1、证明线粒体的电子传递和氧化磷酸化是由两2个不同的结构系统来实现的生物工程学院021班向生光前言 三羧酸循环等呼吸代谢过程中脱下的氢被NAD+或FAD所接受。细胞内的辅酶或辅基数量是有限的，它们必须将氢交给其它受体之后，才能再次接受氢。在需氧生物中，氧气便是这些氢的最终受体。这种有机物在生物活细胞中所进行的一系列传递氢和电子的氧化还原过程，称为生物氧化(biological oxidation)。生物氧化与非生物氧化的化学本质是相同的，都是脱氢、失去电子或与氧直接化合，并产生能量。然而生物氧化与非生物氧化不同，它是在生活细胞内，在常温、常压、接近中性的pH和有水的环境下，在一系列的酶以及中间传递
2、体的共同作用下逐步地完成的，而且能量是逐步释放的。生物氧化过程中释放的能量可被偶联的磷酸化反应所利用，贮存在高能磷酸化合物（如ATP、GTP等）中，以满足需能生理过程的需要。概念v电子传递过程包括包括电子从还原型辅酶通过一系列按照电子亲和力递增顺序排列的电子载体所构成的电子传递到氧的过程。v氧化磷酸化作用指的是伴随电子从底物到氧的传递，ADP被磷酸化形成ATP的酶促过程。氧化磷酸化的机理v在电子传递过程中所释放出的自由能是怎样转入ATP分子中的， 这就是氧化磷酸化作用的机理问题。有多种假说，如化学偶联学说、化学渗透学说和构象学说。不过，目前为大家所公认的、实验证据较充足的是英国生物化学家米切尔
3、的化学渗透学说。 经典实验 1968年E.Racker等人用超声波将线粒体破碎，线粒体内膜碎可自然卷成颗粒朝外的小膜泡，这种小膜泡称为亚线粒体小泡（submitochondrial vesicle）或亚线粒体颗粒（submitochodrial particles）。这些亚线粒体小泡具有电子传递和磷酸化的功能。如用胰蛋白酶或尿素处理，则小泡外面的颗粒可解离下来，这样的小泡便只能进行电子传递，而不能使ADP磷酸化生成ATP。 如果将这些颗粒重新装配到无颗粒的小泡上时，则小泡又恢复了电子传递和磷酸化相偶联的能力。由此可见，由NADH脱氢酶至细胞色素氧化酶的整个呼吸链的各种组分均存在于线粒体内膜中，
4、而颗粒是氧化磷酸化的偶联因子，位于内膜的基质侧，它是基粒（ATP酶复合物）的组分之一。氧化磷酸化的分子结构基础v电子传递链vATP合成酶的分子结构与组成v氧化磷酸化作用与电子传递的偶联v氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂结论 从以上各方面可以得知，线粒体的电子传递是由电子传递链来实现的，而氧化磷酸化也就是ATP的合成是在ATP合成酶中完成的。二者是偶联的却又是相对独立的。从而说明电子传递和氧化磷酸化是由两个不同的结构系统来实现的。电子传递链v所谓呼吸链(respiratory chain)即呼吸电子传递链(electron transport chain)，是线粒体内膜上
5、由呼吸传递体组成的电子传递总轨道。呼吸链传递体能把代谢物脱下的电子有序地传递给氧，呼吸传递体有两大类：氢传递体与电子传递体。氢传递体包括一些脱氢酶的辅助因子，主要有NAD、FMN、FAD、UQ等。它们既传递电子，也传递质子；电子传递体包括细胞色素系统和某些黄素蛋白、铁硫蛋白。呼吸链传递体传递电子的顺序是：代谢物NAD+FADUQ细胞色素系统O2。电子传递链的组成v复合体Iv辅酶Qv复合体IIv复合体IIIv细胞色素cv复合体IV化学渗透假说v1.1.呼吸传递体不对称地分布在线粒体内膜上呼吸传递体不对称地分布在线粒体内膜上 呼吸链上的递氢体与电子传递体在线粒体内膜上有着特定的不对称分布，彼此相间
6、排列，定向传递。v2.2.呼吸链的复合体中的递氢体有质子泵的作用呼吸链的复合体中的递氢体有质子泵的作用 它可以将H+从线粒体内膜的内侧泵至外侧。一般来说一对电子从NADH传递到O2时,共泵出6个H+。从FADH2开始,则共泵出4个H+。膜外侧的H+,不能自由通过内膜而返回内侧,这样在电子传递过程中，在内膜两侧建立起质子浓度梯度(pH)和膜电势差(E),二者构成跨膜的H+电化学势梯度H+，若将H+转变为以电势V为单位，则为质子动力。v质子的浓度梯度越大，则质子动力就越大，用于合成ATP的能力越强。v3.3.由质子动力推动由质子动力推动ATPATP的合成的合成 质子动力使H+流沿着ATP酶（偶联因
7、子）的H+通道进入线粒体基质时，释放的自由能推动ADP和Pi合成ATP（图片）。v化学渗透学说已得到充足的实验证据。当把线粒体悬浮在无O2缓冲液中,通入O2时，介质很快酸化，跨膜的H+浓度差可以达到1.5pH单位，电势差达0.5V，内膜的外表面对内表面是正的,并保持相对稳定，证实内膜不允许外侧的H+渗漏回内膜内侧。但当加入化学渗透假说解偶联剂2,4-二硝基苯酚(DNP)时，跨膜的H+浓度差和电势差就不能形成，就会阻止ATP的产生。有人将嗜盐菌的紫膜蛋白和线粒体ATPase嵌入脂质体,悬浮在含ADP和Pi溶液中，在光照下紫膜蛋白从介质中摄取H+，产生跨膜的H+浓度差，推动ATP的合成。当人工建立
8、起跨内膜的合适的H+浓度差时，也发现ADP和Pi合成了ATP。线粒体中氧化磷酸化反应的一般机理线粒体中氧化磷酸化反应的一般机理1.复合体复合体 v又称NADH泛醌氧化还原酶(NADHubiquinone oxidoreductase)。 分子量700X103900X103,含有25种不同的蛋白质,包括以黄素单核苷酸(flav in mononucleotide,FMN)为辅基的黄素蛋白和多种铁硫蛋白，如水溶性的铁硫蛋白(iron sulfur protein,IP)、铁硫黄素蛋白(ironsulfur flavoprotein，FP)、泛醌(ubiquinone,UQ)、磷脂(phosphol
9、ipid)。复合体的功能在于催化位于线粒体基质中由TCA循环产生的NADHH中的2个H经FMN转运到膜间空间，同时再经过Fe-S将2个电子传递到UQ(又称辅酶Q,CoQ)；UQ再与基质中的H结合，生成还原型泛醌(ubiquinol,UQH2)。该酶的作用可为鱼藤酮(rotenone)、杀粉蝶菌素A(piericidin A)、巴比妥酸(barbital acid)所抑制。它们都作用于同一区域，都能抑制Fe-S簇的氧化和泛醌的还原。 2.复合体复合体 又称琥珀酸，泛醌氧化还原酶(succinateubiquinone oxidoreductase)分子量约140103，含有45种不同的蛋白质，主
10、要成分是琥珀酸脱氢酶(succinate dehydro genase,SDH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)、细胞色素b(cytochrome b)和3个Fe-S蛋白。复合体的功能是催化琥珀酸氧化为延胡索酸，并将H转移到FAD生成FADH2，然后再把H转移到UQ生成UQH2。该酶活性可被2-噻吩甲酰三氟丙酮(thenoyltrifluoroacetone,TTFA)所抑制。 3.复合体复合体 v又 称 U Q H2 细 胞 色 素 C 氧 化 还 原 酶(ubiquinonecytochrome c oxidoreductase),分
11、子量250103，含有910种不同蛋白质，一般都含有2个Cyt b，1个Fe-S蛋白和1个Cyt c1。复合体的功能是催化电子从UQH2经Cyt bFeSCytc1传递到Cyt c，这一反应与跨膜质子转移相偶联，即将2个H释放到膜间空间。也有人认为在电子从Fe-S传到Cyt c1之前，先传递给UQ，同时UQ与基质中的H+结合生成UQH2。UQH2再将电子传给Cytc1，同时将2个H+释放到膜间空间。泛醌线粒体复合物泛醌线粒体复合物（细胞色素（细胞色素c 氧化还原酶）的假想构成和膜局部构造氧化还原酶）的假想构成和膜局部构造4.复合体复合体 又称Cyt c细胞色素氧化酶(Cyt ccytochro
12、me oxidase)分子量约160170103，含有多种不同的蛋白质，主要成分是Cyta和Cyta3及2个铜原子，组成两个氧化还原中心即Cyta CuA和Cyta3 CuB，第一个中心是接受来自Cyt c 的电子受体，第二个中心是氧还原的位置。它们通过Cu+ Cu2+的变化，在Cyta和Cyta3间传递电子。其功能是将 Cyt c中的电子传递给分子氧，氧分子被Cyta3、CuB还原至过氧化物水平；然后接受第三个电子，O-O键断裂，其中一个氧原子还原成H2O；在另一步中接受第四个电子，第二个氧原子进一步还原。也可能在这一电子传递过程中将线粒体基质中的 2个H+转运到膜间空间。CO、氰化物(cy
13、anide,CN-)、叠氮化物(azide,N3-)同O2竞争与Cytaa3中Fe的结合，可抑制从Cytaa3到O2的电子传递。线粒体复合物线粒体复合物（细胞色素（细胞色素c氧化酶）的假想结构和膜局部结构氧化酶）的假想结构和膜局部结构电子传递的方向（图片） 黄素蛋白中的FADH2 琥珀酸-Q还原酶 NADNADH-QQ细胞色素细胞色素c 还原酶 还原酶细胞色素氧化酶氧 图图 5-11 植物线粒体内膜上的复合体及其电子传递植物线粒体内膜上的复合体及其电子传递、分别代表复合体、； UQ库代表存在于线粒体中的泛醌库ATP合成酶vadenosine triphosphate synthase，又叫H+
14、-ATP酶复合物。由8种不同亚基组成,分子量分别是8.210355.2103，它们又分别组成两个蛋白质复合体(F1-F0)。F1从内膜伸入基质中，突出于膜表面，具有亲水性，酶的催化部位就位于其中。F0疏水，嵌入内膜磷脂之中，内有质子通道，它利用呼吸链上复合体、运行产生的质子能，将ADP和Pi合成ATP，也能催化与质子从内膜基质侧向内膜外侧转移相联的ATP水解。图图 5-14 ATP生成过程中构造变化的模型。生成过程中构造变化的模型。F1复合物有三个核苷酸结合位点。每一部位有三种完全不同的结构状态。松散的核苷酸结合部位（L），紧密核苷酸结合部位（T）和开放核苷酸结合部位（O）。在任何时候。F1复
15、合物包括这三种不同的结构，其中有一个与酶复合物的每一个催化中心相连。ADP和Pi开始被结合到开放状态未被占有的部位（1）。质子运动通过F0释放能量引起亚单位旋转。这种旋转自发改变了三个核苷酸结合位点的构造。结合有ATP的T型被转变成O型，ATP被释放出来。同时，结合有ADP和Pi的L型被转化成T型，疏水性的结合正有利于ATP生成。第上步中结合ADP和Pi的开放部位转化或松散型结构（2）。被紧密结合的ADP和Pi转化生成ATP，此步骤不需消耗能量和构型改变（3）氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂氧化磷酸化的解偶联剂和抑制剂1.解偶联剂解偶联剂(uncoupler) 2.2.抑制剂抑制剂( (depre
16、ssant) depressant) 3.3.离子载体抑制剂离子载体抑制剂( (ionophoreionophore depressant) depressant)1.1.解偶联剂解偶联剂( (uncoupleruncoupler) ) v植物在遇到干旱或某些化学物质作用时，会抑制ADP形成ATP的磷酸化作用，但不抑制电子传递，使电子传递产生的自由能以热的形式散失掉,导致氧化过程与磷酸化作用不偶联,这就是氧化磷酸化解偶联现象。能对呼吸链产生氧化磷酸化解偶联作用的化学试剂叫解偶联剂。最常见的解偶联剂有DNP，含有一个酸性基团的DNP是脂溶性的，可以穿透线粒体内膜，并把一个H+从膜外带入膜内，从而
17、破坏了跨内膜的质子梯度，抑制了ATP的生成。解偶联时会促进电子传递的进行，O2的消耗加大。2.2.抑制剂抑制剂( (depressant) depressant) v抑制剂与解偶联剂的区别在于,这类试剂不仅抑制ATP的形成，还同时抑制O2的消耗。这是因为像寡霉素(oligomycin)这一类的化学物质可以阻止膜间空间中的H+通过ATP合成酶的Fo进入线粒体基质，这样不仅会阻止ATP生成，还会维持和加强质子动力势,对电子传递产生反馈抑制,O2的消耗就会相应减少。 3.3.离子载体抑制剂离子载体抑制剂( (ionophoreionophore depressant)depressant)v离子载体
18、抑制剂与解偶联剂的区别在于它不是H+载体，而是可能和某些阳离子结合，生成脂溶性的复合物，并作为离子载体使这些离子能够穿过内膜，这样就增大了内膜对某些阳离子的通透性；同时因为在转运阳离子到基质中时消耗了自由能，降低了质子动力，从而抑制了ATP的形成。例如缬氨霉素(valinomycin)与K形成的复合物较易通过内膜进入基质，会抑制氧化磷酸化过程。氧化磷酸化作用与电子传递的偶联 氧化还原的本质是电子的转移。氢原子的转移其本质也是电子转移，因为H原子可分解为H+ 与e- 。当电子从NADH或FADH2 经呼吸链传递给氧形成水时，同时伴有ADP磷酸化形成ATP，这一过程称为氧化磷酸化。氧化磷酸化是生成
19、ATP的一种主要方式，是细胞内能量转换的主要环节。实验证明，呼吸链中有3个部位的自由能变化较大，这3个部位是呼吸链中氧化还原十分哪个的能量与ADP磷酸化生成的偶联部位，也即是呼吸链上可被特异性抑制剂阻断的部位。NADH呼吸链生成ATP 的3个部位是：NADH至辅酶Q；细胞色素b至细胞色素c；细胞色素aa3 至氧之间。3处各生成一分子ATP，共生成3个ATP分子。但FADH2 呼吸链只生成2个ATP分子，这是因为电子从FADH2 至辅酶Q间传递所释放的能量不足形成高能磷酸键所致。辅酶Q 辅酶Q（CoQ）又称泛醌，有时简称为Q。是脂溶性辅酶。在线粒体内膜中是一种均一的流动库，可以结合到膜上，也可以游离状态存在。它以不同的形式在电子传递链中起传递电子的作用。它不只接受NADH-Q还原酶脱下的电子和氢原子，还接受线粒体其他黄素酶脱下的电子和氢原子。可以说CoQ在电子传递链中处于中心地位。细胞色素c 细胞色素c是一个相对分子量为13 000的较小球形蛋白质，直径为3.4nm，由104个氨基酸构成一条单一的多肽链。它是唯一能溶于水的细胞色素。细胞色素c的铁原子与甲硫氨酸的硫原子和组氨酸残基的氮原子相连接，它的血红素基团由数个赖氨酸残基形成环状所包围。 细胞色素c交互地与复合体III的细胞色素C1 和复合体IV接触，起到在复合体III和IV之间传递电子的作用。
