1、第三章第三章 分子克隆载体分子克隆载体 Molecular cloning vectors将外源DNA或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体载体应具备以下特点：1在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制3有一定的选择标记，用于筛选 其它：有一定的拷贝数，便于制备利用重组DNA技术分离目的基因，称之为基因克隆克隆动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。载体的类型：质粒plasmid 噬菌体phag
2、e 粘粒载体cosmid 噬菌粒phagemid由大量的含有基因DNA（即某一生物的全部DNA顺序）的不同DNA片段的克隆所构成的群体，称之为基因文库引自分子生物学，阎龙飞、张玉麟主编， 北京农业大学出版社，1993一 、质粒的基本特性第一节第一节 质粒载体质粒载体Plasmid vectors1概念 染色体外的遗传因子，能进行自我复制 （但依赖于宿主编码的酶和蛋白质） 大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线性 大小1kb200kb,也有更大质粒的表型: 抗生素的抗性、产生抗生素、降解复杂有机化合物 产生毒素（如大肠杆菌素，肠毒素），限制酶与修饰酶、固氮、杀虫等 复制子有不同的组成方式（滚环、
3、以及G+/G-） 在Ecoli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子其复制方式如下：RNAIIori-550600400Rop RNAIRNase H2质粒的复制 复制起始区: 通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区 合成RNAII即前引物，形成杂交体 RNaseH 切割RNAII 使之成熟，形成三叶草结构 RNAI 可控制RNAII形成二级结构 Rop增强RNAI的作用 拷贝数严谨型：拷贝数有限，大约1几个构驰型：拷贝数转多，几十至几百削弱RNAI和RNAII之间相互作用的突变，将含增加带有pMB1或(ColE1)复制子的拷贝数，
4、(突变位置位于rop基因或编码RNAI和RNAII的复制起点内)质粒复制子拷贝数pBR322pMB11520pUCpMB1500700pACYCp15A10212pSC101pSC1015ColE1ColE11520RNAI的起点上游1个核苷酸G变成了A，从而使得其转录起点改为下游3个核苷酸处(由于RNAI 5单链的完整对于RNA/RNAII间的相互作用至关重要因此，pUC质粒拷贝数的增加看来很可能是由于)缩短的RNAI与RNAII的结合效率降低所致pMB1质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依赖于DNA的RNA聚合
5、酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的产物, 因此，即使蛋白质合成并非正在进行，复制依然能够我行我素当存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有pMB1(或ColE1)复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚2-3千个质粒。3质粒的不相容性 两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，微小差异，最终放大。不相容群：指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子ColE1/pMB1现已发现30多个不相容群
6、，ColE1/pMB1 pSC101, p15A4转移性在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点如：F质粒pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白作用下，通过接合性质粒来进行转移。但大多数载体无nic/bom位点（pUC）1. 选择标记用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来二 、标记基因(1) 氨苄青霉素抗性基因AmpR ampr ampicillin青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合, 抑制转肽反应并抑制其活性AmpR编码一个酶，可分泌进入细菌的周质
7、区，并催化-内酰胺环水解，从而解除了氨苄青霉素的毒性青霉素是一类化合物的总称，其分子结构由侧链R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）两部分组成。在6-APA中有一个孢和的噻噬环（A）和一个-内酰胺环，6-APA由L-半脱氨酸和缬氨酸缩合成的二肽(2) 四环素抗性基因 tetr tetracycline与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位tetr基因编码一个由399aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。(3) 氯霉素抗性基因 chloramphenicol, Cmr or CatCm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成目前使用的Cmr来源于转导性P1噬菌体(也
8、携带 Tn9)cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基23kDa)，氯霉素乙酰转移酶，在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合该酶的表达对分解代射的产物敏感，若细菌利用除葡萄糖以外的碳源生长时，其表达量可增加到原来的5-10倍，在cAMP/ 分解代射的产物基因激活蛋白存在下，依赖于DNA的RNA聚合酶在体外与cat基因启动子结合的能力明显增强。(4) 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanamycin/neomycin可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶（APH(3)-II）所灭活，该酶为25kDa，
9、似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞内的主动转移。(5) Sup F 琥珀突变抑制基因终止密码：UAA(赭石), UAG(琥珀), UGA(乳白), supF编码细菌的抑制性tRNA在某一宿主中含具琥珀突变的tetr 和ampr，只有当含supF的质粒转入后，宿主才会对Amp和tet具抗性，supF在UAG上加入酪氨酸，supE加入谷氨酰氨 如 AN13 , 0.895kb(6) 其它 正向选择标记质粒可表达一种使某些宿主菌致死的基因产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活2. 筛选标记(1) -互补- complementation LacZ基因的互补-galactosi
10、dase 1024aaLacZLacZM15LacZ140个aa编码缺失第11-41位氨基酸140个aa + MCSIPTG:异丙基-D-硫代半乳糖苷 诱导物X- gal: 5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷 底物 (生色剂)-半乳糖苷酶分解x-gal 形成蓝色产物MCS : Multiple cloning sitesLacZM15LacZIPTG/x-galLacZM15LacZ蓝色蓝色LacZM15LacZ DNAIPTG/x-gal白色在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和头140个aa的编码信息，在这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在-半乳糖苷酶的
11、氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。laczM15 编码缺失第11-41位氨基酸的-半乳糖苷酶，但无酶学活性。当lacZ与laczM15的产生混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/(MSC)，并在受体菌中引入laczM15即可实现-互补。在生色底物（x-gal）存在下形成兰色菌落，而外源基因插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无-互补能力的氨基端片段。-互补lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补LacZM15 放在放在F质粒上质粒上, 随宿主传代随宿主传代LacZ 放在载体上放在载体上
12、, 作为筛选标记作为筛选标记(2) 插入失活相应的受体菌 TG1, XL1-Blue , JM101等 (lac-proAB)FproAB+ lacIq lacZ M15lacI: LacZ阻抑物的编码基因（lacIq突变使阻抑物产量增加）三、质粒载体的种类 pBR322之前pSC101,ColE1等, 大且酶切位点少 转化效率与大小成反比 15kb 转化效率成为限制因素 质粒越大，越难于用限制酶切因素进行鉴定 质粒越大，拷贝数就越低 pBR322以后，调整载体的结构，提高载体的效率 pBR322 pUC质粒去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标记 增加辅助功能/表达载体，穿梭载体1克隆载体用于
13、扩增or 保存DNA片段，最简单的载体 pBR3224361bp， 许多质粒载体由此发展而来，GenBank V01119, J01749 (4361bp)含有30多个单一位点，且Ampr和tetr可通过插入失活进行筛选ApApApAp+TcApApAp+TcApApAp+TcAp pUC18/192686bp 18: L08752 19:X02514来自pBR322其中LacZ(MSC)来自M13mp18/19 MSC (10个位点), -互补cloning: expression: 利用lacZ promotersequencing: Universal and Reserve prime
14、r 引物位置/引物序列 Multiple cloning sitesForwardUniversal primerReverse primer pUC118/119 118: UO7649 3162bp / 119: UO7650 3162bp 带有M13噬菌体DNA合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列，当含这些质粒的细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA的其中一条链，并包装子代噬菌体颗粒用途:分离ssDNA 测序，诱变，探针噬菌粒 体外转录 pGEM-3Z/4Z 3Z：X65304 4Z：X65305 2.74kb 综合性载体pTZ18/19/U/R pTZ18U
15、L37352(2860bp) 1994pTZ18R L08956 (2871bp) 1993pTZ19R Y14835 (2862bp) 1997 L08957 (2870bp) 1994pTZ19U Y14836(2862bp) 1997 L37382 (2863bp) 1994pGEM-3Zf 3197bppGEM-3Zf(-) X65307 pGEM-3Zf(+)X65306 Bluescript M13 (2958bp)SK(-) X52324 / SK(+) X52325KS(-) X52326 / KS(+) X52331(2961bp)II SK(+) X52328 / II S
16、K(-) X52330II KS(+) X52327 / II KS(-) X52329e.g pBluescript II KS(+) 载体应具备以下特点：1在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）2必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制3有一定的选择标记，用于筛选4其它：有一定的拷贝数，便于制备附加因素: MSC, LacZ(-互补), ssDNA phage origin, Promoters2. 表达载体p35s-GFP(U 28417, 4518bp)等第二节 phage vectors1.最早使用的克隆载体 并对其遗传学和生理学作了深入研究2.为利用该载
17、体必须熟知其分子生物学，了解载体的设计和组建的原则一、噬菌体的分子生物学48502 bp GenBank J02459 or M172335strand overhangs the 3 strand by 12 basesGGGCGGCGACCT / HindIII(7 个切点)23.1 (kb) 9.4 6.6 4.4 2.3 2.0 564 (bp) 125 48502bp（一）发育调节1. 吸附 37正常，室温无噬斑2早期转录立即早期、延迟早期裂解溶原 噬菌体生活史简图噬菌体生活史简图GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGA DNAPhage particlelysisDNA r
18、eplicationLate controlPhage particlelysisDNA replicationLate controlPhage particlelysisDNA replicationIntegration/excisionreconbinationLate controlPhage particlelysisDNA replicationControlregionIntegration/excisionreconbinationLate control2早期转录立即早期、延迟早期N：正调节子使PL和RR继续转录(中和-因子的活性)Cro：抑制PL和PR，使积累的Q蛋白引导
19、晚期转录cII：引导cI表达（PE）cIII：引导int表达（PI）cI：全面抑制并阻断表达 ( 与QR和OL结合)Cro/cII的优势，引入不同途径 宿主/基因产物的错综复杂的平衡正常情况下：Cro/cII各自起作用的机会大致相当，并受外部条件的影响在延迟早期结束时，下一步生长所需的蛋白才会表达出来，不可逆地朝裂解循环或溶原循环方向发展Wild type E. coli ，向溶原和裂解的转变由感染复数(multiplicity of infection) 细胞的营养状态决定的感染复数越高，营养状态越差溶原化(lysogenization)的频率就越高溶原现象的生化媒介可能是 3-5cAMP,
20、细胞内的浓度会随营养条件的变化而改变当细胞富营养培养基中生长是，cAMP的浓度较低，有利于裂解生长在缺乏cAMP的突变细胞中，更有利于裂解生长由于不知道哪个噬菌体的启动子受cAMP的调节，因此溶原和裂解的选择部分受到细菌基因或调节cAMP的基因3进入裂解周期通过复制，大约合成50个噬菌体基因组单体，然后进入滚环复制。通过复制，产生基因组DNA的多联体(concatemer)，最后被切割并被包装到噬菌体颗粒中 recB/recC/ recD 产物, 外切核酸酶V 抑制DNA 复制向滚环复制转变 gam可与外切核酸酶V结合,使之失活 Nul 和 A 蛋白与cosL/cosR结合 在FI蛋白下DNA
21、被缠入前头中 A基因产物的ter功能在cos R/cos L切割 S, R, Rz基因产物, 为裂解必须Sam7该突变可防止或延迟裂解 噬菌体噬菌体的包装的包装4溶原化 只有cI, 及rexA rexB rexC表达cI：236aa cI，cII，cIII发生突变不能溶原化cIts857：对热不稳定的温度敏感突变45失活诱导因素：如DNA损伤剂（UV）则RecA降解cI 转导噬菌体的形成转导噬菌体的形成 转导噬菌体的形成转导噬菌体的形成 转导噬菌体的形成转导噬菌体的形成正常正常 切离切离 转导噬菌体的形成转导噬菌体的形成不正常切离不正常切离 转导噬菌体的形成转导噬菌体的形成 转导噬菌体的形成转
22、导噬菌体的形成 d dgal（二）的可取代区1. 区域溶源化的正确切离正常不正确切离不正常 gal替换 or bio替换J基因与Cro基因之间的丢失 不影响裂解生长（约1/3）2. 大小60%区域为必须 20kb (AJ ) 8-10kb 78105% 包装范围37.83150.927 可插入9-23kb二、噬菌体的选择标记1. 大小2. LacZ基因 在填充片段中带有-半乳糖苷酶基因片段3. cI失活见gt104Spi筛选Spi+： 不能感染 E.coli(P2)Spi-：(red- gam-)能感染E.coli (P2) 形成小噬斑 host recA+ chi位点 包装时若gam-，需r
23、ecA产物的作用才可形成噬斑(但为小噬斑),所以对宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重组：载体改为red-/gam+可在recA-受体菌中增殖。Charon 32-35, 40red- gam-时，若外源插入片段含chi位点(8bp),则形成清亮噬斑，否则形成小噬斑，由于chi位点的未知性，因此重组体可形成大小不等的噬斑为避免此问题则在载体中加入chi位点,如2001, DASH, F1X,EMBL系列三、代表性噬菌体载体插入型载体 insertion vectors置换型载体 replacement vectors噬菌体载体主要用于构建基因文库，特别是cDNA文库。（一）插入型
24、载体1gt10载体 43340bp 插入大小 设计为6kb，理论7.6kbatt及其左侧缺失(b527)，以及N基因至 cII基因之间的突变只在相当于 cI基因内有一个 EcoRI位点。用于克隆小的(6kb)cDNA而设计，外源DNA量有限时较好，克隆效率高宿主菌：C600(BNN93)增殖载体 supE hsdR(rk-) C600 hflA (BNN102)筛选重组体cI- 在hflA(高频溶源化)中形成噬斑cI+ 在hflA中形成溶源，产生混浊噬斑， cI+ 的生长受到宿主的抑制50100倍2gt11 插入型 插入大小：07.2kb 在最左侧替代区置换一段lac5基因，其编码区终止密码子
25、之前有一个EcoRI位点（53bp上游）筛选：在lac-宿主菌中，非重组噬菌斑为兰色(IPTG) 用途：构建cDNA文库，基因组文库，表达融合蛋白表达：表达融合蛋白，外源DNA片段有可能与lacZ的阅读框相吻合，可用免疫学方法筛选Sam100: supF突变,防止细菌裂解cI：温敏突变 用来控制噬菌体的复制和融合蛋白的表达宿主：Y1090(hsdR) lon蛋白酶阴性 supF lac-, 可用于抗体或核酸探针筛选 增殖载体， supF抑制Sam100 Y1089(hsdR) 具有高频溶源特性 lon蛋白酶阴性， 表达外源蛋白3. GEM-2/4GEM-2: 43.80kb (07.1kb)G
26、EM-4: 46.2kb (04.7kb)同gt10 ,在cI位点有差异,由EcoRI改位多克隆位点SpeI XbaI SacI EcoRI SpeISP6 T7SpeI XbaI SacI EcoRI SpeISP6 AmpR T7pGEM-14: ZAP II与gt11 相似, 插入pBluescript M13 质粒41kb, 0-10kb Infected by helper phage I-T region will be packaged as a filamentous phage pBluescript plasmids are recovered by infecting a
27、n F strain (AmpR)单个噬菌体或扩增的文库与丝状常助噬菌体共感染E.coli在细胞内，帮助噬菌体中的蛋白(基因II蛋白)识别f1噬菌体正链合成起始(I)和终止(T)信号，并在相应位置处切割，在help phage的作用下，切割下来的片段会环化，被包装、分泌至细胞外；再感染F菌株，在AmpR下可获得相应重组质粒。Help phage：M13， ExAssist help phage5. Excell 45.5kb在E.coli NP66中于attL和attR之间发生同源重组，产生质粒pExCell (4190bp)外源DNA插入的大小 6kb 用于cDNA克隆coscosAttL
28、AttRpExCell ExCell 载体释放载体释放出质粒的原理图出质粒的原理图了解ZAP11和ExCell目的在于了解有关的构建原理进一步领会如何利用生物的基本特征来构建载体，即对生物的或DNA的某一特征加以利用，为以后的工作提供一种思维方法（二）置换型载体coscosRLCentral stuffer杂合片段: 含DNA和其它DNA外源，来自E.coli 或动物Vector L arm stuffer R arm insertCharon 4A 19.5kb EcoRI/14.7kb 11kb 720kb lac5 XbaI/作插入型 06kbE X E Elac5Vector L ar
29、m stuffer R arm insertCharon32 19.5kb EcoRI/12.5kb 11.9 8-19kb 小鼠DNA内有4个 EcoRI位点 20kb HindIII置换 13.3 518kb 27kb SacI插入 16.8kb 010kbE E E E E E H3 Sac H3EMBL 3/4 L 20kb R 9kb 9-23kb Spi筛选 promega 19.9kb 8.8kb 7-20kb Mol CloningSalI BamHI EcoRIEcoRI BamHI SalI14kbCharon 40 stuffer containing 235bp rep
30、eats 约80copy (lac操纵基因+腺病毒DNA) 内含XmaIII/XmaIII/NaeI 左右各16个位点(MCS)用于切开stuffer insert: 9.224.2kbMCSMCS(XmaIII/XmaIII/NaeI)80DASH 9-22kb chi+利于染色体步查Xba Sal E B H Sac Xho XbaT3T7结构同EMBL 3GEM-11 9-23kb chi+ (同EMBL/3/4臂)四、克隆原理及步骤 结合包装过程1通过裂解过程增殖载体 回收、纯化载体2酶切、载体与外源DNA3连接4包装 5感染/铺平板6筛选包装感染铺平板筛选阳性克隆基因文库(Lambd
31、a) 9-23kbSau3A1BamHI连接N=ln(1-p)/ln(1-f)P: 文库中出现阳性克隆的期望值F: 插入片段占总DNA的比值哺乳动物 3x10917kb 99% N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105 载体与外源片段的连接去磷酸化回收载体臂部分补平酶切方式（双酶切，重复片段）一、粘粒的结构特征1粘粒实际是质粒的衍生物，带有将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列(cos序列)2组成：质粒复制起点（colE1）,抗性标记ampr cos位点，能象质粒一样转化, 增殖3大小：一般5kb左右，可克隆3847kb片段 包括（3852kb）第
32、三节第三节 粘粒载体 cosmidN=ln(1-p)/ln(1-f)P: 文库中出现阳性克隆的期望值F: 插入片段占总DNA的比值哺乳动物 3x10917kb 99% N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105 二、克隆原理及步骤1分离外源DNA片段3545kb2外源DNA与两个粘粒相连，且cos方向相同3体外包装 在的A蛋白的ter功能作用下切割cos位点并将其中的DNA包装到成熟的噬菌体颗粒中去4感染E.coli：线状的重组DNA被注入细胞并通过cos位点的环化，而形成粘粒载体，象质粒一样复制三、用途1在构建基因文库中，减少文库中重组体的数目2在单个
33、重组体中克隆和增殖完整的（较大的）真核基因 鸡前2胶原、鼠三氢叶酸还原酶（DHFR）至少40kb 载体最大24kb，质粒载体虽可携带大片段，但转化率低。3克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段如哺乳动物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有数十万个bp（几百kb）在“步查”过程中，粘粒具有优势，是文库的两倍，粘粒可克隆45kb染色体步查：chromosome walking采用一段分离自某一重组体一端的非重复DNA片段作为探针以鉴定含有相邻序列的重组克隆。Sau3A1四、粘粒克隆载体1pJB8 简单粘粒组成: amp ori cos 4个位点5.4kb 可容纳33-46.5kb外
34、源DNA片段 对载体进行去磷酸化理，否则易形成多联载体 定向克隆包装感染铺平板筛选阳性克隆基因文库(E.coli)33-46kbSau3A1连接BamHI酶切CIP去磷酸mcsCOS2 c2RB6.8kb 含两个cos位点 ampr kamr ori ColE1 4个E位点3545kb3545kb (MobI/经CIP处理)一般高浓度ATP存在下（5mmol/L）抑制平端连接，但对粘端没有影响包装 感染 筛选3pCOS1 EMBL用于筛选体内重组的重组粘粒文库 构建文库 在recA-中增殖（体内包装） 用颗粒感染recA+E.coli（pUC18探针） 发生重组 再次包装 再次感染，但recA
35、- E.coli(ampr, kamr)Ori/R6KOri/ColE1Amp probe4卡隆粒9载体系列为克隆33kb以下片段而设计SalI cos MCS amp ori pBR重复单元 SalI9个位点 AvaI (2047bp)n AvaI在recA-稳定,可用于增殖 1-23个串联重复pBR322中2kb片段（含tet）MCS: 9个酶切位点在recA+ E.coli 中可发生重排用于克隆33kb-2kb，如克隆经Southern杂交确定的特定基因组DNA片段.*：重复单元中含SalI位点，载体中也有一个SalI，当用SalI消化时可将绝大多数重复片段去掉前提：外源DNA不含Sal
36、I,由于SalI识别GTCGAC，但哺乳动物DNA CG序列较少，100kb才能有一个SalI位点MluI: ACGCGT哺乳动物中平均500kb一次PvuI: CGATCG 300kb一次用于制作限制性酶切图谱 如 先MluI消化, 再用不切割重复片段的酶部分切割5pWE15五、文库的扩增和贮存1. 滤膜影印 25%甘油 TB平板, -70 C 2. 混菌保存 混合单菌落, 15%甘油, -70 C 3. 体内包装 重组缺陷超感染, 重新包装重组cosmid, 收集裂解混合物, 在含少量氯仿 SM(0.3%)溶液中, 4C可贮存几年, 或含7%二甲基亚砜(DMSO) -70 C长期保存生长平
37、衡问题六、常见问题自我连接、多个外源插入等问题已解决但仍不足以作为常规克隆，不如phage1基因组DNA质量，开始超过200kb2酶解受到抑制，须梯度离心3无外源DNA，单个cos 5%空，双cos低得多 charomid 高 20%4重组质粒拷贝数差异大5尽管文库似乎全面，但也许不能获得目的克隆，限制酶位点的非随机分布，污染限制酶，重组缺失,扩增时目的克隆可能被淘汰。第四节第四节 单链丝状噬菌体载体包括M13 ,f1, fdM13为 6.4kb (6407 base), ssDNA组织形式相同，颗粒大小，形状相近, DNA同源高，98%差异位于第三密码子, 互补活跃，彼此间易重组视为等同一、
38、M13的生物学1结构 6407bp 90% 编码蛋白 11个编码基因 间隔区小 大间隔区位于VIII/III 和 II/IV，其间有表 达调控元件6-7nmx880nmIG：intergenic region, or IR 非编码区，但不是非必需区，508bp含：对包装及DNA在病毒颗粒中的定向 进行调控的顺式作用信号，正链与负链DNA合成起始和终止位点，以及不依赖于因子的转录终止信号IG：非编码区，但不是非必需区，508bp含：对包装及DNA在病毒颗粒中的定向 进行调控的顺式作用信号，正链与负链DNA合成起始和终止位点，以及不依赖于因子的转录终止信号Gene VIII：颗粒主要结构蛋白，27
39、00个形态亚基，管状排列Gene III：次要蛋白，位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐基因组DNA为正链，按IIIV方向合成2增殖 吸附/入侵/F菌株的性纤毛 DNA及基因III产物进入菌体 形成 RF DNA ssDNA在胞内酶作用下变成dsDNA, 即 RF DNA replicative form 复制型DNA 转录/复制 从任一个启动子转录， 终止于终止子，靠近终止子的基因转录频繁滚环复制 产生基因组ssDNA 基因II产物在正链上产生切口滚环复制完成一周由基因II产物切割环化形成单位长度的基因组DNA感染的头15-20分钟：(+)ssDNARFDNA连续滚环复制 分泌/包装当RFDN
40、A达到100-200个/cell时，基因V产物（单链结合蛋白）与（+）ssDNA结合，阻止其变成RFDNA, 并抑制GeneII RNA的翻译geneV/(+)ssDNA 复合物移至胞膜，基因V产物脱落， (+)ssDNA溢出时被衣壳蛋白所包被由于病毒基因组并不需要插进一个预先形成的结构之中，对被包装的ssDNA的大小并无严格限制，相反，其长度却随DNA的量而变化，曾发现含多个基因组的颗粒，也曾克隆过长6倍的外源片段宿主不裂解，生长可继续，但速率小1/23/4每个细胞产生数百个颗粒1012pfu/ml plaque forming unit二、M13噬菌体载体1插入区域由于绝大多数为必需基因，
41、只有两个间隔区可用来插入外源DNA，II/IV和VIII/III之间，前者使用较多，但外源DNA插入后，会严重影响噬菌体基因组的复制由于获得了一些突变体，使之部分补偿这种被灭活的负责复制调控的顺式作用要素的功能2M13mp 载体系列插入一段lac DNA片段，即带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个aa编码信息，宿主F因子携带缺失第11-41位氨基酸的lacZ-互补：缺失lacz操纵基因近邻区段的突变体与-半乳糖苷酸阴性但操纵基因近邻区完整的突变体之间的互补作用。早期为M13mp1，其后导入多克隆位点,不影响-互补，形成系列载体。差异在多克隆位点上(其数值为最佳估计值)3
42、.宿主菌laczM15 (lac-proAB), lacIq,proAB, hsdR17/hsdR4, 失去I类限制作用，但保留修饰recA1(重组缺陷):保持质粒单体不形成多分子环M13载体不会重组丢失片段supE (抑制基因, 为谷氨酰胺UAG)traD36 抑制F转移已不再要求, 但沿用至今JM101: supE (lac-proAB)FtraD36 proAB+ lacIq lacZM15JM105 JM101/hsdR4JM107 JM101/hsdR17JM109 JM101/hsdR17 recA1TG1 JM101/hsd5 (不修饰不限制)XL1-Blue supE lac-
43、 hsdR17recA1 F proFAB+ lacIq lacZM15 Tn10(tetr)保证F存在的方法4用途有时不稳定，不作为常规克隆载体和增殖，主要用于制备单链DNA 用于双脱氧链终止法测序 寡核苷酸定点诱变 ssDNA 探针5经常遇到的问题 外源DNA区段的部分缺失大缺失多，避免连续生长可最大减少重组从-70原种（感染宿主）铺平板挑取单斑中央细菌小规模培养小规模培养已足够获得ssDNA or RFDNA, 不宜再作种子 单方向插入可改用噬菌粒三、噬菌粒 phagemid带有丝状噬菌体复制起点的质粒 DNA合成的起始，终止，形态发生含phagemid的细菌被M13(或 f1)感染后，
44、基因II蛋白作用于间隔区，启动滚环复制ssDNA包装pUC118/119 pBluescript pGEM-3Zf()pTZ18U/R 19U/RHelp phage dsDNA 稳定，高产,具有质粒的特征 免却亚克隆至M13 得到10kb ssDNA缺点：ssDNA产量低, 重复性差 M13mp1012 pfu 510g/ml phagemid 1/1001/10影响产量的因素 携带的IG的确切序列（干扰helper复制） 在plasmid 中的位置（干扰helper复制） helper phage的性质 外源DNA大小pUC118/119 M13KO7 1-5 x 1011 pfu 四、M
45、13KO7（8.7kb） M13的衍生株 突变的geneII (间隔区的插入对复制影响不大) 质粒复制起点（p15A） Kanr(Tn903) IG突变M13KO7 感染E.coli 质粒复制,产生phage 蛋白 突变的geneII蛋白可作用于M13KO7的突变IG 产生ssDNA,产生phage M13KO7 感染E.coli(pUC118) 质粒复制,产生phage 蛋白 突变的geneII蛋白优先作用于pUC118的IG 产生pUC118的ssDNA,产生phage(pUC118)M13KO7E.coli(pUC118)ssDNA变成RF DNA按质粒方式复制并产生所有蛋白（phage
46、mid不干扰M13KO7的早期复制）geneII产物优先结合于phagemid上的复制起点优先合成phagemid (+)ssDNA(强50倍)第五节 人工染色体载体一、酵母人工染色体载体 yeast artificial chromosome 酵母的生物学特征Saccharomyces cerevisiae 酿洒酵母 扁圆形和卵形 3m 代时90min 16条染色体 300-2000kb 14106bp 14Mb具真核mRNA的加工活性TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4BamHIBamHISmaIHis3 TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4 Sup4 UR
47、A3 TELBamHISmaIURA3 TELSmaI原生质体和电转化URA3/trp ade2-1赭石突变株红色菌落插入失活BamHI缺点:基因组DNA与YAC臂体外连接过程中 产生嵌合体 通过共转化导入同一个酵母原生质体的 不同YAC克隆的有丝分裂重组也会产生 嵌合体 染色体DNA操作困难 Tra region 21 genesori ori par A, parBF质粒 : Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952）， 大肠杆菌接合交配期染色体标记的单向转移。 约100kb, 编码60多种参与复制、分 配和接合过程的蛋白质。 可以整合到宿主染色体中，在大肠杆菌 染色
48、体中有30多个位点进行随机整合。 二、BAC载体 bacterial artificial chromosome 自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆 菌染色体而不显张力或不稳定。 拷贝数低: 1 有助于减少DNA 分子间重组 保证文库转化子生长平衡 减小对受体菌的毒副作用为什么会想到把F质粒改造成载体？7507bpU5113Ori S, repE 介导单向复制parA, parB 维持低拷贝cosN 来自 phage , 可被 phage 的terminase 特异切割LoxP, 类似 phage 的cosN 来自P1 phage, 其Cre 蛋白特异性切割该 位点 pBeloBAC11克隆
49、的片段大小 10-215kb, 平均100kb, 少量大于300kb电转化: 106/ug DNA, 10-100倍高于原生质体转化可用于传统的菌落杂交重组DNA为 ccc质粒, 而不是线性可用PFGE检测DNA大小低频co-cloning实例 嗜碱菌“12-1” （Bacillus sp.） 文库法克隆嗜碱性相关的基因或基因簇载体：pBeloBAC11受体菌：E.coli DH10B阳性克隆子筛选标准：耐碱1.外源片段的制备PFGE pulse field gel electrophoresis150kb总DNA HindIII不完全酶切大，均，纯electroelute2.载体的制备Hin
50、dIII完全酶切，CIAP去磷酸化3. 连接载体与外源之比约 10：1 避免嵌合克隆的形成常规连接：外源：载体=3：14.转化（电转化electroporation） 感受态细胞的制备：离子 转化：12.5kv/cm 25uF 200 转化子的挑取：LB+Cm x-gal+IPTG5.转化子验证N=ln(1-p)/ln(1-f)P: 文库中出现阳性克隆的期望值F: 插入片段占总DNA的比值 细菌基因组：25 Mb 插入片段平均大小：150kbN=ln(1-0.99)/ln(1-1.5x105/5x106)=150若：N=576 p=99.99999% v=（150 x103 x 576）/（5
