研究77vCaco-2 Caco-2 细胞模型用于载体介导主动转
9、运的研究细胞模型用于载体介导主动转运的研究88、99vCaco-2 Caco-2 细胞模型用于药物外排机制的研究细胞模型用于药物外排机制的研究10101414Caco-2 Caco-2 细胞模型在中药吸收研究方面的应用细胞模型在中药吸收研究方面的应用 Caco-2 Caco-2 细胞模型在中药吸收方面研究的热点目前主要细胞模型在中药吸收方面研究的热点目前主要集中在对黄酮类化合物及生物碱吸收机制的研究。集中在对黄酮类化合物及生物碱吸收机制的研究。 对黄酮类化合物中的槲皮素对黄酮类化合物中的槲皮素4 4- -葡萄糖苷在进行研究发葡萄糖苷在进行研究发现现, ,该化合物在该化合物在Caco-2 Cac
10、o-2 细胞模型中不被吸收。外排呈饱和细胞模型中不被吸收。外排呈饱和过程过程, ,这一外排过程不能被这一外排过程不能被P-gpP-gp抑制剂维拉帕米抑制抑制剂维拉帕米抑制, , 但却但却能被能被MRPMRP抑制剂抑制剂MK571MK571竞争性抑制。这一结果说明槲皮素竞争性抑制。这一结果说明槲皮素4 4- -葡萄糖苷在葡萄糖苷在Caco-2 Caco-2 细胞模型中的外排是由细胞模型中的外排是由MRPMRP介导的介导的, ,同时同时服用服用MRPMRP抑制剂对提高该化合物的口服吸收程度可能有帮助抑制剂对提高该化合物的口服吸收程度可能有帮助1111。1515Caco-2 Caco-2 细胞模型在
11、药物代谢方面的应用细胞模型在药物代谢方面的应用u I I相代谢酶相代谢酶: :细胞色素细胞色素P450P450等。等。 u 相代谢酶相代谢酶: :磺基转移酶、谷胱甘肽磺基转移酶、谷胱甘肽S-S-转移酶、转移酶、-葡糖葡糖 醛酸糖苷酶。醛酸糖苷酶。u 存在存在P-gp P-gp 、MRP MRP 外排系统及细胞色素外排系统及细胞色素P450 P450 同工酶同工酶( (与人与人 类小肠上皮一致类小肠上皮一致) ,) ,人们可以利用这一模型研究氧化代谢人们可以利用这一模型研究氧化代谢 与外排作用在限制药物口服生物利用度方面的关系与外排作用在限制药物口服生物利用度方面的关系1212。1616Caco
12、Caco2 2 细胞单层模型的优点细胞单层模型的优点v细胞培养条件相对容易控制细胞培养条件相对容易控制, , 能够简便、快速的获得大量新能够简便、快速的获得大量新 的、有价值的信息的、有价值的信息, , 这些信息易于转化为药物转运、代谢的这些信息易于转化为药物转运、代谢的 基本原理。基本原理。vCaco-2 Caco-2 细胞来源是人结肠癌细胞细胞来源是人结肠癌细胞, ,同源性好。该模型与药物在同源性好。该模型与药物在 肠中的吸收有良好的相关性、较高的重现性。肠中的吸收有良好的相关性、较高的重现性。v该模型有较广泛的适用性该模型有较广泛的适用性( (可用于原料药、制剂、大、小分子可用于原料药、
13、制剂、大、小分子 的跨肠膜研究的跨肠膜研究) )。vCaco-2 Caco-2 细胞内有药物代谢酶细胞内有药物代谢酶, ,可在有代谢状况下测定药物的跨可在有代谢状况下测定药物的跨 膜转运。膜转运。v可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。1717CacoCaco2 2 细胞单层模型的缺点细胞单层模型的缺点vCacoCaco2 2细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞, ,因而缺乏小肠上皮中因而缺乏小肠上皮中 的粘液层。的粘液层。v缺少细胞异质性缺少细胞异质性( (单一细胞构成单一细胞构成) ;) ;vCacoCaco2 2 细胞中某些特别的
14、酶细胞中某些特别的酶( (细胞色素细胞色素P450 P450 的一些同工酶的一些同工酶) )的的 活性与人体小肠上皮细胞的差别及活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gp P-gp 在在Caco-2 Caco-2 细胞中表达细胞中表达 的波动性对结果有不同程度的影响。的波动性对结果有不同程度的影响。vCacoCaco2 2 细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具 特征性特征性, ,其其TEER TEER 值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分 子药物穿细胞间转运的应用研究。子药物穿细胞间转运的应用研究。
15、vCacoCaco2 2 细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低, ,因而在主动转因而在主动转 运药物的研究方面相对不如被动扩散药物研究的成功。运药物的研究方面相对不如被动扩散药物研究的成功。1818CacoCaco2 2 细胞单层模型的新发展细胞单层模型的新发展*优化细胞培养条件：缩短细胞培养的时间。优化细胞培养条件：缩短细胞培养的时间。*细胞共培养：如与杯状细胞细胞共培养：如与杯状细胞HT29 HT29 共同培养共同培养, , 为为Caco-2 Caco-2 细胞细胞 单层膜提供其缺乏的粘层膜。单层膜提供其缺乏的粘层膜。*生化诱导：用经典的细胞生物学方法诱导生
16、化诱导：用经典的细胞生物学方法诱导CacoCaco2 2 细胞上缺乏细胞上缺乏 或低表达的药物代谢相关酶和转运体的表达。或低表达的药物代谢相关酶和转运体的表达。*重组技术：重组技术：CharlesCharles1313等用重组技术在等用重组技术在CacoCaco2 2 细胞中引入细胞中引入 CYPcDNAs, CYPcDNAs, 提高提高CYP3A4 CYP3A4 和和CYP2A6 CYP2A6 的表达。通过的表达。通过 培养培养CYP3A4 CYP3A4 表达的表达的CacoCaco2 2 细胞细胞, , 开拓开拓CacoCaco2 2 模型在研究药物首过代谢方面的应用。模型在研究药物首过代
17、谢方面的应用。19191 Gan LS ,Thankker DR. Applications of the Caco-2 model in the design and development of biochemical and physical barriers posed by the intestinal epithelium. A dv Drug Delivery Rev ,1997 ;23 (13) :77982 Artursson P , Karlsson J . Correlation between oral drug absorption in human and appa
18、rent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial (Caco22) cells. Biochem Biophys Res Commun ,1991 ;175 (3) :88053 Yee S. In vit ro permeability across Caco22 cells (colonic) can predict i n vivo ( small intestinal ) absorption in man2fact or myth.Pharm Res ,1997 ;14 (6) :76364 Udat
19、a C , Patel J , Pal D et al . Enhanced transport of a novel anti-HIV agent2cosalane and its congeners across human intestinal epithelial (Caco22) cell monolayers. Int J Pharm ,2003 ;250 (1) :1576855 Yamashita S , Furubayashi T , Kataoka M et al . Optimized conditions for prediction of intestinal dru
20、g permeability using Caco-2 cells. Eur J Pharm Sci ,2000 ;10 (3) :1952046 Rouquayrol M , Gaucher B , Roche D et al . Transepithelial transport of prodrugs of the HIV protease inhibitors saquinavir , indinavir , and nelfinavir across Caco-2 cell monolayers. Pharm Res ,2002 ;19 (11) :170412参考文献参考文献202
21、07 Gan LS , Hsyu PH , Pritchard J F , Thakker D. Mechanism of intestinal absorption of ranitidine and ondansetron : Transport across Caco-2 cell monolayers. Pharm Res , 1993 ;10 (12) :1722-58 Menon RM , Barr WH. Transporters involved in apical and basolateral uptake of ceftibuten into Caco22 cells.
22、Biopharm Drug Dispos , 2002 ;23 (8) :317-269 Anand BS , Patel J , Mitra AK. Interactions of the dipeptide ester prodrugs of acyclovir with the intestinal oligopeptide transporter :Competitive inhibition of glycylsarcosine transport in human intestinal cell line2Caco22. J Pharmacol Ex p Ther ,2003 ;3
23、04 (2) :781-10 Fricker G, Drewe J , Huwyler J et al . Relevance of pglycoprotein for the enteral absorption of cyclosporin A : In vit ro2i n vivo correlation. B r J Pharmacol ,1996 ;118 (7) :1841-711 Walgren RA , Karnaky KJ , Lindenmayer GE , Walle T. Efflux ofdietary flavonoid quercetin 42 2glucosi
24、de across human intestinal Caco-2 cell monolayers by apical multidrug resistance2associated protein22. J Pharmacol Ex p Ther , 2000 ;294 (3) :830-612 王堃王堃, 仲来福仲来福. 肠道肠道CYP3A 和和P-gp :服药物的吸收屏障服药物的吸收屏障.中国药理学通报中国药理学通报,2003 ;19 (9) :988-9113 You J , L iang Z, Zeng GL. A unified reconstruction framework for both parallel-beam and variable focal-length fan-beam collimators by a Cormack-type inversion of exponential Radontrans form. IEEE T rans. M ed Imag, 1999; 18 (1) 59参考文献参考文献2121 谢谢欢迎批评指证
