1、PCRPCR技术的原理和方法技术的原理和方法PCR技术的原理PCR反应的体系及反应过程PCR技术的应用PCR技术简介 聚合酶链式反应是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家KBMullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应，经数小时之后，就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过烦琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。 PCR PCR技术为基因的分析与研究提供了一种强技术为基因的分析与研究提供了一种强有力的手段，是现代分子
2、生物学研究中的一项富有有力的手段，是现代分子生物学研究中的一项富有革新性的创举，对整个生命科学的研究与发展，都革新性的创举，对整个生命科学的研究与发展，都有着深远的影响。现在，有着深远的影响。现在，PCRPCR技术不仅可以用来扩增技术不仅可以用来扩增与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别与分离目的基因，而且在临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进鉴定、癌症治疗的监控、基因突变与检测、分子进化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的用途。化研究，以及法医学等诸多领域都有着重要的用途。因此，在该技术问世不久，即被在科技界享有盛誉因此，在该技术问世不久，即被在科技界享
3、有盛誉的美国的美国“Science”Science”杂志评为杂志评为19891989年度十大科技新闻年度十大科技新闻之一，成为全世界引用频率最高的文献。之一，成为全世界引用频率最高的文献。DNA的体内复制参与DNA复制的体系 PCR反应的体系和过程50PCR扩增过程Template DNA变性退火延伸复制过程反应产物以指数级增加PCR反应体系与反应条件反应体系与反应条件 标准的标准的PCR反应体系：反应体系： 10扩增缓冲液扩增缓冲液 10ul4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5uMg
4、2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至 100ulPCR反应五要素：反应五要素： 参加参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+ PCR反应条件反应条件 温度与时间的设置温度与时间的设置： 基于基于PCR原理三步骤而设置变性原理三步骤而设置变性-退火退火-延伸三延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，个温度点。在标准反应中采用三温度点法， 双链双链DNA在在9095变性变性， 再迅速冷却至再迅速冷却至40 60，引物退火引物退火并结合到靶并结合到靶序列上，序列上， 然后快速升温至然后快速升温至7075，在，在Ta
5、q DNA 聚合酶聚合酶的作用下，使引物链沿的作用下，使引物链沿模板延伸模板延伸。 循环次数循环次数:25-30 cycles. 单击显示PCR反应的动画演示PCR amitPCR反应特点反应特点 特异性强：特异性强： PCR反应的特异性决定因素为：反应的特异性决定因素为：引物与模板引物与模板DNA特异正确的结特异正确的结 合；合；碱基配对原则；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。靶基因的特异性与保守性。灵敏度高：灵敏度高： PCR产物的生成量是以指数方式增产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克加的，能将皮克(pg=10- 12
6、)量级的起始量级的起始待测模板扩增到微克待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，的检测中，PCR的灵敏度可达的灵敏度可达3RFU(空空斑形成单位斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为；在细菌学中最小检出率为3个细菌。个细菌。简便、快速简便、快速 PCR反应用耐高温的反应用耐高温的Taq DNA聚合聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性扩增液和水浴锅上进行变性-退火退火-延伸反应，一般在延伸反应，一般在24 小时完成扩增反小时完成扩增反应。扩增产物
7、一般用电泳分析，不一定应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广要用同位素，无放射性污染、易推广.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总粗制品及总RNA均可作为扩增模板。均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测扩增检测PCR扩增产物的分析扩增产物的分析 凝胶电泳分析：凝胶电泳分析：PCR产物电泳，产物电泳，EB溴乙锭染溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。色紫
8、外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。合预讦的大小，这是起码条件。 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳： 通常应用通常应用12%的琼脂糖凝的琼脂糖凝胶，胶， 供检测用。供检测用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。可用于科研及检测分析。 酶切分析酶切分析：根据：根据PCR产物中限制性内切
9、产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。行变异性研究。 分子杂交分子杂交：分子杂交是检测：分子杂交是检测PCR产物特产物特异性的有力证据，也是检测异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱产物碱基突变的有效方法。基突变的有效方法。 Southern印迹杂交印迹杂交： 在两引物之间另合成一条在两引物之间另合成一条寡核苷酸链寡核苷酸链(内部寡核苷酸内部寡核苷酸)标记后做探针，与标记后做探针，与PCR产物杂交
10、。此法既可作特异性鉴定，又可产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。量及条带形状，主要用于科研。 斑点杂交：斑点杂交： 将将PCR产物点在硝酸纤维素膜或产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴产物特异性鉴定及变异分析。定及变异分析。 核酸序列分析核酸序列分析：是检测：是检测PCR产物特异性的最可产物特异性的最可靠方法靠方法单击显示 PCR 技术的原理，方法和应用 总 结
