1、项目六项目六接种、分离纯化与培养接种、分离纯化与培养学习目标学习目标 了解微生物的遗传和变异了解微生物的遗传和变异 熟悉微生物保藏的原理和方法熟悉微生物保藏的原理和方法 掌握微生物接种、分离与培养的掌握微生物接种、分离与培养的方法方法微生物的遗传和变异微生物的遗传和变异遗传遗传：变异：变异：微生物遗传和变异的物质基础：微生物遗传和变异的物质基础：染色体染色体质粒质粒微生物变异的类型：微生物变异的类型：表型变异表型变异遗传型变异遗传型变异 环境发生变化环境发生变化 DNA DNA发生变化发生变化 暂时暂时 长久长久 可逆可逆 不可逆不可逆 不可遗传不可遗传 可遗传可遗传 微生物变异的原因：微生物
2、变异的原因：突变突变基因基因突变：突变：染色体染色体畸形：畸形：DNADNA链上的一对或少数几对碱链上的一对或少数几对碱基发生置换、插入或丢失引起基发生置换、插入或丢失引起的，是的，是DNADNA小损失。小损失。大段大段DNADNA的缺失、重复、的缺失、重复、倒位、异位和染色体数倒位、异位和染色体数目的改变，是目的改变，是DNADNA大的大的损失损失突变特性：可遗传性、可逆性、稀少性、独突变特性：可遗传性、可逆性、稀少性、独立性、不对应性、自发性、诱发性立性、不对应性、自发性、诱发性微生物变异的原因：微生物变异的原因：基因重组：两个不同微生物个体的基因重组：两个不同微生物个体的基因通过基因通过
3、DNADNA分子的转化、转导、溶分子的转化、转导、溶源转变、接合、原生质融合等方式，源转变、接合、原生质融合等方式，将一个个体的基因转移到另外一个将一个个体的基因转移到另外一个个体的细胞内个体的细胞内，使两个不同细胞基，使两个不同细胞基因重新组合产生出新的因重新组合产生出新的DNADNA分子的过分子的过程程菌种的选育菌种的选育育种育种方法方法自然育种自然育种诱变育种诱变育种杂交育种杂交育种代谢控制育代谢控制育种种基因工程基因工程菌种的衰退、复壮和保藏：菌种的衰退、复壮和保藏：1.1.菌种的衰退菌种的衰退菌落和细胞菌落和细胞形态的改变形态的改变生长缓慢、生长缓慢、产孢子越来越少产孢子越来越少代谢
4、产物生产能力代谢产物生产能力或对寄生能力的下降或对寄生能力的下降衰退的原因衰退的原因（1 1）基因突变）基因突变 菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。当控制产量的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基的基因发生负突变，就会引起产量下降；当控制孢子生成的基因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌因发生负突变，则使菌种产孢子的性能下降等。一般而言，菌种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群种的退化是一个从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体中只有个别细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效体中只有个别
5、细胞发生负突变，这时如不及时发现并采用有效措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展措施，就会造成群体中负突变个体的比例逐渐增高，最后发展成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，成为优势群体，从而使整个群体表现出严重的退化现象。因此，突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群突变在数量上的表现依赖于传代，即菌株处于一定条件下，群体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性体多次繁殖，可使退化细胞在数量上逐渐占优势，于是退化性状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。状的表现就更加明显，逐渐成为一株退化了的菌体。 （2 2）分离现象）分离现象
6、 通过遗传育种获得的多核（或是单核）通过遗传育种获得的多核（或是单核）菌种，由于其菌种，由于其DNADNA双链中仅一条单链发生突双链中仅一条单链发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。变，随着传代，其生产性状也将发生退化。这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身这种退化是由于诱变获得的高产菌株本身不纯，高产突变只发生在一个核和一条不纯，高产突变只发生在一个核和一条DNADNA单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因单链上，随着细胞分裂，核发生分离，因而突变基因与未突变基因发生分离，于是而突变基因与未突变基因发生分离，于是就出现了突变的高产菌株和未突变的低产就出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。
7、菌株。 （3 3）环境条件）环境条件 环境条件是影响菌种退化的一个重要环境条件是影响菌种退化的一个重要原因。如培养条件对菌种退化的影响，可原因。如培养条件对菌种退化的影响，可用糖化酶产生菌泡盛曲霉来说明。泡盛曲用糖化酶产生菌泡盛曲霉来说明。泡盛曲霉经诱变得到的突变株，在霉经诱变得到的突变株，在3 3种不同培养基种不同培养基上连续传代上连续传代1010次，发现不同培养基和传代次，发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量有不同影响。次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量有不同影响。环境温度也是影响菌种退化的重要因素，环境温度也是影响菌种退化的重要因素，例如，温度高，基因突变率也高；温度低，例如，温度高，
8、基因突变率也高；温度低，则突变率也低，因此菌种保藏的重要措施则突变率也低，因此菌种保藏的重要措施就是低温。就是低温。防止衰退防止衰退的方法的方法控制传代的次数控制传代的次数创造良好的培养条件创造良好的培养条件合理的育种合理的育种 （1 1）合理的育种）合理的育种 选育菌种时，应尽可能使用孢子或单核菌选育菌种时，应尽可能使用孢子或单核菌株，株，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量，以减少分离回复现象的发生；同时，类和剂量，以减少分离回复现象的发生；同时，在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证所获得的保藏菌
9、种的纯度。这些可有效以保证所获得的保藏菌种的纯度。这些可有效地防止菌种的退化。地防止菌种的退化。 （2 2）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境）选择适合菌种生长的培养条件和外界环境 菌种培养基的培养条件应适宜，才能使菌种菌种培养基的培养条件应适宜，才能使菌种生长健壮，减少退化的发生。生长健壮，减少退化的发生。营养不足和过于丰营养不足和过于丰富对菌种生长均不利。栖土曲霉富对菌种生长均不利。栖土曲霉3.9423.942在培养时，在培养时，发现培养温度从发现培养温度从28283030提高到提高到33333434，可防，可防止它产孢子能力的退化。止它产孢子能力的退化。 此外，由于微生物生长过程积累的
10、有害代此外，由于微生物生长过程积累的有害代谢产物，也会引起菌种退化，故不应使用陈旧的谢产物，也会引起菌种退化，故不应使用陈旧的培养物作为种子培养。培养物作为种子培养。 （3 3）控制传代次数）控制传代次数 由于微生物存在着自发突变，而突变都由于微生物存在着自发突变，而突变都是在繁殖过程中发生而表现出来的，所以应是在繁殖过程中发生而表现出来的，所以应尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的尽量避免不必要的移种和传代，并将必要的传代降低到最低限度，以减少发生自发突变传代降低到最低限度，以减少发生自发突变的几率。的几率。菌种传代次数越多，产生突变的几菌种传代次数越多，产生突变的几率就越高率就越高，因而
11、菌种发生退化的机会就越多。，因而菌种发生退化的机会就越多。对于生产菌种，要尽可能利用它们的有效保对于生产菌种，要尽可能利用它们的有效保藏期，可以采取一次接种足够数量的原种进藏期，可以采取一次接种足够数量的原种进行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。行保藏，在整个保藏期内使用同一批原种。 （4 4）采用有效的菌种保藏方法）采用有效的菌种保藏方法 用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性用于工业生产的一些微生物菌种，其主要性状都属于数量性状，而这类性状恰好是最容易退状都属于数量性状，而这类性状恰好是最容易退化的。因此，在实验室或生产上，选用合适的菌化的。因此，在实验室或生产上，选用合适的菌种保藏方法
12、也可以有效防止菌种的退化。种保藏方法也可以有效防止菌种的退化。 （5 5）对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够）对菌种可能遭受病毒的感染应保持足够的警惕的警惕 对有疑问的菌种要及时检验，确定已感染病对有疑问的菌种要及时检验，确定已感染病毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性毒，尤其是病毒粒子含量大，菌丝体及子实体性状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。状已受到严重影响的菌种，应及时淘汰。 退化菌种的复壮退化菌种的复壮 菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定优势后，菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定优势后，所表现出群体性能变劣的现象。所表现出群体性能变劣的现象。因此，在已经退化的群体因此
13、，在已经退化的群体中，仍有一定数量尚未退化的个体。中，仍有一定数量尚未退化的个体。 狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已经发生退化的情况下，通过是指在菌种已经发生退化的情况下，通过纯种分离和筛选，从已经退化的群体中筛选出尚未退化的纯种分离和筛选，从已经退化的群体中筛选出尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状的措施。而个体，以达到恢复菌种的原有典型性状的措施。而广义的广义的复壮复壮是在菌种的典型特征或生产性状未退化前，就经常而是在菌种的典型特征或生产性状未退化前，就经常而有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
14、由此可见，狭义的复壮是一种选择到自发的正突变个体。由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮才是一种积极的措施。具体的消极的措施，而广义的复壮才是一种积极的措施。具体的菌种的复壮措施如下：菌种的复壮措施如下：复壮方法复壮方法纯种纯种分离分离粗放型：菌落纯粗放型：菌落纯精细型：细胞纯精细型：细胞纯通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体1 1纯种分离法纯种分离法 纯种分离法是指通过纯种分离和性能纯种分离法是指通过纯种分离和性能测定，从已经退化的菌种群体中把仍保持测定，从已经退化的菌种群体中把仍保持原有原有典型优良性状的个体分离出来典型优良性状的个体分离出来。在
15、进。在进行纯种分离前，可将待分离的退化菌种先行纯种分离前，可将待分离的退化菌种先接触一些恶劣环境，如药物、低温、高温接触一些恶劣环境，如药物、低温、高温等，往往可以起到等，往往可以起到淘汰生活力弱、留下强淘汰生活力弱、留下强壮菌株的作用壮菌株的作用，因而能提高纯种分离的效，因而能提高纯种分离的效果。果。 2 2通过宿主进行复壮通过宿主进行复壮 对于一些寄生型微生物，特别是一些病原菌，对于一些寄生型微生物，特别是一些病原菌，长期在实验室人工培养会发生致病力降低的退化。长期在实验室人工培养会发生致病力降低的退化。可将退化菌株接种到相应宿主体内以提高菌株的可将退化菌株接种到相应宿主体内以提高菌株的活
16、力。活力。 3 3淘汰已退化的个体淘汰已退化的个体 有人发现，若对细黄链霉菌有人发现，若对细黄链霉菌“5406”5406”农用抗农用抗生素的分生孢子采用生素的分生孢子采用-10-10-30-30的低温处理的低温处理5 57d7d，使其死亡率达到使其死亡率达到80%80%左右。结果会在抗低温的存活左右。结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到了复壮的效个体中留下未退化的个体，从而达到了复壮的效果。果。菌种保藏菌种保藏 原理：原理：根据不同菌种的生理、生化特点，根据不同菌种的生理、生化特点，创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态 方法：方法：首先要挑选
17、优良纯种、休眠体，其首先要挑选优良纯种、休眠体，其次创造良好的环境条件（干燥、低温、缺次创造良好的环境条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂）氧、缺乏营养、添加保护剂、酸度中和剂） 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：A A 斜面冰箱保藏法（酵母）斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在44冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月。冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月
18、。B B 石蜡油封存法（酵母）石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。存期约一年左右。三、菌种保藏的方法C C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法是
19、：芽孢的微生物。它的制备方法是： 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为例为l l2l2l混合均匀，分装于小试管中，装料高度混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为约为1 1厘米左右，厘米左右，121121C C间歇灭菌三次，灭菌试验合间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用格后烘干备用。一般沙用8080目过筛，土用目过筛，土用3030100100目目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵抽
20、干，放在冰箱内保存。一般真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为保存期为1 1年左年左右。右。 D真空冷冻干燥保藏法（真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌 ） 真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度下（原理是在较低的温度下（1515），快速将细胞冻结，并且保），快速将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，因此，菌种可
21、以保存很长时间，一般一般5 5年左右年左右。这种保藏方法。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。应用。这种方法的基本操作过程是先将微生物这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，制成悬浮液，再与保护再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安
22、瓿管真空熔封，并低温保藏。并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏。型，防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定在上面。使微生物疏松地固定在上面。E E 液氮超低温保藏法（细菌，真菌）液氮超低温保藏法（细菌，真菌） 液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的
23、微生物保藏法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。a a 原理原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一可达一196196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一（一130130），所以此时菌种的代谢活动已停止，化），所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。学作用亦随之消失。 b b 操作方法及步骤操作方法及步骤（1 1）安瓿管要求
24、安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用9595料或料或GCl7GCl7的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用。塞后灭菌，烘干后备用。（2 2）菌种准备及分装菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为1010甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安
25、瓿管的装量为管中，一般安瓿管的装量为0.20.21mL1mL。（3 3）冻结）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。冷形成冰晶而伤害细胞。 美国美国 ATCCATCC采用先将菌液降温到采用先将菌液降温到00，再以每分钟降低，再以每分钟降低11的速度，一直降低到的速度，一直降低到3838，然后才把装有菌液的安瓿管，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，放入液氮罐的气相中。由
26、于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮常常注意液氮的残存量，定期补加。的残存量，定期补加。（4 4）重新培养）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或从冰箱中取出，室温或35354040水浴中迅速解冻，当升温至水浴中迅速解冻，当升温至00时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。 我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。保藏方保
27、藏方法法主要原主要原理理设备条件设备条件适宜菌适宜菌种种保藏保藏期期特点特点斜面低斜面低温保藏温保藏法法低温低温44冰箱冰箱各大类各大类3636个月个月简便、短时、易污简便、短时、易污染退化染退化液体石液体石蜡保藏蜡保藏法法低温、低温、缺氧缺氧44冰箱、冰箱、无菌石蜡无菌石蜡油油各大类各大类1212年年简便、短时、需直简便、短时、需直立放置立放置砂土保砂土保藏法藏法低温、低温、干燥干燥 、缺营养缺营养44冰箱或冰箱或室温室温产孢子产孢子类类110110年年简便有效、较长时，简便有效、较长时，易退化变异易退化变异冷冻干冷冻干燥保藏燥保藏法法低温、低温、干燥、干燥、缺氧缺氧保护剂、保护剂、整套冷冻
28、整套冷冻设备设备各大类各大类515515年年长时高效、繁杂技长时高效、繁杂技术要求高术要求高斜面培养基接种法斜面培养基接种法 原理：主要用于接种纯菌，使其增殖后用原理：主要用于接种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种，可以挑取平板培养基于鉴定或保存菌种，可以挑取平板培养基上的纯培养物上的纯培养物或挑取斜面、肉汤中的纯或挑取斜面、肉汤中的纯培养物按无菌操作的要求接种到斜面培养培养物按无菌操作的要求接种到斜面培养基上，是进行菌种扩大培养、菌种保藏等基上，是进行菌种扩大培养、菌种保藏等任务的最常用的方法。任务的最常用的方法。操作步骤操作步骤物品清点物品清点与摆放与摆放超净工作台超净工作台的消毒的消毒手
29、消毒手消毒接种接种琼脂平板划线分离法琼脂平板划线分离法 基本原理基本原理 A 平板分离法普遍用于微生物的分离与纯平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化化 B 微生物在固体培养基上生长形成的单个微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，通菌落是由一个细胞繁殖而成的集合体，通过在平板上划线可得到单个菌落，因此，过在平板上划线可得到单个菌落，因此，可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物可通过挑取但菌落而获得一种纯培养物操作步骤操作步骤融化培养基融化培养基倒平板倒平板做分区标记做分区标记分区划线操作分区划线操作恒温培养恒温培养挑取挑取菌落菌落清理清理涂布分离法涂布分离法 基本原理基
30、本原理 涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液，涂布分离法是指取少许梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平用无菌涂布器把军也均匀地涂布在整个平板表面，禁培养或，在平板培养基表面会板表面，禁培养或，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移至斜面，经培养后保存型的代表移至斜面，经培养后保存 适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离适合好氧菌或有气生菌丝的放线菌的分离与计数与计数操作步骤操作步骤倒平板倒平板菌液稀释菌液稀释涂布平板涂布平板平板培养平板培养挑取单挑取单菌落菌落滴加菌液滴加菌液
