1、实习三实习三 不同园艺植物花粉不同园艺植物花粉离体培养生活力的测定离体培养生活力的测定一、实验目的 1 1. .掌握园艺植物的花粉收集、并掌握利用不同方法进行花粉生活力的测定。 2.2.观察花粉在离体条件下的萌发情况，认识花粉萌发形成花粉管的外形和伸长过程以及萌发的长度,为理解园艺植物的生殖过程及杂交育种奠定基础。二、实验原理 正常的成熟花粉粒具有较强的活力，在适宜的培养条件下便能萌发和生长，在显微镜下可直接观察计算其萌发率，以确定其活力。花粉贮藏的原理在于创造一定的条件，使花粉降低代谢强度，延长花粉的寿命。花粉寿命的长短，因植物种类不同而异。在自然条件下，大多数植物的花粉从花药散出后只能存活
2、几小时，几天或几个星期。 花粉寿命的长短除了上述因种遗传性的差异以外，还与温度、湿度有密切的关系。通常高温高湿下花粉呼吸旺盛，会很快失去生命力，但在极干燥的条件下，花粉失去水分，也不利于保存。亚达姆斯试验发现苹果花粉在干燥状态下，可保存3个月；如放在28，湿度80的条件下，经过5个星期即失去生活力。维霍夫试验中，丁香的花粉贮藏在干燥器中，15d以后发芽率降到50；至20d时，仅有个别花粉发芽；到30d时，即全部死亡。因此，暂时不用的花粉，应立即在适宜的条件下贮藏，妥善保存。为保持花粉生活力则人为采取减低其代谢强度，保持其纯洁性，将其贮存于低温、干燥、黑暗，并较为稳定的环境条件下，以保持其活力。
3、三、实验材料、主要仪器和试剂 1.1.材料：不同园艺植物，任选3种 2.2.主要仪器：镊子、显微镜、恒温箱、培养皿、烧杯、玻璃棒、量缸、电磁炉、标签、记号笔、离心管、冰箱、牙签、分析天平。 3.主要试剂：琼脂、蔗糖、硼酸、无水CaCl2 。 （一）形态检测法（一）形态检测法 把具有品种典型性的花粉粒作为具有生活力的把具有品种典型性的花粉粒作为具有生活力的花粉；花粉； 把小的、皱缩的、畸形的以及没有内含物的作把小的、皱缩的、畸形的以及没有内含物的作为没有生活力或具有较弱生活力的花粉。为没有生活力或具有较弱生活力的花粉。花粉置于载玻片上，滴上水，盖上盖玻片观察，然花粉置于载玻片上，滴上水，盖上盖玻
4、片观察，然后自制表格进行记载。后自制表格进行记载。 四、实验方法分别介绍四、实验方法分别介绍 （1 1）采集花朵采集花朵 选择正常的无病虫害的园艺植株上含苞待放正常的花朵，采集后带回实验室剔除过大及过小的以及一些叶子和杂质。（二）花粉萌发检测法（二）花粉萌发检测法用镊子取出花药（每个园艺植物取20个花蕾的花药）置于培养皿（纸盒-花粉量多）中，写上标签，进行必要的加温处理（培养箱温度25使其散粉。散粉然后将花粉收集于2ml的离心管（花粉瓶）中，用封口膜密封盖子，写上标签置于冰箱（-20）内储藏备用。（或者不同温度25，5、0、-20、-40和-86下贮藏）。注意采集花药开裂前后的新鲜花粉，对不成
5、熟的幼嫩花药的花粉，成熟过头的花粉被雨露粘湿的花粉，有疑问的花粉杂质要除去。 确定配确定配方方培养基的培养基的熬制熬制分装培分装培养皿养皿培养基的配制：琼脂量：7g/L，蔗糖：15g/100mL（15%），调pH6.0，分装到培养皿中，凝固后即为花粉离体培养的发芽床。花粉培养为固体培养，琼脂需要的量是5g/L-7g/L，在琼脂中分别添加蔗糖、硼酸、氯化钙为参照因素，按照（三因素三水平）进行正交设计。按照设计进行配置培养基。因素因素水平水平11005010021501001503200150200表表1 因素水平表因素水平表试验处理试验处理列号列号1（A）2（B）3(C)1 11112 2122
6、3 31334 42125 52236 62317 73138 83219 9332表表2 2 花粉培养正交试验正交表花粉培养正交试验正交表取出花粉，用牙签沾取已经散好的花粉轻轻均匀抖在培养基上，抖上之后先在显微镜下观察，要求每个视野内3050个，避免成团影响观察效果。 按要求撒好后用记号笔在标签上做标记（时间、品种、组别）放在25培养箱内进行培养，培养箱内进行培养，观察花粉管的萌发伸长。观察花粉管的萌发伸长。 培养1h，2h，3h，5h后 进行显微镜观察,观察萌发的个数，每个培养皿观察3个重复，算出平均数，然后计算不同园艺植物不同贮藏条件下离体培养的花粉萌发率。萌发率（%）=（已萌发的花粉粒
7、数目/花粉粒总数）*100%贮藏贮藏温度温度总数总数1 1总数总数2 2总数总数3 3总数总数平均平均数数萌发萌发1 1萌发萌发2 2萌发萌发3 3萌发萌发平均平均数数萌发萌发率率常温-20桃的花粉萌发率的观察桃的花粉萌发率的观察1.碘碘- 碘化钾染色测定法碘化钾染色测定法 【原理原理】多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，多数植物正常的成熟花粉粒呈球形，积累较多的淀粉，I2-KI溶液可将其溶液可将其 染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不染成蓝色。发育不良的花粉常呈畸形，往往不含淀粉或积累淀粉较少，含淀粉或积累淀粉较少，I2-KI溶液染色呈黄褐色。因此，可用溶液染色呈黄褐色。因此
8、，可用I2-KI溶液染色来测定花粉活力。溶液染色来测定花粉活力。 （三）染色检测法（三）染色检测法【器材与用具器材与用具】 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。杯；量筒；天平。 【试剂试剂】 I2-KI溶液溶液【步骤步骤】 采集成熟花药，取一花药于载玻片上，加一滴蒸采集成熟花药，取一花药于载玻片上，加一滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放，再加12滴滴I2-KI溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。溶液，盖上盖玻片，在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐凡
9、是被染成蓝色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的花粉粒。观察色的为发育不良的花粉粒。观察23张片子，每片取张片子，每片取5个视野，个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的育性。2.氯化三苯基四氮唑（氯化三苯基四氮唑（TTC）法）法【原理原理】 具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的具有活力的花粉呼吸作用较强，其产生的NADH2或或NADPH2可将无色的可将无色的TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）还原成氯化三苯基四氮唑）还原成红色的红色的TTF（三苯基甲）而使其本身着色，无活力的花粉呼吸（三苯基甲）而使其本身着色，无活力的花粉呼吸
10、作用较弱，作用较弱，TTC的颜色变化不明显，故可根据花粉吸收的颜色变化不明显，故可根据花粉吸收TTC后后的颜色变化判断花粉的生活力。的颜色变化判断花粉的生活力。 【器材与用具器材与用具】 显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；恒温箱；棕显微镜；载玻片与盖玻片；镊子；恒温箱；棕色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。色试剂瓶；烧杯；量筒；天平。 【试剂试剂】 0.5%TTC溶液：称取溶液：称取0.5g TTC放入烧杯中，加入少放入烧杯中，加入少许许95%酒精使其溶解，然后用蒸馏水稀释至酒精使其溶解，然后用蒸馏水稀释至100ml。溶液避光。溶液避光保存，若发红时，则不能再用。保存，若发红时，则不能再用。 【方法】 采
11、集植物的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，采集植物的花粉，取少许放在干洁的载玻片上，加加12滴滴0.5%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，置溶液，搅匀后盖上盖玻片，置35恒温箱中，恒温箱中，1015min后镜检，凡被染为红色的花后镜检，凡被染为红色的花 粉活力强，淡红次之，粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。观察无色者为没有活力或不育花粉。观察23张片子，每片取张片子，每片取5个视个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。3.醋酸洋红法醋酸洋红法【原理原理】正常花粉呈圆球形正常花粉呈圆球形,物质积累较多物质积累较多,对醋酸
12、洋红的吸附作对醋酸洋红的吸附作用与亲和力强用与亲和力强,通常易被染成深红色通常易被染成深红色,发育不良的花粉常呈畸形发育不良的花粉常呈畸形,不积累物质或积累很少不积累物质或积累很少,用醋酸洋红染色呈淡红色或无色。用醋酸洋红染色呈淡红色或无色。【器材与用具器材与用具】显微镜、载玻片、镊子、滴瓶。显微镜、载玻片、镊子、滴瓶。【试剂试剂】1%醋酸洋红醋酸洋红:将洋红粉末将洋红粉末1g倒入倒入100mL45%醋酸溶液醋酸溶液中中,边煮边搅拌边煮边搅拌,煮沸煮沸(沸腾时间不超过沸腾时间不超过30s),冷却后过滤冷却后过滤,即可使用。即可使用。也可再加入也可再加入1%2%铁明矾水溶液铁明矾水溶液5-10滴
13、滴,至此液变为暗红色而至此液变为暗红色而不发生沉淀为止。不发生沉淀为止。 【方法方法】 (1)取少许花粉于载玻片上取少许花粉于载玻片上,加加12滴醋酸洋红溶液滴醋酸洋红溶液,盖盖上盖玻片上盖玻片; (2)将制片放在显微镜将制片放在显微镜(1610)下观察下观察35片片,每片选择每片选择35个视野个视野,以统计花粉的活力百分率。以统计花粉的活力百分率。1. 将培养基法和染色法两种方法测得的结果列表记将培养基法和染色法两种方法测得的结果列表记录，比较不同植物的花粉生活力。录，比较不同植物的花粉生活力。2. 比较不同检测方法的优缺点。比较不同检测方法的优缺点。四、结果与分析四、结果与分析u影响花粉萌发的因素有哪些？
