1、基础学习实验目的基因的基础学习实验目的基因的PCR扩增及其扩扩增及其扩增产物的鉴定增产物的鉴定此实验共包括如下六个部分此实验共包括如下六个部分第一部分，目的基因选择第一部分，目的基因选择第二部分，第二部分，PCRPCR引物设计引物设计第三部分，第三部分，PCRPCR实验操作实验操作第四部分，第四部分，PCRPCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定第五部分，第五部分，PCRPCR产物测序鉴定产物测序鉴定1.1.第六部分，目的基因序列变异分析第六部分，目的基因序列变异分析 PCR技术的发明技术的发明PCR与临床诊断与临床诊断第一部分，目的基因选择第一部分，目的基因选择候选基因简介候选基因简介在本实验中，有三
2、个候选基因，分别是在本实验中，有三个候选基因，分别是NGAL，Fascin和和Ezrin。这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中起重这三个基因在食管癌及其他多种肿瘤中呈过表达，说明它们在肿瘤的发生发展中起重要的生物学作用。要的生物学作用。汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组曾对这三个基因进行了深入研究，在国外杂志上发表入研究，在国外杂志上发表SCI收录研究论文收录研究论文20余篇，已形成系列优势。余篇，已形成系列优势。同学们可查阅相关资料，选择感兴趣的基因来做同学们可查阅相
3、关资料，选择感兴趣的基因来做PCR实验。实验。NGAL（neutrophil gelatinase-associated lipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（是脂质运载蛋白（lipocalin) 家族的一个成员。家族的一个成员。 NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性，作为小分子铁配合物结合蛋的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判作为一种早期标
4、志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。定缺血性肾损伤程度。 NGAL的的mRNA信息在信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有区的有BC033089和和NM_005564等，编码区长为等，编码区长为597 bp，编码，编码198个氨基酸，包含了个氨基酸，包含了N端前部长端前部长为为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60 bp）。）。NGAL 基因基因NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：前前20个个AA为信号肽序为信号肽序列列2
5、001年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系年汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民课题组以永生化食管上皮细胞系SHEE 和食管癌细胞系和食管癌细胞系SHEEC 互为对照，用互为对照，用cDNA 微列阵进行筛选，用微列阵进行筛选，用RNA 印迹和印迹和RT-PCR 进进行鉴定，行鉴定，cDNA 克隆测序后与克隆测序后与GenBank 进行进行BLAST 分析比较。结果表明分析比较。结果表明NGAL 基因在基因在SHEEC中中出现显著差异过表达，其出现显著差异过表达，其cDNA 序列与小鼠序列与小鼠24p3、大鼠、大鼠NRL (neu-related
6、 lipocalin) 和人中性粒细和人中性粒细胞胞NGAL 具有较高的相似性。这提示具有较高的相似性。这提示NGAL 基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着基因在永生化食管上皮细胞恶性转化中可能发挥着重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。重要作用，可能是一种新的癌基因或促癌基因。AB利用利用cDNA 芯片筛选两种细胞的差异表达基因芯片筛选两种细胞的差异表达基因A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SHEE B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEEC A B C反转录反转录PCR检测检测NGAL在两种细胞的在两种细胞的mRNA水平水平A.永生化食管上皮细胞系永生化食管上皮细胞系SH
7、EE B.食管癌细胞系食管癌细胞系SHEECC. 100 bp DNA markerFascin蛋白的蛋白的mRNA全长为全长为2767bp，由，由5端非翻译区端非翻译区111bp碱基，碱基，3端非翻译区端非翻译区1174bp碱基，碱基，1482bp的全编码序列区和的全编码序列区和6个个PloyA信号肽组成，编码信号肽组成，编码493个氨基酸，分子量约为个氨基酸，分子量约为55kD。Fascin蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶蛋白定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶(ruffles)，边缘的丝状伪足，边缘的丝状伪足(filopodia)、微棘、微棘(microspikes)的核心肌动蛋白束中。
8、的核心肌动蛋白束中。以往研究发现，以往研究发现，Fascin基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌基因在许多上皮来源的肿瘤细胞系，如宫颈癌Hela、胃癌、胃癌AGS、大肠、大肠癌癌LM1215和和SW480、胰腺癌、胰腺癌BxPC3和和T3H4等细胞系中均上调表达。等细胞系中均上调表达。细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示细胞的丝状伪足和微棘与细胞的运动，癌细胞的转移有密切关系，提示Fascin蛋白可能在细蛋白可能在细胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。胞迁移、细胞粘附以及细胞间信息交流等过程中发挥作用。Fascin 基因基因ATGACCGCCAAC
9、GGCACAGCCGAGGCGGTGCAGATCCAGTTCGGCCTCATCAACTGCGGCAACAAGTACCTGACGGCCGAGGCGTTCGGGTTCAAGGTGAACGCGTCCGCCAGCAGCCTGAAGAAGAAGCAGATCTGGACGCTGGAGCAGCCCCCTGACGAGGCGGGCAGCGCGGCCGTGTGCCTGCGCAGCCACCTGGGCCGCTACCTGGCGGCGGACAAGGACGGCAACGTGACCTGCGAGCGCGAGGTGCCCGGTCCCGACTGCCGTTTCCTCATCGTGGCGCACGACGACGGTCGCTGGTCGCTGCAG
10、TCCGAGGCGCACCGGCGCTACTTCGGCGGCACCGAGGACCGCCTGTCCTGCTTCGCGCAGACGGTGTCCCCCGCCGAGAAGTGGAGCGTGCACATCGCCATGCACCCTCAGGTCAACATCTACAGCGTCACCCGTAAGCGCTACGCGCACCTGAGCGCGCGGCCGGCCGACGAGATCGCCGTGGACCGCGACGTGCCCTGGGGCGTCGACTCGCTCATCACCCTCGCCTTCCAGGACCAGCGCTACAGCGTGCAGACCGCCGACCACCGCTTCCTGCGCCACGACGGGCGCCTGGTGGCG
11、CGCCCCGAGCCGGCCACTGGCTACACGCTGGAGTTCCGCTCCGGCAAGGTGGCCTTCCGCGACTGCGAGGGCCGTTACCTGGCGCCGTCGGGGCCCAGCGGCACGCTCAAGGCGGGCAAGGCCACCAAGGTGGGCAAGGACGAGCTCTTTGCTCTGGAGCAGAGCTGCGCCCAGGTCGTGCTGCAGGCGGCCAACGAGAGGAACGTGTCCACGCGCCAGGGTATGGACCTGTCTGCCAATCAGGACGAGGAGACCGACCAGGAGACCTTCCAGCTGGAGATCGACCGCGACACCAAAAAG
12、TGTGCCTTCCGTACCCACACGGGCAAGTACTGGACGCTGACGGCCACCGGGGGCGTGCAGTCCACCGCCTCCAGCAAGAATGCCAGCTGCTACTTTGACATCGAGTGGCGTGACCGGCGCATCACACTGAGGGCGTCCAATGGCAAGTTTGTGACCTCCAAGAAGAATGGGCAGCTGGCCGCCTCGGTGGAGACAGCAGGGGACTCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCTCATCAACCGCCCCATCATCGTGTTCCGCGGGGAGCATGGCTTCATCGGCTGCCGCAAGGTCACGGGCACCCTG
13、GACGCCAACCGCTCCAGCTATGACGTCTTCCAGCTGGAGTTCAACGATGGCGCCTACAACATCAAAGACTCCACAGGCAAATACTGGACGGTGGGCAGTGACTCCGCGGTCACCAGCAGCGGCGACACTCCTGTGGACTTCTTCTTCGAGTTCTGCGACTATAACAAGGTGGCCATCAAGGTGGGCGGGCGCTACCTGAAGGGCGACCACGCAGGCGTCCTGAAGGCCTCGGCGGAAACCGTGGACCCCGCCTCGCTCTGGGAGTACTAGMTANGTAEAVQIQFGLINCGNKYLTAEAFG
14、FKVNASASSLKKKQIWTLEQPPDEAGSAAVCLRSHLGRYLAADKDGNVTCEREVPGPDCRFLIVAHDDGRWSLQSEAHRRYFGGTEDRLSCFAQTVSPAEKWSVHIAMHPQVNIYSVTRKRYAHLSARPADEIAVDRDVPWGVDSLITLAFQDQRYSVQTADHRFLRHDGRLVARPEPATGYTLEFRSGKVAFRDCEGRYLAPSGPSGTLKAGKATKVGKDELFALEQSCAQVVLQAANERNVSTRQGMDLSANQDEETDQETFQLEIDRDTKKCAFRTHTGKYWTLTATGGVQSTASSK
15、NASCYFDIEWRDRRITLRASNGKFVTSKKNGQLAASVETAGDSELFLMKLINRPIIVFRGEHGFIGCRKVTGTLDANRSSYDVFQLEFNDGAYNIKDSTGKYWTVGSDSAVTSSGDTPVDFFFEFCDYNKVAIKVGGRYLKGDHAGVLKASAETVDPASLWEYFascin基因的编码区序列基因的编码区序列Fascin基因的蛋白序列基因的蛋白序列Fascin蛋白的三级结构：由蛋白的三级结构：由4个个-三叶草结构组成，含多个三叶草结构组成，含多个折叠折叠我们课题组发现，在永生化食管上皮细胞我们课题组发现，在永生化食管上皮细胞SHEE向
16、食管癌细胞向食管癌细胞SHEEmt的恶性转化中，的恶性转化中，Fascin基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到基因呈现上调表达，并且在食管癌组织中也检测到Fascin蛋白呈阳性表达。蛋白呈阳性表达。Fascin在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们设计在食管癌中的具体功能以及过表达的机制至今仍没有得到很好的阐明。为此我们设计并合成了靶向并合成了靶向Fascin基因的基因的siRNA，试图通过，试图通过RNA干扰的方法减少干扰的方法减少Fascin基因的表达，从而探基因的表达，从而探讨讨Fascin对肿瘤的分化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。对肿瘤的分
17、化、分裂增殖和浸润等生物学行为的影响。扫描电镜结果显示抑制扫描电镜结果显示抑制Fascin表达后，表达后，EC109细胞突触形成明显减少。细胞突触形成明显减少。细胞免疫荧光结果显示代表细胞免疫荧光结果显示代表Fascin蛋白的绿色荧光在被干扰蛋白的绿色荧光在被干扰细胞（细胞（A）中要比对照细胞（）中要比对照细胞（B）的弱）的弱ABEzrin基因基因Ezrin为为ERM（Ezrin,radixin,moesin ）蛋白家族成员之一，）蛋白家族成员之一，ERM家族成员大多位于丝状突和膜伸家族成员大多位于丝状突和膜伸展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样可维持细胞
18、展部位，基本功能就是将肌动蛋白栓系到细胞膜和将膜蛋白锚定在特定的部位，这样可维持细胞膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。膜表面的一些特殊结构，如微绒毛和细胞膜突起等。ERM家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用参家族蛋白还参与细胞表面粘附分子的定位，通过细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用参与细胞粘附作用降。与细胞粘附作用降。ERM家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过家族蛋白还是酪氨酸激酶的受体，并通过Rho-GTP酶参与信号转导。酶参与信号转导。Ezrin含有含有585个氨基酸，等电点为个氨基酸，等电点为6.15，理论分子量为，理论分子量为6
19、9kD。Ezrin分子带有大量电荷（分子带有大量电荷（38.5%的的氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因（氨基酸残基带电荷），这可能是导致它的理论分子量与实际分子量不同的原因（Ezrin实际分子量实际分子量为为80kD）。）。Ezrin定位与染色体定位与染色体6q25.2-q26，DNA长度为长度为1761个碱基，含个碱基，含13个外显子。个外显子。ATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTTACCACCATGGATGCAGAGCTGGAGTTTGCAATCCAGCCAAATACAACTGGAAAACAGCTTTTTGATCAGGTGGTAAAGACT
20、ATCGGCCTCCGGGAAGTGTGGTACTTTGGCCTCCACTATGTGGATAATAAAGGATTTCCTACCTGGCTGAAGCTGGATAAGAAGGTGTCTGCCCAGGAGGTCAGGAAGGAGAATCCCCTCCAGTTCAAGTTCCGGGCCAAGTTCTACCCTGAAGATGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATCACCCAGAAACTTTTCTTCCTCCAAGTGAAGGAAGGAATCCTTAGCGATGAGATCTACTGCCCCCCTGAGACTGCCGTGCTCTTGGGGTCCTACGCTGTGCAGGCCAAGTTTGGGGAC
21、TACAACAAAGAAGTGCACAAGTCTGGGTACCTCAGCTCTGAGCGGCTGATCCCTCAAAGAGTGATGGACCAGCACAAACTTACCAGGGACCAGTGGGAGGACCGGATCCAGGTGTGGCATGCGGAACACCGTGGGATGCTCAAAGATAATGCTATGTTGGAATACCTGAAGATTGCTCAGGACCTGGAAATGTATGGAATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAGAAAGGAACAGACCTTTGGCTTGGAGTTGATGCCCTTGGACTGAATATTTATGAGAAAGATGATAAGTTAACCCCA
22、AAGATTGGCTTTCCTTGGAGTGAAATCAGGAACATCTCTTTCAATGACAAAAAGTTTGTCATTAAACCCATCGACAAGAAGGCACCTGACTTTGTGTTTTATGCCCCACGTCTGAGAATCAACAAGCGGATCCTGCAGCTCTGCATGGGCAACCATGAGTTGTATATGCGCCGCAGGAAGCCTGACACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGCCCAGGCCCGGGAGGAGAAGCA TCAGAAGCAGCTGGAGCGGCAACAGCTGGAAACAGAGAAGAAAAGGAGAGAAACCGTGGAGAGAGA
23、GAAAGAGCAGA TGA TGCGCGAGAAGGAGGAGTTGATGCTGCGGCTGCAGGACTATGAGGAGAAGACAAAGAAGGCAGAGAGAGAGCTCTCGGAGCAGA TTCAGAGGGCCCTGCAGCTGGAGGAGGAGAGGAAGCGGGCACAGGAGGAGGCCGAGCGCCTAGAGGCTGACCGT A TGGCTGCACTGCGGGCT AAGGAGGAGCTGGAGAGACAGGCGGTGGATCAGATAAAGAGCCAGGAGCAGCTGGCTGCGGAGCTTGCAGAA T ACACTGCCAAGATTGCCCTCCTGGAAGAG
24、GCGCGGAGGCGCAAGGAGGATGAAGTTGAAGAGTGGCAGCACAGGGCCAAAGAAGCCCAGGATGACCTGGTGAAGACCAAGGAGGAGCTGCACCTGGTGATGACAGCACCCCCGCCCCCACCACCCCCCGTGTACGAGCCGGTGAGCTACCATGTCCAGGAGAGCTTGCAGGATGAGGGCGCAGAGCCCACGGGCTACAGCGCGGAGCTGTCTAGTGAGGGCATCCGGGATGACCGCAATGAGGAGAAGCGCATCACTGAGGCAGAGAAGAACGAGCGTGTGCAGCGGCAGCTGCTGACG
25、CTGAGCAGCGAGCTGTCCCAGGCCCGAGATGAGAATAAGAGGACCCACAATGACATCATCCACAACGAGAACATGAGGCAAGGCCGGGACAAGTACAAGACGCTGCGGCAGATCCGGCAGGGCAACACCAAGCAGC G C A T C G A C G A G TTCG AG G CCCTG T AAEzrin的编码区序列的编码区序列Ezrin蛋白含有四个功能域蛋白含有四个功能域名称名称起始起始终点终点功能功能FERM_N 986将胞浆蛋白连接到膜上将胞浆蛋白连接到膜上FERM_M 88206FERM_C 210299ERM 338586
26、结合胞浆蛋白结合胞浆蛋白我们课题组发现我们课题组发现Ezrin在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布和胞在食管癌及切缘食管粘膜组织中的位置分布有胞膜分布、胞浆分布和胞膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明膜胞浆混合分布等三种模式。恶性程度越高的癌细胞越易具有胞浆分布模式，说明Ezrin细胞细胞定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。定位的变化可能在食管癌的发生发展过程中发挥重要作用。第二部分，第二部分，PCR引物设计引物设计引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。目前有多种引物设计软件，如产物的长度和特异性。目前有多种引物
27、设计软件，如primer premier5、Oligo和和北京军事医学科学院李伍举教授开发的北京军事医学科学院李伍举教授开发的Biosun等，等，Internet免费引物设计网站有免费引物设计网站有primer 3，Primerfinder等。等。引物设计有以下几个原则：引物设计有以下几个原则：（1 1）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过）引物的特异性。引物应根据目的序列进行设计，引物与非靶序列之间不要超过 7070的同源性或连续的同源性或连续8 8个的碱基互补，减少非特异产物；个的碱基互补，减少非特异产物；（2 2）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结
28、合的部分，不包括在）引物的长度。一般指引物中能与模板序列互补结合的部分，不包括在55端额外增加端额外增加的酶切位点序列和其他序列。引物长度以的酶切位点序列和其他序列。引物长度以181824 bp24 bp为佳。为佳。（3）引物）引物3末端的碱基。引物末端的碱基。引物3末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是末端是延伸的始端，碱基错配会影响延伸效率。当最后一个碱基是A时，容易发生错配，所以引物时，容易发生错配，所以引物3末端最好不要为末端最好不要为A；（4）引物的）引物的G+C含量一般为含量一般为4060，过高或过低都不利于引发反应；，过高或过低都不利于引发反应；（5）两条引物
29、不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响）两条引物不能形成稳定的二聚体，或引物自身不能形成稳定的二级发夹结构，这些都会影响引物与模板的结合。引物与模板的结合。（6）两条引物的融解温度）两条引物的融解温度Tm值尽量不要相差太大，引物的值尽量不要相差太大，引物的Tm值粗略计算公式为值粗略计算公式为Tm = 4 （G+C）+2（A+T）；）；（7）引物的）引物的5端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物端对扩增特异性没有影响，因此可以被修饰而不影响扩增的特异性，引物5端修饰包端修饰包括加酶切位点、标记生物素和荧光等，引物括加酶切位点、标记生物素
30、和荧光等，引物3端是延伸的开始，不能进行任何修饰。端是延伸的开始，不能进行任何修饰。引物设计软件引物设计软件primer premier 5.0的使用的使用可通过两个方法将序列输入软件中可通过两个方法将序列输入软件中在表中粘贴序列在表中粘贴序列打开原有的序列文件打开原有的序列文件选择序列文选择序列文件所在位置件所在位置 在对话框中输入待扩增序列在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的点击左上角的“Primer”按钮按钮Hairpin: 引物自身是否会形成发夹结构引物自身是否会形成发夹结构Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体同一种引物是否会形成二聚体False primiring: 引物在待扩
31、增序列中其他位置是否有配对引物在待扩增序列中其他位置是否有配对Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体正向与反向引物间是否会形成二聚体引物设计界面引物设计界面正向和正向和反向引反向引物的互物的互换换正向和反向正向和反向引物的评价引物的评价正向和反向正向和反向引物的信息引物的信息每点击左边每点击左边红色的按钮，红色的按钮，就出现相应就出现相应的内容的内容对正向和反向引物进行编辑对正向和反向引物进行编辑可对引物进行增加或减少碱基可对引物进行增加或减少碱基用键盘输入了用键盘输入了5 5个碱基个碱基引物的信息引物的信息改动后引物的信息改动后引物的信息重新回到双引物的界面重新回到双引物
32、的界面“Edit”“Copy”“Sense Primer”5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3输出引物序列输出引物序列了解并掌握了解并掌握PCR基因扩增的基本原理基因扩增的基本原理熟悉熟悉PCR基因扩增技术的具体操作过程基因扩增技术的具体操作过程 实验目的实验目的第三部分，第三部分，PCR实验操作实验操作一、概述一、概述 PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成合成 酶和四种脱氧核糖核酸进酶和四种脱氧核糖核酸进行行DNA的体外合成反应。的体外合成反应。 PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便
33、和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪该技术在上个世纪80年代中期由美国年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。年度的诺贝尔化学奖。二、二、PCR基本原理基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖
34、核酸聚合过程，是 DNA聚合酶、聚合酶、DNA连连接酶、引发酶、接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个复制，所以在一个PCR中必需成中必需成分是分是 1. 模板模板DNA 2. DNA聚合酶聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。适当的缓冲体系。模板序列：待扩增的模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链
35、的序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋可包括线形双螺旋DNA，如基因组，如基因组DNA，及闭环双链，及闭环双链DNA，如质粒；，如质粒；模板的来源很广，如从细胞模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组细菌中提取基因组DNA、提取、提取mRNA经反转录得到经反转录得到cDNA、质粒、病毒等；质粒、病毒等；每个反应中模板的量为每个反应中模板的量为1 ng1 g。质粒。质粒DNA和纯化的和纯化的DNA的量可少一些，而基因组的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。的量应多一些。PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的
36、污染，否则会导致PCR的非的非特异性扩增。特异性扩增。1、模板、模板DNA引物（引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为反应需要两种引物，分别成为5端引物和端引物和3端引物，或称为正向引物和反向引物。端引物，或称为正向引物和反向引物。通常通常DNA及及mRNA序列的写法为序列的写法为53，所以，所以5端引物与目的序列的端引物与目的序列的5末端序列相同，而末端序列相同，而3端引端引物与目的序列的物与目的序列的3末端序列反向互补。末端序列反向互补。2 2、引物、引物它们作为它们作为DNADNA扩增的起始部分，能限定待扩增扩增的起始部
37、分，能限定待扩增DNADNA序列的长度。序列的长度。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有151518 bp18 bp。5 55 53 33 35 55 53 33 3上游引物上游引物下游引物下游引物DNA聚合酶：以聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。的一种酶。早期的早期的PCR反应使用的反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段。但该酶在高温下容易片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应
38、进行时候再加入一份酶。失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。随着新的耐热随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。操作更方便，产量更稳定。目前商品化的目前商品化的DNA聚合酶有聚合酶有Taq DNA聚合酶和聚合酶和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶最适工作温度为聚合酶最适工作温度为75-80。该酶具有。该酶具有53聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿化核苷酸沿53方向发生聚合反应。方向发生聚合反应。3、DNA聚合酶聚合酶4 4、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸
39、四种脱氧核苷三磷酸即四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和和dGTP，为，为PCR反应中反应中DNA合成原料。合成原料。在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。缓冲液提供缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和和MgCl2。其中其中Mg2的浓度最重要，它能影响的浓度最重要，它能影
40、响DNA聚合酶的活性，以及模板与聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链产物的解链温度。温度。5 5、缓冲液、缓冲液变性：是指模板的热变性，双螺旋模版变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的成为单链的DNA分子；在应用分子；在应用Taq DNA聚合酶进聚合酶进行行PCR反应时，变性往往在反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进行聚合酶进行30个左右的个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔退火
41、：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低解温度低510，PCR实验要对退火温度进行优化。实验要对退火温度进行优化。二、二、PCR基本步骤基本步骤延伸：在镁离子存在条件下，延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的物的3端，使引物沿端，使引物沿53方向生成与模版方向生成与模版DNA互补的新互补的新DNA链。链。双链模版双链模版DNADNA变性变性退火退火5 53 35 53 35 55 53 33 35 55 53 33 35 55 53 33 3上游引上游引物物
42、下游引下游引物物延伸延伸3 35 55 53 33 35 55 53 3多次循环多次循环（2 2n n 拷贝）拷贝）下面为一个典型的下面为一个典型的PCR循环参数设置：循环参数设置：备注：备注：* 比两条引物的比两条引物的Tm值值低低510。94 5 min 94 30 s X * 30 s 72 1 kb/min 72 5 min25-3525-35个循环个循环三、影响三、影响PCR因素因素 虽然虽然PCRPCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCRPCR的特异性和高效性。的特异性和高效性。引物引物变性温度和时间变性温度和时间退火温度和时间退火温度
43、和时间延伸温度和时间延伸温度和时间1.1. 循环次数循环次数引物决定了引物决定了PCR产物的长度和特异性。产物的长度和特异性。引物的设计要求请看本实验讲义引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计引物设计”部分。部分。1 1、引物、引物在在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNA完全变性成单链完全变性成单链DNA，一般设为，一般设为95、5 min；在随后的循环中，可设为；在随后的循环中，可设为95、30s。有些模板有些模板DNA的的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会
44、影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 2 2、变性温度和时间、变性温度和时间退火温度与引物的退火温度与引物的Tm值相关，一般比值相关，一般比Tm值低值低510。退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低低PCR效率。效率。在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为时间过长容易产生引物在模板
45、上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为30s基基本上就足够了。本上就足够了。3 3、退火温度和时间、退火温度和时间所用所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的最佳温度为聚合酶的最佳温度为7080度，度，所以延伸温度设为所以延伸温度设为72即可。即可。在实践中在实践中Taq DNA聚合酶的延伸效率约为聚合酶的延伸效率约为500 bp/30 s，若待扩增的片段较长，可适当延，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。4 4、延伸温度和时间、延伸温度和时间在经过一定的循
46、环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，PCR产物不再产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。呈指数增加，此时称为平台效应。循环次数设为循环次数设为2530次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。基错配增加和非特异性扩增的出现。5 5、循环次数、循环次数DNA模板：以模板：以pPIC9-NGAL为模板，来扩增不包含信号肽序列的为模板，来扩增不包含信号肽序列的NGAL编码区编码区引物：引物： PCR上游引物（上
47、游引物（P1）：）：5-CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA -3 PCR下游引物（下游引物（P2）：）：5-CGGAATTCTCAGCCGTCGATACACTGGTC -3 底下有横线的碱基为酶切位点：底下有横线的碱基为酶切位点：XholI (P1)，EcoRI(P2)2Taq PCR Master Mix （广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为：（广州佰路生物科技有限公司生产，产品成份为： 0.1 U Taq DNA Polymerase/ml 500 mM dNTP each 50 mM Tris-HCl (pH8.7) 20 mM KCl 4 mM MgCl
48、2 无菌水无菌水100bp plus ladder DNA marker本实验所用试剂本实验所用试剂实验操作实验操作95 2min95 2min94 30s94 30s60 30s 60 30s 72 30s72 30s72 5min72 5min30个循环个循环按以下次序将各成分加按以下次序将各成分加PCR管中。管中。 2Taq PCR MasterMix 5 l P1 (12.5 M ) 1 l P2 (12.5 M) 1 l 无菌水无菌水 2 l pPIC9-NGAL 1 l 反应体系：反应体系：10 l混匀，稍加离心并标记。混匀，稍加离心并标记。PCR反应于反应于ABI 2720 Th
49、ermer cycler进行，进行，PCR反应条件：反应条件： 凝胶准备凝胶准备 称称1g琼脂糖置三角瓶中，加琼脂糖置三角瓶中，加100ml 1TAE； 微波炉加热大约微波炉加热大约2分钟，熔化琼脂糖；分钟，熔化琼脂糖； 熔化的琼脂糖自然冷却到熔化的琼脂糖自然冷却到6070时，加入时，加入EB 5l，并轻轻混匀。，并轻轻混匀。 胶床准备胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙；的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；将胶床放在调整好的水平台上； 铺胶：将冷却致铺胶：将冷却致60的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约的凝胶
50、倒入准备好的胶床内，凝胶厚度约5 mm；室温下静置室温下静置30分钟左右，凝胶固化。将带凝胶分钟左右，凝胶固化。将带凝胶 的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；于电场负极；第四部分，第四部分，PCR产物电泳鉴定产物电泳鉴定向电泳槽中加入向电泳槽中加入1TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样
