1、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理和实验和实验.n我们都知道理论上我们都知道理论上PCRPCR是一个指数增长的过程，但是实际的是一个指数增长的过程，但是实际的PCRPCR扩增曲线扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是并不是标准的指数曲线，而是S S形曲线。这是因为随着形曲线。这是因为随着PCRPCR循环的增多，循环的增多，扩增规模迅速增大，扩增规模迅速增大，TaqTaq酶、酶、dNTPdNTP、引物，甚至、引物，甚至DNADNA模板等各种模板等各种PCRPCR要素要素逐渐不敷需求，逐渐不敷需求，PCRPCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减
2、缓。当所有的所有的TaqTaq酶都被饱和以后，酶都被饱和以后，PCRPCR就进入了平台期。由于各种环境因素的就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的复杂相互作用，不同的PCRPCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致一致, ,最后得到的最后得到的DNADNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大。拷贝数也是完全不一样的，波动很大。为什么终点定量不准确？为什么终点定量不准确？ .为什么不选普通为什么不选普通PCR?PCR?
3、n对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等测等, ,需要测定的都是需要测定的都是PCRPCR放大之前标本中的放大之前标本中的DNADNA原始拷原始拷贝数贝数, ,经过经过PCRPCR扩增以后的扩增以后的DNADNA拷贝数已经不能反映真实拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据据CTCT值确定值确定DNADNA起始拷贝的数量。起始拷贝的数量。n传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，记后的光密度
4、扫描等，测定的都是测定的都是PCRPCR的终产物的终产物，而不，而不是起始是起始DNADNA拷贝数。由于拷贝数。由于PCRPCR的终产物量与起始模板量的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的之间没有线性关系，所以根据最终的PCRPCR产物量不能计产物量不能计算出起始算出起始DNADNA拷贝数拷贝数。 .荧光定量荧光定量PCRPCR的优势的优势n在实时荧光定量在实时荧光定量 PCR PCR 反应中，引入了一种荧光化学物反应中，引入了一种荧光化学物质质, ,随着随着 PCR PCR 反应的进行，反应的进行，PCR PCR 反应产物不断累计，反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
5、每经过一个循环，收集荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。n该技术借助于荧光信号来检测该技术借助于荧光信号来检测PCRPCR产物，一方面提高了产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到灵敏度，另一方面还可以做到PCRPCR每循环一次就收集一每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CTCT值，从而值，从而根据根据CTCT值确定起始值确定起始DNADNA
6、拷贝数，做到了真正意义上的拷贝数，做到了真正意义上的DNADNA定量。定量。.CTCT值与模板值与模板DNADNA的关系的关系n一般地，我们有一般地，我们有Rn=RB+XRn=RB+XO O(1+EX)nRS,(1+EX)nRS,也就是说第也就是说第n n次次PCRPCR循环时的荧光循环时的荧光信号强度信号强度(Rn)(Rn)等于背景信号强度等于背景信号强度(RB)(RB)加上每个分子的荧光强度加上每个分子的荧光强度( (即单即单位荧光强度，位荧光强度，RS)RS)与分子数目的乘积。当循环次数与分子数目的乘积。当循环次数n = CTn = CT时，则有时，则有RT=RB+XRT=RB+XO O
7、(1+EX)CTRS(1+EX)CTRS。两边取对数，得。两边取对数，得log(RT -RB) = logXlog(RT -RB) = logX0 0 + + CTlog(1+ Ex) + logRsCTlog(1+ Ex) + logRs。整理此式，。整理此式，CTlog(1+ Ex) = - logXCTlog(1+ Ex) = - logX0 0 + + log(RT -RB)logRslog(RT -RB)logRs。 Ct=-klgX0 +b.CTCT值的确定值的确定基线基线: :在在PCRPCR的最初几个循环中，荧光信号是几乎不变的，这确定了扩增图中的基的最初几个循环中，荧光信号是
8、几乎不变的，这确定了扩增图中的基线。基线范围的定义是从第线。基线范围的定义是从第3 3个循环起到个循环起到CTCT值前值前3 3个循环止，一般取第个循环止，一般取第3 3到第到第1515个个循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。循环之间。在这些初始的循环中，我们看到的其实是反应的荧光背景。 RnRn（Normalized reporterNormalized reporter）: :是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。发射强度的比值。 Rn:Rn:是是RnRn扣除基线后得到的标准化结果（扣除基线后得到的
9、标准化结果（Rn = Rn Rn = Rn 基线）。基线）。 阈值阈值: 用于确定实时定量分析中的用于确定实时定量分析中的CTCT值的某个值的某个RnRn水平。一般将水平。一般将PCRPCR反应前反应前1515个循个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15PCR3-15个循环荧光信号标准差的个循环荧光信号标准差的1010倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。倍，这个水平设定得比基线高，又在扩增曲线的指数增长区域内足够低。 阈值循环（阈值循环（CTCT）：）：荧光穿过阈值时的循环数荧光穿过阈值时的循环数, ,即阈值
10、与扩增曲线的交叉点。即阈值与扩增曲线的交叉点。 .显然，显然，CTCT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CTCT值是一个完全客观的参数。值是一个完全客观的参数。CTCT值越小，模板值越小，模板DNADNA的起始拷贝数越的起始拷贝数越多；多；CTCT值越大，模板值越大，模板DNADNA的起始拷贝数越少。正常的的起始拷贝数越少。正常的CTCT值范围在值范围在18-18-3030之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 .实验方案的设计实验方案的设计n根据最终得到的数据不同，定量根据最终得到
11、的数据不同，定量PCRPCR可以分为相对定量和可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。贝数或浓度。n根据所使用的技术不同，荧光定量根据所使用的技术不同，荧光定量PCRPCR又可以分为又可以分为TaqManTaqMan探针和探针和SYBR Green ISYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针荧
12、光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 . TaqManTaqMan探针技术原理探针技术原理 TaqManTaqMan探针法是高度特异的定量探针法是高度特异的定量PCRPCR技术，其核心是利用技术，其核心是利用TaqTaq酶的酶的3535外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于
13、探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。强弱就代表了模板的数量。在在TaqManTaqMan探针法的定量探针法的定量PCRPCR反应体系中，包括一对反应体系中，包括一对PCRPCR引物和一条探针。探针只与模引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的55端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R)(Reporter, R)，如，如FAMFAM、VICVIC等，等，33端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)(
14、Quencher, Q)，如，如TAMRATAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着测不到信号。随着PCRPCR的进行，的进行，TaqTaq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3535外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCRPCR循环，荧光信号也和目的片段一样，循环
15、，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNADNA的拷贝数。的拷贝数。 .nTaqManTaqMan探针根据其探针根据其33端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的的TaqManTaqMan探针和探针和TaqMan MGBTaqMan MGB探针。探针。MGBMGB探针的淬灭基团采用非荧光淬探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团灭基团(Non-Fluorescent Quencher)(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降，本身不产
16、生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)MGB (Minor Groove Binder)修饰基团可以将探针的修饰基团可以将探针的TmTm值提高值提高1010C C左右。因此为了获得同样的左右。因此为了获得同样的TmTm值，值，MGBMGB探针可以比普通探针可以比普通TaqManTaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNADNA碱基组成不理碱基组成不理想的情况下，短的
17、探针比长的更容易设计。实验证明，想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGBTaqMan MGB探探针对于富含针对于富含A/TA/T的模板可以区分得更为理想。的模板可以区分得更为理想。 TaqMan MGBTaqMan MGB探针探针.SYBR Green ISYBR Green I荧光染料技术原理荧光染料技术原理nSYBR Green ISYBR Green I荧光染料技术原理荧光染料技术原理SYBR Green SYBR Green I I是一种只与是一种只与DNADNA双链结合的荧光染料（图双链结合的荧光染料（图6 6）。）。当它与当它与DNADNA双链结合时，发
18、出荧光；从双链结合时，发出荧光；从DNADNA双链双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链一个体系内，其信号强度代表了双链DNADNA分子分子的数量。的数量。SYBR GreenSYBR Green荧光染料法定量荧光染料法定量PCRPCR的基本过程是：的基本过程是：1 1、开始反应，当、开始反应，当SYBR SYBR GreenGreen染料与染料与DNADNA双链结合时发出荧光。双链结合时发出荧光。2 2、DNADNA变性时，变性时，SYBR GreenSYBR Green染料释染料释放出来，荧光急剧减少。放出来，荧
19、光急剧减少。3 3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCRPCR产物。产物。4 4、聚合完成后，、聚合完成后，SYBR GreenSYBR Green染料与双链产物结合，定量染料与双链产物结合，定量PCRPCR系统检测到荧系统检测到荧光的净增量加大。光的净增量加大。 .数据的校正数据的校正n定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，实验和设立内对照非常重要。由于各
20、种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量然，与定性实验一样，定量PCRPCR也要设立阴性和阳性对照，也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 .重复实验和阴性对照重复实验和阴性对照 定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数定量实验，误差是不可避免的。设立重复实验，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量据进行统计处理，可以将误差降低到最小。所以定量实验的每个样本至少要重复实验的每个样本至少要重复3 3次以上，严格的定量
21、更次以上，严格的定量更应当重复应当重复6 68 8次，以满足小样本统计的要求。次，以满足小样本统计的要求。 阴性对照中不加模板阴性对照中不加模板DNADNA，而以水或缓冲液代替，用，而以水或缓冲液代替，用于检验是否存在于检验是否存在PCRPCR污染。污染。.实时荧光定量实时荧光定量 RTPCRRTPCR内参基因的选择内参基因的选择 由于内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒由于内参基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含定的，受环境因素影响较小，其定量结果代表了样本中所含细胞或基因组的数量。内参基因扩增中的变化可以反映细胞或基因
22、组的数量。内参基因扩增中的变化可以反映RNARNA产产量、质量和或量、质量和或cDNAcDNA合成效率的变化。选择适当的内参基因合成效率的变化。选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因一般选用以减少检测标本间的差异是必须的。内参基因一般选用b-b-actinactin、GAPDHGAPDH、rRNArRNA基因等管家基因。基因等管家基因。核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效核酸提取时通常以重量或体积为单位取样，再加上提取效率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞率和操作误差，造成等量提取物不一定来源于等量细胞（或基因组）。将定量结果校正为以细胞（或基因组
23、）为（或基因组）。将定量结果校正为以细胞（或基因组）为单位，不同样品之间才具有可比性。单位，不同样品之间才具有可比性。.n20032003年年1010月：乔布斯被检查出胰月：乔布斯被检查出胰腺癌。腺癌。n20042004年，乔布斯接受了肿瘤切除年，乔布斯接受了肿瘤切除手术。手术。实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR实验实验CTCT法法苹果前苹果前CEOCEO史蒂夫史蒂夫乔布斯逝世。让我乔布斯逝世。让我们一起悼念这位们一起悼念这位“改变世界的天才改变世界的天才”！.用什么方法来检测用什么方法来检测?药物对肿瘤细胞的影响药物对肿瘤细胞的影响: :检测相关基因检测相关基因的表达是否发生了变化的表达是
24、否发生了变化(EGR3(EGR3、 MAOBMAOB、 OGDHOGDH、OSGEPOSGEP、 SERPING1SERPING1） . RNA cDNA RNA cDNA 扩增产物扩增产物细胞裂解细胞裂解 逆转录反应逆转录反应 定量定量PCRPCR反应反应untreatedtreated RNA cDNA RNA cDNA 扩增产物扩增产物细胞裂解细胞裂解 逆转录反应逆转录反应 定量定量PCRPCR反应反应基因表达基因表达(gene expression)(gene expression)是指细胞在生命过程中，是指细胞在生命过程中，把储存在把储存在DNADNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转
25、变顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子成具有生物活性的蛋白质分子Gene RNA Gene RNA 蛋白质蛋白质 转录转录 翻译翻译(cDNA)(cDNA)对扩增产物进行定量，扩增产物的变化体现了对扩增产物进行定量，扩增产物的变化体现了RNARNA的变化的变化逆转录逆转录.实验方案的设计实验方案的设计定量定量PCRPCR绝对定量绝对定量相对定量相对定量相对标准曲线相对标准曲线CTCT.CTCT实验的设计实验的设计目的基因、内参基因、目的基因、内参基因、参照样本、重复反应孔参照样本、重复反应孔 CTCT实验的设计实验的设计选择选择PCRPCR方法方法选择化学方法：选择化学
26、方法：选择选择RTRT方法方法选择探针和引物选择探针和引物TaqMan TaqMan 或或 SYBR Green I dyeSYBR Green I dye指明指明CTCT实验中组成部分实验中组成部分: :.Design the Comparative CT ExperimentPrepare the Reactions. Prepare the reaction plate.Analyze the Comparative CT Experiment . Run the ExperimentPrepare the templatePrepare the sample dilutionsPrep
27、are the reaction mix for each target assayPrepare for the runEnable the notification settingsStart the runMonitor the runUnload the instrumentView the Gene Expression Plot and WellView the AmplificationPublish the Data the Comparative CT Experiment workflow .RTRT反应的操作反应的操作RTRT反应反应提取提取RNARNA将提取的总将提取的
28、总RNARNA转化为转化为cDNA:cDNA:反转录试剂盒反转录试剂盒试剂盒提取试剂盒提取RNARNARNARNA的浓度的浓度: A260/ A280: A260/ A280在在1.9 1.9 左右左右总总RNARNA的质量的质量RNARNA的完整性的完整性: :琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳总总RNARNA初始浓度的调节初始浓度的调节:50 ng/L.:50 ng/L.0h 12h 24h 48h0h 12h 24h 48hRNA RNA RNA RNARNA RNA RNA RNA. Component L/Reaction L/21 Reactionsa 10 Reverse Transc
29、ription Buffer 10 21025 dNTPs 4 84 10 random primers 10 210MultiScribe Reverse Transcriptase, 50 U/L 5 105Nuclease-free water 21 441Total per reaction 50 10501.1.准备准备RT master mixRT master mix 2. RT2. RT反应体系反应体系50 L of the RT master mix30 L of nuclease-free water20 L of RNA sample Step Type Time Tem
30、perature HOLD 10 min 25 C HOLD 120 min 37 C HOLD 5 sec 85 C 3. Program the thermal cycler.样品的稀释样品的稀释Sample NameStock Concentration (ng/L)Sample Volume (L)Diluent Volume (L)Total Volume of Diluted Sample (L) 0h 100.0 66.0 66.0 132.012h 100.0 66.0 66.0 132.024h 100.0 66.0 66.0 132.048h 100.0 66.0 66.0
31、 132.0The stock sample concentration is 100 ng/L. After diluting the sample according to the Sample Dilutions Calculations table, the sample has a concentration of 50 ng/L. Adding 5 L at this concentration to the final reaction mix volume of 50 L yields a 1 concentration in the final reaction.配制配制PC
32、RPCR反应反应mixmixComponent Volume (L) for 1 ReactionMaster Mix (2.0) 25.0Assay Mix (20.0) 2.50Water 17.50Total Volume 45.0 The reaction mix components are: TaqMan Universal PCR Master Mix (2) 18S Assay Mix (20) EGR3 Assay Mix (20) MAOB Assay Mix (20) OGDH Assay Mix (20) OSGEP Assay Mix (20) SERPING1 As
33、say Mix (20) Water反应成分反应成分反应成分的体积计算反应成分的体积计算.For the 18S assay, add the required components to the 18S Reaction Mix tube: Component Volume (L) for 1 Reaction Volume (L) for 16Reaction) TaqMan Universal PCR Master Mix (2) 25.0 440.0 18S Assay Mix (20) 2.5 44.0 Water 17.5 308.0 Total Reaction Mix Volu
34、me 45.0 792.0Tube Reaction Mix Reaction Mix Volume (L) Sample Sample Volume (L)1 18S Reaction Mix 198.0 0h 22.0 2 18S Reaction Mix 198.0 12h 22.03 18S Reaction Mix 198.0 24h 22.04 18S Reaction Mix 198.0 48h 22.0(Plus 10% Excess).View the Gene Expression Plot and Well Table.View the Amplification Plo
35、tn Rn vs Cycle Rn is the magnitude of normalized fluorescence generated by the reporter at each cycle during the PCR amplification. This plot displays Rn as a function of cycle number. You can use this plot to identify and examine irregular amplification and to view threshold and baseline values for
36、 the run.nRn vs Cycle Rn is the fluorescence from the reporter dye normalized to the fluorescence from the passive reference. This plot displays Rn as a function of cycle number. You can use this plot to identify and examine irregular amplification.nCT vs Well CT is the PCR cycle number at which the
37、 fluorescence meets the threshold in the amplification plot. This plot displays CT as a function of well position. You can use this plot to locate outlying amplification (outliers).View the Amplification Plot- Rn vs Cycle .Baseline Examples.View the Amplification Plot- Rn vs Cycle.Threshold Examples.View the Amplification Plot- CT vs Well .
