1、HPVHPV病毒检测的病毒检测的目的目的及最佳检测方法及最佳检测方法1 1、HPVHPV检测的目的是什么？检测的目的是什么？2、HPV检查的最佳方法？3、德同产品介绍2主要内容 只是为了查有没有HPV病毒感染？ 是为了查HPV感染型别，检测型别越多越好？ 是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的 风险人群？3HPV检测的目的是什么？专家对专家对HPV检测是否要临床验证如何看待？检测是否要临床验证如何看待？HPV检测的目的是什么？1个个HIV/HBV = AIDS/HBV1个个HPV CIN或宫颈癌或宫颈癌 （80-90%的女性HPV感染是一过性的，可在6-24个月通过自体免疫清除）
2、高危型HPV持续感会导致宫颈癌从HPV感染到宫颈癌，一般需要1020年高分析敏感度高分析敏感度检测与临床无关的病毒检测与临床无关的病毒水平（假阳性）水平（假阳性）一过性的感染会自身清除一过性的感染会自身清除恢复阶段：免疫响应恢复阶段：免疫响应早期感染会自身清除早期感染会自身清除Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6HPV检测的目的是什么？HPV病毒含量与临床病变的关系CIN病变进展为高级病变无CIN病变CIN转归WHO指南对于HPVCutoff有明确推荐检测阳性判断值6WHO guidelines for screening and
3、 treatment of precancerous lesions for cervical cancer prevention. World Health Organization 2013l 阳性判断值（Cutoff）的设定，在2013年的WHO宫颈癌筛查和管理指南中是有具体建议的，其推荐高危型HPV 检测cut-off 值1.0 pg/mlHPV检测的目的是什么？HPV检测的目的是什么？HPV检测的目的是什么？7n 不再是单纯的病毒检测，而是强调“临床”，不再是制造商说了算，而是临床说了算n 阳性判断标准是要获得理想临床敏感度和特异度的临界值，制造商不能仅凭简单的病毒检测数据来制定，建
4、议使用ROC曲线的方式进行评估，这需要大量临床检测数据才能最终找到理想的临界值2015年年CFDA针对HPV检测试剂阳性判断值的规定：临床灵敏度特异度的临床灵敏度特异度的Cutoff值值HPV检测的目的是什么？82015年欧洲IPV大会：宫颈癌筛查HPV检测目的l HPV检测不是为了检测病毒，不是一过性感染，而是检测感染病毒后的进展风险l HPV检测需要关注临床敏感度，最大化的保护低风险人群，最大化的辨别高风险人群2015 IPV Conference，Mark. Stoler2016年CSCCP会议Greater China Commerical Summit9n HPV检测不是仅仅为了检出
5、检测不是仅仅为了检出HPV感染，而是为了发现已经存在的感染，而是为了发现已经存在的CIN2+病变和预测病变和预测CIN2+的风险；的风险；n 对于对于HPV检测来说，最重要的是临床灵敏度和阴性预测值检测来说，最重要的是临床灵敏度和阴性预测值HPV检测的目的是什么？WHO / IRAC 明确检测13种HPVTitle, Location, Date10n 从流行病学和致癌机制证据方面，WHO/IRAC 明确检测13种HPV型别：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68最强的致癌型别，几个致癌位点已经明确充足流行病学证据证实会导致宫颈癌缺乏宫颈癌流行病学证
6、据，但从致癌机制上有强的证据支持2009 WHO IARC Special Report Policy A review of human carcinogens Part B2015年中国CFDA明确HPV检测型范围11 高危型13种：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 若可检测的HPV基因型别不能涵盖上述13种高危型，则可能造成阴性预期值无法达到临床要求，因此不能用于宫颈癌筛查。-不能少！另外最多可包含5种不确定风险的HPV型别 可包含不确定其风险的“中等风险型”5种：HPV26、53、66、73、82宫颈癌相关检测必须包含13种高危HPV型
7、别n HPV检测型别太少的产品如只检测5种种型别、2种种型别（如HPV16/18）等，将不能再注册HPV检测的目的是什么？HPV检测的目的是什么？Title, Location, Date12 如申报的宫颈癌相关HPV核酸检测产品涉及上述18种以外的其他HPV基因型，则需提出明确理由和依据 且应得到国际有关权威机构的文献支持。限制申报其他型HPV 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查 若申请人提出低危型HPV检测相关产品注册，则应详细解释其临床意义和适应症，并提供充分的证据 。限制申报低危型HPVn 不能盲目的追求过多的HPV检测型别n 不建议将低危型HPV检测用于宫颈癌筛查中国CFDA明确
8、限制低危型HPV检测2015最新CFDA指导原则以服务临床为最终目的13设定与临床风险相关的阳性判断标准Cutoff阳性判断值以CIN2+为临床终点的敏感度和特异度临床敏感度、特异度 初筛 联合筛查 ASCUS分流临床适应症一项检测技术，要想满足以上要求，必须基于长时间大量的临床验证才能实现2015年CFDA新的指导原则，从临床目的出发，精确注册标准要求答案： 只是为了查有没有HPV病毒感染？NO 是为了查HPV感染型别，检测型别越多越好？NO 是为了发现已经存在的CIN2+病变和预CIN2+ 的风险 人群？yes14HPV检测的目的是什么？1、HPV检测的目的是什么？2 2、HPVHPV检查
9、的最佳方法检查的最佳方法？3、德同产品介绍15主要内容HPV检查的最佳方法直接核酸检测（无需PCR实验室）杂交捕获技术 （HC2、DH1、DH2、DH3）酶切信号放大法 （Cervista）核酸扩增后检测PCR类技术（需PCR实验室） 膜杂交法 基因芯片法 反向点杂交法 流式荧光杂交法 荧光探针法HPV DNA检测技术分类HPV检查的最佳方法杂交捕获技术 （HPV检测的金标准）产品德国凯杰的：HC2杭州德同的：DH2、DH317HPV检查的最佳方法杂交捕获技术 的三大优势：1、独特的探针技术：14 种全长 8000RNA 探针，避免因 区域片段（如 L1 区）丢失造成的假阴性2、无需DNA提取
10、，无需核酸扩增，有效避免因环境因素造 成的假阳性3、统一的临 床 判 定 标 准1.0pg/ml，避 免 因方法 学灵敏度过高产生的假阳性，结果重复性好，准确可靠。18HPV检查的最佳方法杂交捕获法独特的探针技术HPV病毒基因组为环状双链DNA，含有8000个碱基对德同德同DH系列系列 HPV 检测检测“全长鸡尾酒全长鸡尾酒”探针技术探针技术HPV188000bp，基于全长，涵盖，基于全长，涵盖HPV DNA所有区域所有区域21212种不同型别探针混合种不同型别探针混合准确，不漏诊准确，不漏诊Cobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)“寡核苷酸探针寡核苷
11、酸探针”技术技术HPV16HPV1812种HR通用探针约200bp，仅基于L1片断， 非全长仅3种探针混合病毒基因缺失、突变会造成漏诊其他国产其他国产PCR方法方法“ 寡核苷酸探针寡核苷酸探针”技术技术13种HR通用探针约100-150bp，仅基于L1片断， 非全长仅1种通用探针病毒基因缺失、突变会造成漏诊HPV1612种HR通用探针德同德同DHDH系列系列HPV 检测“全长鸡尾酒”探针技术Title, Location, DateCobas HPV& Abbott HPV(12+2 Real-time PCR)“寡核苷酸探针寡核苷酸探针”技术技术其他国产其他国产PCR方法方法 “寡核苷酸探针
12、寡核苷酸探针”技术技术基于CIN2/3/癌症的病例数1,500%PCR median 82%HC2 median 94%“L1片段的缺失并不普遍，但是任何变异或缺失都会造成PCR的检测结果为阴性” Unger et al JHC 1998, 46(4): 535-540“L1片段是病毒衣壳蛋白，在HPV病毒引发的肿瘤进展过程中是不必要的，因此很可能在HPV整合过程会导致L1片段的缺失” Capone et al, Clin Cancer Research 2000, 6:4171-4175“5%的癌症和CIN3会因为HPV L1片段的缺失而无法被检测出来” Lorincz (Methods f
13、or HPV Detection) ; Emerging Issues on HPV Infections: From Science to Practice, Monsonego 2006HPV 病毒基因L1片段缺失PCR中中-球蛋白的竞争球蛋白的竞争-globin-globin-globin-globin-globin-globin-globinHPVHPVHPVHPVHPVHPVHPV-globinHPVHPV-globin反应过程中的竞争会导致假阴性结果反应过程中的竞争会导致假阴性结果“-球蛋白和HPV以共同引物L1片段进行扩增，这样会降低HPV检测的敏感度”Coutlee et al
14、. JCM 2002; 40(3): 902-907PCR导致假阴性的原因 不同HPV型别扩增效率不同 如果L1片段缺失，检测失败 (整合型HPV) 通用引物会和低危型HPV结合，抑制了目标高危型别的扩增 内指控（Beta-globin）会抑制HPV扩增 样本抑制 (有5的样品丢失因出现抑制而无法扩増)PCR检测可能导致假阳性结果u检测与临床不相关的感染u样本间的污染缺乏统一的判定标准结果受主观因素影响杂交捕获PCR经临床验证的同一判定标准1.0pg/ml仪器判读、结果客观可靠统一的判定标准HPV检查的最佳方法为何要明确“临床灵敏度和临床特异度的Cutoff值”？262015 IPV Conf
15、erence，Mark. Stoler参考参考2015年世界年世界IPV大会：大会：n理想的临床灵敏度和特异度的临界值（Cutoff），即及能够保证对CIN2的病人具有非常高的检出率的同时，又可以避免因分析敏感度过高而造成的假阳性n临床敏感度与疾病进展风险挂钩n分析敏感度与是否存在病毒感染挂钩：PCR过于敏感的分析敏感度，会将病毒含量的人判断为阳性HPV检查的最佳方法Adapted from Snijders et al. Journal of Pathology 2003; 201:1-6分分HPVHPV检查的最佳方法检查的最佳方法析敏感度与临床敏感度析敏感度与临床敏感度n 杂交捕获 HPV
16、 DNA检测为阴性时并不代表体内没有HPV，表明样品中HPV含量不足5000拷贝.n 杂交捕获 HPV DNA检测为阳性时（高于以上标准）可以预测未来8-10内患CIN2/3或者进展为更高级别病变的风险n 短暂及一过性的感染会通过自身免疫力清除n PCR 方法检测HPV的分析敏感度可能 10 拷贝区别：分析敏感度与临床敏感度区别：分析敏感度与临床敏感度分析敏感度PCR 方法的分析敏感度达到10个拷贝/ml阳性结果：可能没有临床相关性临床敏感度杂交捕获的分析阈值经临床验证为 5,000 个拷贝/ml经临床证实：高度的阴性预测值q 样本中能检测出的病毒最低水平q 也被称作检测极限 (LOD)q 统
17、计学意义：检测结果与零的区分q 以临床病变为终点指征，检测出高度病变的敏感度 (CIN3+ / SCC)q 初筛时，能够检测出CIN2或宫颈癌的比例q 分析阈值必须得到严格的验证HPV检查的最佳方法杂交捕获技术 （HPV检测的金标准）产品德国凯杰的：HC2杭州德同的：DH2、DH329HPV检查的最佳方法1、HPV检测的目的是什么？2、HPV检查的最佳方法？3 3、德同产品介绍、德同产品介绍30主要内容杭州德同杭州德同DHDH系列产品系列产品 利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理在分子水平检测WHOWHO认可的14种高危型-HPV 病毒DNA 最新“2+12型”检测设计(HPV16/ 18
18、与其他12种型别检测)德同产品原理-新一代杂交捕获技术DH2HPV-16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68DH3HPV-16, 18HPV-31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68杭州德同杭州德同DHDH系列产品系列产品具有48T、96T两种规格半自动检测仪器全自动检测仪器杭州德同杭州德同DHDH系列产品检测仪器系列产品检测仪器DHDH产品与产品与HC2HC2的临床比对的临床比对临床比对HC2合计Kappa系数(95%CI)阳性阴性DH2阳性98049840.9864（97
19、.70%-99.58%）阴性4415419合计9844191403阳性符合率（95%CI）99.59%（98.96%-99.89%）阴性符合率（95%CI）99.05%（97.57%-99.74%）总符合率（95%CI）99.43%（98.88%-99.75%）临床比对HC2合计Kappa系数(95%CI)阳性阴性DH3阳性97179780.9662（95.14%-98.09%）阴性13413426合计9844201404阳性符合率（95%CI）98.68%（97.75%-99.29%）阴性符合率（95%CI）98.33%（96.60%-99.33%）总符合率（95%CI）98.58%（97.
20、81%-99.13%）孙小伟等，中华肿瘤防治杂志 2016年2月 第23卷 第3期 137-140河南新密河南新密“两癌两癌”筛查项目筛查项目DH2对CIN2+的检出率显著高于巴氏涂片和VIA/VILICobas HPVDH3 HPVP valueCIN2+Sensitivity123/135(91.1%,85.0-95.3)126/135(93.3%,87.7-96.9)0.650Specificity9667/10534(91.8%,91.2-92.3)9604/10534(91.2%,90.6-91.7)0.120PPV123/990(12.4%,10.4-14.6)126/1056(1
21、1.9%,10.0-14.0)0.736NPV9667/9679(99.9%,99.8-99.9)9604/9613(99.9%,99.8-100)0.663CIN3+Sensitivity77/83(92.8%,84.9-97.3)81/83(97.6%,91.6-99.7)0.277Specificity9673/10586(91.4%,90.8-91.9)9611/10586(90.8%,90.2-91.3)0.135PPV77/990(7.8%,6.2-9.6)81/1056(7.7%,6.1-9.4)0.934NPV9673/9679(99.9%,99.9-100.0)9611/96
22、13(99.9%,99.9-100)0.175临床试验显示：DH3具有与Cobas相同预测高级别病变的效能浙江龙游浙江龙游1066910669名健康妇女名健康妇女接受接受CobasCobas和和DH3DH3筛查结果比对筛查结果比对Cobas HPVDH3 HPVP valueCIN2+Sensitivity108/135(80.0%,72.3-86.4)114/135(84.4%,77.2-90.1)0.426Specificity10143/10485(96.7%,96.4-97.1)10111/10485(96.4%,96.1-96.8)0.238PPV108/450(24.0%,20.1
23、-28.2)114/488(23.4%,19.7-27.4)0.818NPV10143/10170(99.7%,99.6-99.8)10111/10132(99.8%,99.7-99.9)0.470CIN3+Sensitivity73/83(88.0%,79.0-94.0)78/83(94.0%,86.5-98.0)0.279Specificity10160/10537(96.4%,96.1-96.8)10127/10537(96.1%,95.7-96.5)0.245PPV73/450(16.2%,12.9-20.0）78/488(16.0%,12.8-19.5)0.929NPV10160/10170(99.9%,99.8-100.0)10127/10132(100.0%,99.9-100)0.302临床试验显示：DH3与Cobas预测高级别的效能相似浙江龙游浙江龙游1066910669名健康妇女名健康妇女HPV16/18HPV16/18分型检测用于宫颈癌初筛分型检测用于宫颈癌初筛Cobas/DH3Cobas/DH3效能的比较效能的比较
