1、第六章第六章 中药制剂检验新技术中药制剂检验新技术u 目前，各种先进的分析技术和方法越来越多地用于中药及目前，各种先进的分析技术和方法越来越多地用于中药及其制剂，从而大大提高了药品检验工作的质量和水平。例如，其制剂，从而大大提高了药品检验工作的质量和水平。例如，指纹图谱技术（指纹图谱技术（FPFP）、毛细管电泳法（）、毛细管电泳法（CECE）、电感耦合等离）、电感耦合等离子体质谱法（子体质谱法（ICPMSICPMS）、原子吸收分光光度法（）、原子吸收分光光度法（AASAAS）以及各）以及各种色质联用技术等。其中有些已被种色质联用技术等。其中有些已被中国药典中国药典收载，成为收载，成为法定的检验
2、方法。本章将重点介绍指毛细管电泳法。法定的检验方法。本章将重点介绍指毛细管电泳法。 （一）原理（一）原理 毛细管电泳（毛细管电泳（CE）亦称为高效毛细管电泳法（）亦称为高效毛细管电泳法（HPCE），是），是20 世纪世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性 毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的 淌度淌度（单位电场强度下的迁移（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异而实速度）和分配行为的差异而实现分离，因此可将其视为经典现分离，因此可
3、将其视为经典电泳技术和现代微柱分离相结电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。合的产物。CE分离原理图示分离原理图示（二）特点（二）特点 高效、低耗、快速、广谱高效、低耗、快速、广谱 与与HPLC比较比较1.柱效更高，理论板数可达柱效更高，理论板数可达105 5106 6m-1，这主要是由于该法无固定相，这主要是由于该法无固定相， 不存在不存在传质差异传质差异，整个流体就像，整个流体就像塞子塞子似的以均速向前流动。似的以均速向前流动。2.分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。3.溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（溶剂和样
4、品消耗极少，样品用量仅为纳升（nl）级。不需高压泵输液，）级。不需高压泵输液， 毛细管价格低廉，因此工作成本更低。毛细管价格低廉，因此工作成本更低。4.通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，通过改变操作模式和缓冲溶液的成分， 该法有很大的选择性，可对各种成分进该法有很大的选择性，可对各种成分进 行有效的分离。例如，中性有机分子、行有效的分离。例如，中性有机分子、 无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚 至整个细胞或病毒。至整个细胞或病毒。HPLCCE（三）分离模式（共（三）分离模式（共6 6种）种） 1.1.毛细管区带电泳毛细管区带电泳（CZECZE）u CZECZE
5、又称为自由溶液区带电泳，系毛细管电泳中又称为自由溶液区带电泳，系毛细管电泳中最基本最基本、应用应用最广最广的一种操作模式，即将分析溶液引入毛细管进样一端，施的一种操作模式，即将分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性分子和阴离子及其电荷大小的毛细管出口端，按阳离子、中性分子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。但顺序通过检测器。但中性组分彼此不能分离中性组分彼此不能分离，因均随电渗流，因均随电渗流（EOFEOF）一起迁移。出峰时间称为迁移时间（）一起迁移。出峰时间称为迁
6、移时间（tmtm），相当于高效），相当于高效液相色谱（液相色谱（HPLCHPLC）和气相色谱（）和气相色谱（GCGC）中的保留时间。）中的保留时间。CZECZE较适合较适合带电溶质的分离，由于中性物质均系靠电渗流迁移，不存在迁带电溶质的分离，由于中性物质均系靠电渗流迁移，不存在迁移速度的差异，故不能实现分离。移速度的差异，故不能实现分离。2.胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKC或或MECC）u 该法系以该法系以胶束为假固定相胶束为假固定相的一种电动色谱。的一种电动色谱。u 当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十
7、二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、胆酸等，）、胆酸等，这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。对于常用的配系数存在差别而被分离。对于常用的阴离子表面活性剂十二烷阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（基硫酸钠（SDS），），进样后极强亲水性组分不能进入进样后极强亲水性组分不能进入SDS胶束，随胶束，随操作缓冲液流过检测器（容量因子操作
8、缓冲液流过检测器（容量因子k=0）；极强憎水性组分则进）；极强憎水性组分则进入入SDS胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器(k=)。其分。其分离原理见下图。离原理见下图。 该法适合该法适合中性物质中性物质的分离。因不同的溶质在胶束中的的分离。因不同的溶质在胶束中的分配系数分配系数不同，不同，其迁移速度存在差异而实现分离。其迁移速度存在差异而实现分离。MECC弥补了弥补了CZE不能分离中性物质的不能分离中性物质的不足，进一步拓宽了毛细管电泳的应用范围，鉴于中药多数为离子型和不足，进一步拓宽了毛细管电泳的应用范围，鉴于中药多数为离子型和中性物质的混合体，因此
9、中性物质的混合体，因此MECC更适合于中药分析更适合于中药分析。3.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）u 该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，该方法主要用于分析成凝胶，该方法主要用于分析蛋白质、蛋白质、DNA等生物大分等生物大分子。另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作子。另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称用进行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。4.毛细管等速电泳（毛细管
10、等速电泳（CITP）u 该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。窄的区带，然后依次通过检测器。5.毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳（CIEF）u 将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后，毛细管
11、中的操作电解质溶液和碱液，施加电压后，毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（等电点（PI）时变为中性，形成聚焦的区带，而后）时变为中性，形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法值的办法使溶质通过检测器。使溶质通过检测器。6.毛细管电色谱毛细管电色谱（CEC）u 该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完善的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到毛细管善的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到
12、毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离的，包含了时再加辅助压力）进行分离的，包含了色谱和电泳色谱和电泳两种机制，两种机制，其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。u 该法克服了该法克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺点，同选择性差和分离中性物质困难的缺点，同时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。二、仪
13、器设备二、仪器设备 （一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图） 1.电极槽和进样系统电极槽和进样系统 2.清洗系统清洗系统 3.毛细管毛细管 4.检测器检测器 5.铂电极铂电极 6.电极槽电极槽 7.恒温系统恒温系统 8.记录和数据处理记录和数据处理 （二）主要部件及其性能（二）主要部件及其性能 1.毛细管毛细管u 毛细管为毛细管为弹性石英弹性石英毛细管。内径毛细管。内径50m50m和和75m75m两两种使用较多，内径细的分离效果较好，但柱上检测种使用较多，内径细的分离效果较好，但柱上检测因光程较短，检测限比内径粗的要差。毛细管长度因光程较短，检测限比内径粗的
14、要差。毛细管长度称为称为总长度总长度，根据分离度的要求，可选用，根据分离度的要求，可选用2020100cm100cm长度，进样端至检测器间的长度称为长度，进样端至检测器间的长度称为有效长度有效长度。u 毛细管常盘放在管架上，在一定温度下操作，以毛细管常盘放在管架上，在一定温度下操作，以控制焦耳热，操作缓冲液的黏度和电导度，对测定控制焦耳热，操作缓冲液的黏度和电导度，对测定的重复性很重要。的重复性很重要。 2.直流高压电源直流高压电源 一般采用一般采用030kV（或相近）可调节直流电源，可供（或相近）可调节直流电源，可供应约应约300A电流，具有稳压和稳流两种方式可供选择。电流，具有稳压和稳流两
15、种方式可供选择。 3.电极和电极槽电极和电极槽 两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。 4.冲洗进样系统冲洗进样系统u 每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸
16、进样和电动进样等。进样时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。 5. .检测器检测器u 紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CECE 的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外 层聚合物剥去约层聚合物剥去约2mm2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一 个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达
17、光电池对溶 质进行检测。质进行检测。 1.检测窗口2.毛细管3.基座4.调焦机构5.圆形狭缝6.狭缝7.球透镜photo冲洗装置样品瓶毛细管UVD电极槽电极槽6.数据处理系统与一般色谱数据处理系统基本相同。三、基本操作三、基本操作（一）准备工作（一）准备工作 1. 按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。细管温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。 2. 按照各品种项下的规定配制操作缓冲液。操作缓冲液按照各品种项下的规定配制操作缓冲液。操作缓冲液须过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放须过滤
18、和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进样器。操作缓冲液的种类、入进样器。操作缓冲液的种类、pH值和浓度，以及添加剂值和浓度，以及添加剂（用以增加溶质的溶解度和（用以增加溶质的溶解度和/ /或控制溶质的解离度，手性拆或控制溶质的解离度，手性拆分等）的选定对测定结果的影响很大，应根据初试的结进行分等）的选定对测定结果的影响很大，应根据初试的结进行果调整、优化。果调整、优化。四、系统适用性试验四、系统适用性试验u 目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用。目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用。u 测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的测试项
19、目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的计算式和要求也相同。如重复性（相对标准偏差计算式和要求也相同。如重复性（相对标准偏差 RSD）、容量因）、容量因子（子（k）、毛细管理论数（）、毛细管理论数（n）、分离度（）、分离度（R）、拖尾因子（）、拖尾因子（T）、）、线性范围、最低检测限（线性范围、最低检测限（LOD）等，最低定量限（）等，最低定量限（LOQ）等，可）等，可参照测定。参照测定。 具体指标应符合各品种项下的规定。特别是进样精度，不同荷具体指标应符合各品种项下的规定。特别是进样精度，不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。（二）毛细
20、管的处理（二）毛细管的处理u 毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。u 未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如1mol/L氢氧化氢氧化钠液在钠液在60）冲洗，使毛细管内壁生成）冲洗，使毛细管内壁生成硅羟基硅羟基，再依次，再依次0.1mol/L氢氧化钠，水，操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用氢氧化钠，水，操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用0.1mol/L氢氧化氢氧化钠冲洗，甚至要用浓氢氧化钠液升温冲洗。钠冲洗，甚至要用
21、浓氢氧化钠液升温冲洗。u 凝胶毛细管，涂层毛细管，填充毛细管的冲洗则应按照所附说凝胶毛细管，涂层毛细管，填充毛细管的冲洗则应按照所附说明操作。明操作。u 冲洗时将盛溶液样品瓶依次置于进样器，设定顺序和时间进行。冲洗时将盛溶液样品瓶依次置于进样器，设定顺序和时间进行。（三）进样测试（三）进样测试u 将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分析。根据初试的电泳谱图调整
22、仪器和操作缓冲液以获析。根据初试的电泳谱图调整仪器和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式分析。得优化结果。而后用优化条件正式分析。（四）数据处理（四）数据处理 有关有关CE的计算方法、公式等可参照的计算方法、公式等可参照中国药典中国药典高高效液相色谱法的有关规定，将保留时间（效液相色谱法的有关规定，将保留时间（tR）改为）改为迁移迁移时间时间(tm)即可。即可。（五）结束工作（五）结束工作 分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，最后关机。最后关机。（
23、六）注意事项（六）注意事项u由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀进样的高效液相色谱法差，故进样的高效液相色谱法差，故定量测定定量测定以采用以采用内标法内标法为宜。为宜。u 用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致；注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致；u 用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧视现象和溶液用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量，也要注意其影响。离子强度会影响待测组分的
24、迁移量，也要注意其影响。五、应用实例五、应用实例山茱萸及六味地黄丸中没食子酸的含量测定山茱萸及六味地黄丸中没食子酸的含量测定u 没食子酸为中药山茱萸的有效成分，山茱萸为六味地黄丸没食子酸为中药山茱萸的有效成分，山茱萸为六味地黄丸药味之一。没食子酸在碱水中可电离成阴离子，故本法采药味之一。没食子酸在碱水中可电离成阴离子，故本法采用毛细管区带电泳法（用毛细管区带电泳法（CZE），肉桂酸为内标物，测定二），肉桂酸为内标物，测定二者中没食子酸的含量，以控制其质量。者中没食子酸的含量，以控制其质量。HOOHOHCOOHCHCHCOOH没食子酸肉桂酸（一）仪器与试剂（一）仪器与试剂u Unimicro毛细
25、管电泳仪；毛细管毛细管电泳仪；毛细管60cm（有效长度（有效长度45cm）75m；没食子酸对照品，肉桂酸对照品，；没食子酸对照品，肉桂酸对照品，95%乙醇，乙醇， 硼砂（分析纯），去离子水，市售山茱萸，硼砂（分析纯），去离子水，市售山茱萸，六味地黄丸（水蜜丸六味地黄丸（水蜜丸（二）实验条件（二）实验条件u 操作缓冲溶液为操作缓冲溶液为20mmol/L硼砂溶液，检测波长硼砂溶液，检测波长271nm，重力进样，重力进样（10cm5s），工作电压工作电压20kV，电泳温电泳温度度20，每次运行前依次用，每次运行前依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、去氢氧化钠溶液、去离子水、操作缓冲溶液冲洗离子水、操
26、作缓冲溶液冲洗3min。（三）测试溶液的制备（三）测试溶液的制备u 对照品溶液的制备对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品精密称取没食子酸对照品19.5mg19.5mg于于25ml25ml量瓶中，用量瓶中，用95%95%乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液；称取肉桂酸对照品溶液；称取肉桂酸对照品9.6mg9.6mg，用，用95%95%乙醇溶解并稀释至乙醇溶解并稀释至25ml25ml，作为内标溶液。，作为内标溶液。u 山茱萸供试品溶液的制备山茱萸供试品溶液的制备 将山茱萸药材剪碎，称取将山茱萸药材剪碎，称取5g5g，加加95%95%乙醇乙醇50ml50ml，浸泡
27、，浸泡1212小时，加热回流提取小时，加热回流提取2 2小时，过滤，小时，过滤，滤渣重复提取滤渣重复提取2 2次，合并提取液，减压浓缩至次，合并提取液，减压浓缩至10ml.10ml.u 移至移至50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加95%95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取量取2ml2ml并加入内标溶液并加入内标溶液1ml1ml，95%95%乙醇稀释定容至乙醇稀释定容至5ml5ml，摇，摇匀，即得。匀，即得。u 六味地黄丸供试品溶液的制备六味地黄丸供试品溶液的制备 取六味地黄丸粉碎后，取六味地黄丸粉碎后，称取称取5g5g，提取方法同山茱萸药材，减压浓至，提取方法同山茱萸
28、药材，减压浓至10ml10ml，以下操，以下操作同山茱萸供试品溶液的制备，即得。作同山茱萸供试品溶液的制备，即得。（四）系统适用性试验（四）系统适用性试验u 在山茱萸的测定中，没食子酸的理论板数在山茱萸的测定中，没食子酸的理论板数n=179820，在六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数在六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数n=167388，没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。下图没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。下图为山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱。为山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱。 山茱萸山茱萸（A）、六味地黄丸六味地黄丸（B）和对照品和对照品（C）
29、的电泳图谱的电泳图谱 （1.肉桂酸；肉桂酸；2.没食子酸）没食子酸） （五）方法学考察（五）方法学考察u 线性范围线性范围 精密量取没食子酸对照品溶液精密量取没食子酸对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml于于5ml量瓶中，各加入肉桂酸内标量瓶中，各加入肉桂酸内标液液1ml，95%乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标物乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标物峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为Y=0.0167X+0.1333，相关系数，相关系数r=0.9993（n=7）。u 精密度精密度 山茱萸和六味地黄丸峰面积的山茱萸和六味地黄丸峰面积的RSD分别为分别为2.9%和和2.1%（n=5）u 准确度准确度 山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为97.4% 98.6%和和99.3%102.4%。（六）样品中没食子酸的含量测定（六）样品中没食子酸的含量测定u 取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分别测定，山茱萸中没食子酸含量为别测定，山茱萸中没食子酸含量为0.225%；六味地；六味地黄丸中没食子酸的含量为黄丸中没食子酸的含量为0.055%。
