1、第三章第三章 农药残留分析的前处理技术农药残留分析的前处理技术3.1 样品制备目的和原理样品制备目的和原理 3.2 样品制备常规技术样品制备常规技术 3.3 样品制备新技术样品制备新技术3.1 样品制备的目的和原理样品制备的目的和原理 样品制备（样品制备（sample preparation）是农药残留分析方法的重要部分。包括从样品中提取残留农药，浓缩提取液和去除提取液中干扰性杂质的分离净化等步骤，是将实验室样品处理成适合测定的检测溶液的过程。 v样品制备的目的样品制备的目的 1）提高灵敏度和降低检测限。）提高灵敏度和降低检测限。 2）提高测试精度。）提高测试精度。 3）提高方法的选择性。（衍
2、生化）提高方法的选择性。（衍生化） 4）延长仪器的使用寿命。）延长仪器的使用寿命。样品制备原理样品制备原理 主要是利用残留农药与样品基质的物理化学特性差异，使其从对检测系统有干扰作用的样品基质中提取分离出来。 农药的极性极性和溶解性溶解性是选择提取和净化条件的重要依据，在残留农药的溶剂提取中常采用“相似相溶相似相溶”原理原理：使用与农药极性相近的溶剂为提取剂，使残留农药在溶剂中达到最大溶解度。 1）极性）极性：共价键电子密度不均衡分布结果产生了键偶极。 常用溶剂的极性大小常用溶剂的极性大小： 己烷（石油醚）苯乙醚氯仿二氯甲烷丙酮乙酸乙酯乙腈二甲亚砜甲醇水 2）溶解性）溶解性 指农药在水相和有机
3、相中的溶解能力。 溶解度的大小很大程度上取决于农药分子所含官能团的种类、数量、溶剂的性质和其他外部因素。 农药的水溶性还受温度、含盐量、有机质、PH值的影响。3.2 样品制备常规技术样品制备常规技术提取技术提取技术 提取（提取（extraction）是指通过溶解、吸着或挥发等方式将样品中的残留农药分离出来的操作步骤，也称为萃取。提取原则提取原则：根据农药理化性质按“相似相溶”原理进行。 溶剂的选择是关键。 1. 溶剂的极性（“相似相溶”原理） 2. 溶剂的纯度（分析纯以上） 3. 溶剂的沸点（4580之间）。v常用的提取溶剂：常用的提取溶剂： 石油醚、正己烷、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲
4、醇、水等v提取方法提取方法- 振荡提取法振荡提取法v振荡浸提法是最常用的一种方法。它是将样品粉碎后置于具塞三角瓶中，加入一定量的提取溶剂，用振荡器振荡13次，每次振荡0.51h，过滤出溶剂后，再用溶剂洗涤滤渣一次或数次，合并提取液后进行浓缩净化。v适用于土壤、谷物等 样品中农药的提取。组织捣碎法组织捣碎法v组织捣碎法也是一种常用的方法。它是将样品先进行适当的切碎，再放入组织捣碎机中，加入适当的溶剂，快速捣碎35min，过滤后进行浓缩净化。v适用于蔬菜、水果等新鲜动植物组织 样品中农药的提取。超声波法超声波法v目前一般是用超声波清洗超声波清洗机来进行超声波提取。在超声波清洗槽中装入一定量的水，将
5、装有样品和提取溶剂的玻璃瓶放入其中，提取溶剂的液面要与槽中水面齐平。索式提取法索式提取法v用适当的提取溶剂在索式提取器中连续回流提取几小时，获得提取液。v提取效率高，但耗时长8h以上）v适用于匀浆法等难提取样品中 残留农药的提取或是作为其他 提取方法提取效率的参照标准。 不适合于热不稳定农药的提取。 吹扫捕集法吹扫捕集法v主要用于水样中挥发性有机物的分析。v主要构件有吹沸器、捕集管，气相色谱仪v操作步骤： 吹沸 捕集 解吸 GC分析v常用的二相溶剂对二相溶剂对系统有：乙酸乙酯-水、二氯甲烷-水，石油醚-水、石油醚-丙酮等。v液液分配提取效率的高低取决于化合物与提取溶剂的亲和性亲和性、二相的体积
6、比二相的体积比和提取次数提取次数三个因素。v影响提取效率的因素影响提取效率的因素： 1. 提取溶剂的选择 2. 水相的盐浓度 3. 水相的PH值乳化现象乳化现象 有机相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因有机相、水相、乳化物和外力是乳化形成的主要因素。素。 破除乳化的方法破除乳化的方法：v离心(2000rpm，2min）v过滤（滤纸或无水硫酸钠）v在水相中加入一定量的盐（氯化钠或其水溶液）v加入少量不同的有机溶剂（无水乙醇） v在振摇时，采用轻缓地向一个方向振摇的方式。 净化技术净化技术 净化（cleanup）是指通过物理的或化学的方法除去提取物中对测定有干扰作用的杂质的过程。主要是利用分析
7、物与基体中干扰物质的理化特性的差异，将干扰物质的量减少到能正常检测目标残留农药的水平。主要干扰杂质及性质主要干扰杂质及性质类别化合物及其性质脂类色素蜡质肽、氨基酸碳水化合物木质素脂肪、油脂（动物动物样品），不溶于水，溶于多少有机溶剂叶绿素、叶黄素、胡萝卜素等（植物植物样品），不溶于水，能溶于乙醇、丙酮丙酮和石油醚石油醚蜡质（许多蔬菜蔬菜），易溶于有机溶剂含氮氮，对NPD、FPD检测器有干扰糖、淀粉等，对低挥发性和高水溶性农药有干扰酚类及其衍生物，影响氨基甲酸酯类和苯氧羧酸类农药酚类代谢物的分析常用净化方法常用净化方法v柱层析法柱层析法v浓硫酸处理法浓硫酸处理法（水解脂类和色素，如净化含有机氯类
8、样品）v低温冷冻（低温冷冻（-80）法）法（净化动物样品，除去脂肪和某些色素）柱层析法柱层析法 柱层析法是应用最普遍的传统净化方法。 原理是将提取液中的农药和杂质一起通过一支装有吸附剂吸附剂的层析柱，它们即被吸附在具有表面活性的吸附剂上，然后用溶剂进行淋洗，以达到目标物与杂质分离的目的。 吸附剂的基本要求吸附剂的基本要求：具有较大的比表面比表面；适宜的表面孔径和吸附活性吸附活性；粒度分布粒度分布范围尽量窄，并具有一定的强度。常用四种吸附剂的比较常用四种吸附剂的比较吸附剂名称主要成分活性强弱活化处理方法弗罗里硅土弗罗里硅土（Florisil)硫酸镁与硅酸钠作用生成的沉淀物适合脂肪含量高的样品的净
9、化650烘烤3h ，干燥器存放。使用前再于130 活化1-2h。氧化铝氧化铝(alumina)氧化铝（酸性、中性中性、碱性）对色素、脂肪、蜡质有较强吸附能力先550 加热4h，用前130 活化1-2h。加入5%10%重量的水水，混匀，放置过夜。硅胶硅胶硅酸钠溶液加入盐酸而制得的溶胶沉淀物对糖等极性杂质有较强吸附能力先110 加热1h，再加入0%10%重量的水，混匀后使用。活性炭活性炭炭黑对植物色素有很强的吸附能力，对脂肪、蜡质吸附不强常与弗罗里硅土或氧化铝按一定比例配合使用。柱层析法操作步骤：柱层析法操作步骤： v装柱（湿法或干法干法，一般210g）：用适当的溶剂（弱极性）预淋柱子，让柱处于湿
10、润和适于接受溶液的状态。v上样：将用溶剂稀释的样品溶液加在柱上，使样品通过柱子。v洗脱：以洗脱分析物而让杂质保留的溶剂（一般为混合淋洗液）梯度洗脱柱子，回收分析物。样品浓缩技术样品浓缩技术 样品浓缩的目的样品浓缩的目的是使检测溶液中待测物达到分析仪器灵敏度以上的浓度。 常用的浓缩方法有：v 减压旋转蒸发法v K-D浓缩法v 氮气吹干法减压旋转蒸发法减压旋转蒸发法v减压旋转蒸发法减压旋转蒸发法是利用旋转蒸发器在较低温度下使大体积（50500mL）提取液得到快速浓缩的方法，操作方便，但残留农药容易损失，且样品还须转移、定容。v原理是利用旋转浓缩瓶对浓缩液起搅拌作用，并在瓶壁上形成液膜，扩大蒸发面积
11、，同时又通过减压，使溶剂的沸点降低，从而达到高效率浓缩目的。K-D浓缩法浓缩法vK-D浓缩法浓缩法是利用K-D浓缩器直接浓缩到刻度试管中的方法，适合于中等体积(1050mL)提取液的浓缩。v特点特点是可有效减少浓缩过程中农药 的损失，且能直接定容测定，无需 转移样品。但只适用于少量体积的 的样品，且操作较烦琐。 氮气吹干法氮气吹干法v氮气吹干法氮气吹干法是直接利用氮气 流轻缓吹拂提取液及提高水浴 温度，加速溶剂的蒸发速度来 浓缩样品，可以有效防止氧化 反应但只适合于小体积浓缩。 3 样品制备新技术样品制备新技术v固相萃取（固相萃取（solid phase extraction,SPE）v固相微
12、萃取（固相微萃取（ solid phase microextraction，SPME）v基质固相分散（基质固相分散（Matrix SolidPhase Dispersion, MSPD）vQuEChERS 法法v免疫亲和层析（免疫亲和层析（immunoaffinity chromatography, IAC）v凝胶渗透色谱（凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）v加速溶剂萃取（加速溶剂萃取（accelerated solvent extraction, ASE）v超临界流体萃取（超临界流体萃取（supercritical fluid extract
13、ion, SFE）固相提取法（固相提取法（SPE）vSPE利用颗粒细小的多孔固相吸附剂将液体样品中的目标化合物选择性地吸附，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标 化合物的目的。v只能分离性质差别较大性质差别较大的物质。固相萃取分离模式固相萃取分离模式v正相萃取正相萃取：吸附剂极性大于洗脱液极性，用于萃取极性物质。如硅胶、弗罗里硅土、氧化铝、氨基等。 反相萃取反相萃取：吸附剂极性小于洗脱液极性，用于萃取中等极性到非极性化合物。如C18、C8等。 离子交换萃取离子交换萃取：吸附剂都是带有电荷的离子交换树脂，用于萃取带有电荷的化合物。如SAX，SCX等。固相萃取流程固相萃取流程v吸附柱
14、的选择吸附柱的选择：根据待分离对象的特点选择合适的吸附柱。v活化吸附剂活化吸附剂：萃取样品前用适当的溶剂淋洗固相柱。v加样加样：将已经浓缩后的样品采用适当溶剂溶解后加入到吸附小柱上。v洗去干扰杂质洗去干扰杂质：选择合适的淋洗溶剂将干扰杂质先淋洗出小柱，农药保留在小柱中。v洗脱分析物洗脱分析物：选择合适的淋洗溶剂将保留在小柱中的目标农药洗脱出来并收集。 影响萃取效率的因素影响萃取效率的因素 吸附剂选择吸附剂选择：尽量选择与目标化合物极性相似的吸附剂。 淋洗剂选择淋洗剂选择：与目标化合物性质及吸附剂有关。 流速流速：样品溶液的流速一般不超过5mL/min。 固相萃取的优缺点固相萃取的优缺点 高的回
15、收率和富集系数高的回收率和富集系数 不需要大量溶剂不需要大量溶剂 萃取时间短萃取时间短（是液液萃取的1/2） 操作简单操作简单、快速、易实现自动化 缺点缺点：复杂样品有时会堵塞填料空隙； 复杂样品的杂质干扰等固相微萃取（固相微萃取（SPME）vSPME是在SPE基础上发展起来高效的样品预处理技术。它是利用固相提取的方法实现对样品的分离和净化，但所用的固相材料和分离机制不同。vSPME不是将待测物全部分离出来，而是通过残留农药在样品与固相涂层之间的平衡来达到分离目的。v其固相是一支覆盖着一层高聚物固定相（聚丙烯酸酯）的熔融石英纤维。浸入样品中，待测组分扩散吸附到石英纤维表面的涂层，当吸附平衡后，
16、与GC或HPLC联用进行分析测定。固相微萃取流程固相微萃取流程v 吸附吸附：萃取过程中应用磁力搅拌、超声振荡等方式，可缩短达到平衡的时间。v 解吸解吸：高温解吸（GC）或溶剂洗脱（HPLC）v 纤维的老化和清洗纤维的老化和清洗：使用前都需要0.5-4h的老化。 固相微萃取的影响因素固相微萃取的影响因素v固相涂层的性质固相涂层的性质：非极性固相涂层（聚二甲基硅氧烷）；极性固相涂层（聚丙烯酸酯）v液膜厚度液膜厚度：液膜越厚，吸附量越大，但平衡时间越长。v搅拌效率搅拌效率：有利于缩短平衡时间。v温度温度：有利于缩短平衡时间，但会减少吸附量。v盐的作用和溶液酸度盐的作用和溶液酸度：可改变被分离物质在水
17、中的溶解度，提高灵敏度。 SPME的优缺点的优缺点 操作时间短操作时间短(一般只需15min，是液液萃取的30%) 操作简便操作简便 无需萃取溶剂无需萃取溶剂 所需样品量少 适用范围广泛 缺点缺点：石英纤维非常脆弱，易折断，重复性石英纤维非常脆弱，易折断，重复性较差。较差。基质固相分散萃取基质固相分散萃取（MSPD）vMSPD是将样品与吸附填料（与SPE吸附材料一致）一起混合研磨，得到半干状态的混合物并将其作为填料装柱，然后用不同的溶剂淋洗柱子，将各种待测物洗脱下来。v反相吸附剂，如C8，C18，主要用来分离亲脂性物质v正相吸附剂，用于分离极性较大的农药优点：优点：v样品分析时间短样品分析时间
18、短v溶剂用量少溶剂用量少v避免了避免了样品均化、转溶、乳化等带来的损失样品均化、转溶、乳化等带来的损失缺点：缺点：v取样量小造成检测限较高检测限较高v杂质净化杂质净化方面不不如其他提取技术理想理想QuEChERS 法法vQuEChERS法是利用固相分散材料与样品或样品提取液充分接触，吸附其中的杂质而得到净化的目的，或者是利用固相吸附剂吸附目标分析物，再进行解析而净化。v其核心技术是净化材料或萃取剂能够选择性地吸附样品溶液中的目标化合物或干扰物质，以达到净化样品的目的，PSA优点：优点：v快速、快速、简单、廉价、有效、可靠、安全简单、廉价、有效、可靠、安全（Quick, easy, cheap,
19、effective, rugged and safe）缺点：缺点：vPSA价格较贵，不适合大批量农药残留的检测v 浓缩倍数小，需要灵敏度高的检测仪器，如浓缩倍数小，需要灵敏度高的检测仪器，如UPLC-MS-MS免疫亲和层析（免疫亲和层析（IAC）vIAC是以抗原抗体抗原抗体中的一方作为配基，亲和吸附另一方的分离系统。是将抗体与惰性微珠惰性微珠（如，琼脂糖、，琼脂糖、纤维素纤维素）共价结合，然后装柱，将抗原溶液过免疫亲和柱，非目标化合物不保留，最后用洗脱缓冲液洗脱抗原，从而得到纯化的抗原。 免疫亲和层析流程免疫亲和层析流程v 装填亲和层析柱装填亲和层析柱v 加样本加样本v 样本和抗体反应样本和抗
20、体反应v 洗去未结合的物质洗去未结合的物质v 再洗去疏松结合的物质再洗去疏松结合的物质v 洗脱和抗体紧密结合的部分洗脱和抗体紧密结合的部分免疫亲和柱的优缺点免疫亲和柱的优缺点v特异性强、净化效率高特异性强、净化效率高v过程简单、统一过程简单、统一缺点：缺点：v载体价格昂贵载体价格昂贵v特异性抗体难得特异性抗体难得凝胶渗透色谱（凝胶渗透色谱（GPC） GPC又称为体积排阻色谱，是按溶质分子的大小进行分离的一种色谱技术。其原理是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应进行分离，样品中的大分子先被洗脱出来，小分子后被洗脱出来。v凝胶类型凝胶类型： 交联葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20 ) 交联聚
21、苯乙烯凝胶（Bio-Beads S-X）。v溶剂的选择溶剂的选择：所选用的溶剂应该 对目标物有良好的溶解度，并对 凝胶有一定的膨胀力。 常用的洗脱溶剂有：二氯甲烷、 氯仿、乙酸乙酯、己烷等。.优点：优点：v自动化程度高自动化程度高v净化效率高净化效率高v回收率高回收率高v柱子可以重复使用柱子可以重复使用缺点：缺点：小分子的干扰物会与目标化合物一起流出，有时须再增加净化步骤。加速溶剂萃取（加速溶剂萃取（ASE）v1995年，推出的一种新的全自动提取技术。v原理是选择合适的溶剂、通过提高温度(50200)和压力（1.52.0MPa）来加快萃取速度，提高萃取效率。v适用于固体、半固体样品的提取。 特
22、点：所需溶剂少(约15ml/10g)， 快速(20min)，提取效率高。 ASE的装置和流程的装置和流程v装置装置：由：由溶剂瓶、泵、气路、加热炉、萃取池和收集瓶等构成。v流程流程：将样品放入萃取池； 设定程序，自动进行。（泵液、加温加压、萃取5min、收集） 溶剂瓶：4个； 萃取池：24个； 收集瓶：26个 几种萃取技术的比较几种萃取技术的比较技术样品大小/g溶剂体积/mL 平均萃取时间索氏提取1030300500448h超声提取301003000.51h微波提取5300.51h振荡提取103013014hASE103015451220minv已被美国环保局（EPA）选定为推荐的标准方法（E
23、PA 3545, 1999）。优点：优点：溶剂用量少、快速、提取效率高溶剂用量少、快速、提取效率高缺点：缺点：选择性不高，萃取液多采用固相萃取、凝胶渗透色谱等加以净化后再进仪器检测。超临界流体提取法（超临界流体提取法（SFE）vSFE是利用超临界流体（超临界流体（SF）密度大、粘度低、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中的待测物质溶解并从基体中分离出来，同时完成萃取和分离操作的技术。vSF是介于气液之间的一种物质，只能在物质的温度和压力超过临界点事才能存在。在临界点附近，压力和温度的微小变化都可以引起流体密度的很大变化，而超临界流体的溶解度一般随密度的增加而增加。SFE
24、就是利用压力压力、温度温度的变化来实现提取和分离过程的。常用的超临界流体：CO2、NH3、乙烯等。 CO2的优点：密度大，溶解能力强溶解能力强，传质速率高，压压力适中力适中，临界温度临界温度31，便宜易得，无毒，惰性以及极易从提取产物中分离出来等优点，当前绝大部分超临界流体提取都是以它为溶剂。 SFC萃取流程萃取流程 装置装置：CO2储存器、萃取管、萃取池、限流器、收集装置、温度控制装置。 流程流程： CO2改性剂混合室泵泵萃取管收集装置限量器控温系统萃取方式萃取方式：动态、静态、循环循环 SFC影响因素影响因素 压力压力：影响溶解能力溶解能力。 温度温度：影响萃取剂的密度密度和溶质的蒸汽压蒸汽压。 萃取时间萃取时间：与被萃取物质在流体中的溶解度溶解度及其传质速率呈正向相关。 其他溶剂其他溶剂：加入少量极性溶剂可以改变流体对溶质的溶解能力溶解能力。常用改进剂为NH3、NO2，加入量不超过10%。 SFC的优点和不足的优点和不足：适应性广泛、操作简单、提取效率高。集提取、浓缩、净化（分析）为一体。分离过程有可能在接近室温下完成，特别适用于热敏性天然产物。自动化操作且能与其他色谱仪器联用。不足不足：但是必须在高压下操作，设备及工艺技术要求高，投资比较大。
