1、制药工艺学制药工艺学Pharmaceutical Technology重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺第一节第一节 干扰素概述干扰素概述第二节第二节 基因工程假单胞杆菌的构建基因工程假单胞杆菌的构建第三节第三节 干扰素的发酵工艺过程干扰素的发酵工艺过程第四节第四节 干扰素的分离纯化工艺过程干扰素的分离纯化工艺过程第一节 干扰素概述 干扰素的种类干扰素的种类 干扰素的临床应用干扰素的临床应用 干扰素的生产工艺路线干扰素的生产工艺路线概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺1、干扰素、干扰素(interferon，IFN）的种类）的种类 概念：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一概
2、念：机体受到病毒感染时，免疫细胞产生的一组结构类似、功能接近的细胞因子。组结构类似、功能接近的细胞因子。 细胞因子细胞因子: :由机体细胞合成分泌的能调节生理功能、由机体细胞合成分泌的能调节生理功能、参与免疫应答和介导炎症反应等小分子可溶性蛋参与免疫应答和介导炎症反应等小分子可溶性蛋白白 与免疫球蛋白区别与免疫球蛋白区别 。 发现发现:1957:1957年英国国立医学研究所科学家年英国国立医学研究所科学家Isaacs A Isaacs A 和和Lindenmann J,Lindenmann J,研究病毒干扰现象时，发现一种研究病毒干扰现象时，发现一种抑制病毒繁殖的物质。抑制病毒繁殖的物质。概述
3、概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺1 1、天然干扰素的种类、天然干扰素的种类 具有种属特异性具有种属特异性 人源干扰素人源干扰素- -人干扰素人干扰素, ,牛源干扰素牛源干扰素- -牛干扰素牛干扰素, 天然人干扰素分类天然人干扰素分类- -抗原特异性抗原特异性I I型干扰素：型干扰素：IFNIFN、IFNIFN糖基化蛋白糖基化蛋白 、IFN IFN 、IFN IFN 、IFN IFN IIII型干扰素：型干扰素：IFNIFN糖基化蛋白糖基化蛋白 IIIIII型干扰素：型干扰素：IFN-1，IFN-2， IFN-3 氨基酸序列差异分不同亚型：氨基酸序列差异分不同亚型：IFN2aIFN2
4、a、2b2b、1b1b概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺主要天然人干扰素主要天然人干扰素概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺种类种类亚型亚型细胞源细胞源稳定性稳定性产生条件产生条件2424种种白细胞白细胞类淋巴类淋巴细胞细胞pH2 pH2 稳定，稳定，56 56 稳定稳定病毒等诱导病毒等诱导2 2种种成纤维成纤维细胞细胞pH2 pH2 稳定，稳定，56 56 不稳定不稳定病毒等诱导病毒等诱导1 1种种T T淋巴细淋巴细胞胞pH2pH2不稳定不稳定5656不稳定不稳定有丝分裂原有丝分裂原和抗原诱导和抗原诱导人干扰素人干扰素IFN 的结构与理化性质的结构与理化性质165-
5、166165-166个氨基酸组成，对乙醚、氯仿敏感；个氨基酸组成，对乙醚、氯仿敏感；容易吸附在介质上。容易吸附在介质上。CDLPQTHSLGSRRTLMLLACDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRI
6、TLYLKEKSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKELSTNLQESLRSKE概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺天然人干扰素基因天然人干扰素基因概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺基因组测序表明，至少存基因组测序表明，至少存在在17 17 基因和基因和 13 13 假基因假基因2 2、重组人干扰素的种类、重组人干扰素的种类全球约有十几个国家批准基因工程重组人干扰素(Recombinant human interferon, rhuIFN)上市。rhuIFN 、Alfa
7、con-1、rhuIFN 、rhuIFN概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺上市重组人干扰素上市重组人干扰素a a的氨基酸序列的氨基酸序列基因工程干扰素基因工程干扰素a a与天然干扰素与天然干扰素a a的序列区别？的序列区别？概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺2、重组干扰素的临床应用、重组干扰素的临床应用 广谱抗病毒活性（广谱抗病毒活性（rhuIFN及其及其PEG化，化，2a, 2b, alfacon-1, 1b, ） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎 直接抗肿瘤活性（直接抗肿瘤活性（rhuIFN及其及其PEG化
8、）化）毛细胞和慢性髓样白血病、毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金肉瘤、非霍奇金淋巴瘤淋巴瘤 免疫调节活性（免疫调节活性（rhuIFN）慢性肉芽肿瘤慢性肉芽肿瘤 多发性硬化症多发性硬化症rhuIFN概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺3、人干扰素生产工艺路线（、人干扰素生产工艺路线（1）体外诱生干扰素制备工艺：体外诱生干扰素制备工艺： SendaiSendai病毒诱导人白细胞病毒诱导人白细胞血浆血浆人白细胞人白细胞分离纯化分离纯化人白干扰素人白干扰素病毒诱导病毒诱导 1989 1989年：年：IFN-n3/AlferonIFN-n3/Alferon，批准上市，批准上
9、市 缺点：产量低缺点：产量低,1g IFN,1g IFN，需要，需要 3 3亿亿mlml人血白细胞人血白细胞 来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵 潜在的血源性病毒污染的可能性，限制了临床应用潜在的血源性病毒污染的可能性，限制了临床应用 概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺3 3、人干扰素生产工艺路线（、人干扰素生产工艺路线（2 2） 人源转化细胞系培养生产工艺：人源转化细胞系培养生产工艺：NamalwaNamalwa培养培养分离纯化分离纯化病毒诱导病毒诱导类淋巴母细胞，非整倍体类淋巴母细胞，非整倍体19991999年：年：IFN-n1/Well
10、feron, IFN-n1/Wellferon, 批准用于临床。批准用于临床。 优点：首次用细胞培养优点：首次用细胞培养8000L,8000L,实现大规模商业化生产。实现大规模商业化生产。 缺点：缺点： 活性低，退出临床应用。活性低，退出临床应用。合成干扰素合成干扰素多亚型混合干扰素多亚型混合干扰素概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺3 3、人干扰素生产工艺路线（、人干扰素生产工艺路线（3 3） 基因工程大肠杆菌发酵生产工艺基因工程大肠杆菌发酵生产工艺: :上市产品：重组人干扰素上市产品：重组人干扰素rhuIFNrhuIFN 1986 1986，rhuIFN-2arhuIFN-2a
11、， rhuIFN-2brhuIFN-2b； 19901990，rhuIFN-1brhuIFN-1b；19931993，rhuIFN-1brhuIFN-1b； 2001200120022002： PEGPEG化化IFNIFN，PEG-Intron, PEG-Intron, PegasysPegasys 表达产物：无糖基化表达产物：无糖基化 为什么可以制备为什么可以制备rhuIFNrhuIFN、rhuIFNrhuIFN，N-metN-met，无活性包涵体，无活性包涵体 工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。工程菌构建发酵培养包涵体复性重组人干扰素概述概述重
12、组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 7070个密码优化，个密码优化，pT7-huIFNapT7-huIFNa，E coli DH5a, E coli DH5a, 热诱导热诱导 2-L2-L发酵罐，发酵罐， 包涵体占包涵体占40% 40% ，产量产量520mg/L 520mg/L 溶解，再折叠，获得溶解，再折叠，获得300mg/L,300mg/L,收率收率58%58% Srivastava P et al, Protein expression and purification, 2005, 41: 313-322概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺3 3、人干扰素生产工艺路线（
13、、人干扰素生产工艺路线（4 4） 上市产品：rhuIFN -1a1996， Avonex (Biogen)；2002， Rebif (Serono) 表达产物：166 aa 糖基化蛋白，22.5 ku 工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,控制严格工程CHO细胞系构建细胞培养分离纯化重组人干扰素动物无限细胞系培养生产工艺：概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 为什么不用酵母系统生产rhuIFN -1a? 3、人干扰素生产工艺路线（、人干扰素生产工艺路线（5）宿主：腐生型假单胞杆菌（宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonas putidaPseudomonas putida）上市产
14、品：上市产品：IFN -2b/IFN -2b/安福隆安福隆 表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性结构和生物活性基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺工艺特点：工艺特点： 发酵周期短：几个小时发酵周期短：几个小时 无需变性、复性过程，获得有活性产品无需变性、复性过程，获得有活性产品 纯化过程：淘汰抗体亲和层析纯化过程：淘汰抗体亲和层析 基于基于mRNAmRNA的二级结构进行设计，提高产量。对的二级结构进行设计，提高产量。对18nt18nt优化，优化，使使AU
15、GAUG起始密码从长二级结构中暴露出来，构建在起始密码从长二级结构中暴露出来，构建在pETpET载体载体上，在上，在E. coli BL21E. coli BL21中表达，占中表达，占20%20%。Zhang W et al. BBRC, 2006, 349: 69-78概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺4 4、人干扰素生产新技术的研发、人干扰素生产新技术的研发破坏二硫键，提高产量破坏二硫键，提高产量 把把 1和和98位位cys用用serine取代，取代，NaCl 诱导载体，诱导载体，E coli BL21 (SI) 表达水平表达水平: 200 mg/LNeves FO et a
16、l. Protein expression and purification, 2004, 35: 353-359 概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺4、人干扰素生产新技术的研发、人干扰素生产新技术的研发概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 S IB 15 25 30 37 15 25 30 37 密码优化密码优化, ,大肠大肠杆菌杆菌/pET-/pET-rhuIFNa2b,rhuIFNa2b,占总占总蛋白的蛋白的 40%40%不同温度只影响不同温度只影响表达量表达量, ,不影响不影响可溶性可溶性融合表达实现可溶性融合表达实现可溶性与二硫键形成酶基因融合，实用特殊的与
17、二硫键形成酶基因融合，实用特殊的SDSD序列，进序列，进行诱导，实现了重组人干扰素行诱导，实现了重组人干扰素a a的大肠杆菌可溶性的大肠杆菌可溶性表达，占目标蛋白的表达，占目标蛋白的66%66%概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 pET-GST-IFNa (AGA pET-GST-IFNa (AGA 被被 CGCCGC取代取代) ) 部分可溶性，部分包涵体部分可溶性，部分包涵体s s 可溶性可溶性 IFNa 100 mg/LIFNa 100 mg/LRabhi-Essafi I et al. Protein engineering, design and selection, 2
18、007,20:201-207概述概述重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺第二节第二节 基因工程假单胞杆菌的构建基因工程假单胞杆菌的构建1 1、基因工程假单、基因工程假单胞胞杆菌菌种建立杆菌菌种建立2 2、基因工程假单胞杆菌菌种特性、基因工程假单胞杆菌菌种特性3 3、菌种库的建立与保藏、菌种库的建立与保藏工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺1 1、基因工程假单、基因工程假单胞胞杆菌菌种建立杆菌菌种建立第一步：人干扰素第一步：人干扰素-2b-2b基因的克隆基因的克隆第二步：表达载体的构建第二步：表达载体的构建第三步：工程菌的构建第三步：工程菌的构建工程菌构建工程菌构建重
19、组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺第一步：第一步：RT-PCRRT-PCR克隆克隆 制备白细胞，新城疫病毒诱导，分离制备白细胞，新城疫病毒诱导，分离mRNAmRNA。 反录酶合成反录酶合成cDNAcDNA第一链，第一链，KlenowKlenow片段催化片段催化聚合聚合形成形成cDNAcDNA第二条链。第二条链。末端转移酶给末端转移酶给cDNAcDNA加加PolyPoly（dCdC）尾，连接到载体）尾，连接到载体质粒质粒pBR332pBR332上。上。转化大肠杆菌，氨苄青霉素和四环素筛选抗性克转化大肠杆菌，氨苄青霉素和四环素筛选抗性克隆，获得编码人干扰素隆，获得编码人干扰素-2b-2b的基因
20、序列。的基因序列。1 1、人干扰素基因的克隆、人干扰素基因的克隆工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 人干扰素基因座位于第人干扰素基因座位于第9 9号染号染色体，无内含子，可用色体，无内含子，可用PCRPCR方法方法直接克隆。制备白细胞，分离基直接克隆。制备白细胞，分离基因组因组DNA,DNA,设计上下游引物，设计上下游引物，PCRPCR，基因连接质粒基因连接质粒, , 转化转化E.coliE.coli, ,筛筛选鉴定。由于干扰素各亚型之间选鉴定。由于干扰素各亚型之间同源性很高，需要测序确证。同源性很高，需要测序确证。PCRPCR克隆人干扰素基因克隆人干扰素基因工程菌构
21、建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺PCRPCR克隆人干扰素基因克隆人干扰素基因工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺ATGATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAG
22、GACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGGAGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAAATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTAC
23、CAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGTTCTACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATC
24、ACTCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGATGA 501bp501bp，166aa166aa第二步：表达载体构建第二步：表达载体构建 huIFN huIFN基因与宿主载体连接基因与宿主载体连接 转化大肠杆菌转化大肠杆菌 筛选阳性克隆筛选阳性克隆 获得序列正确表达载体获得序列正确表达载体工
25、程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 筛选高表达、稳定遗传筛选高表达、稳定遗传的工程菌的工程菌 获得原始菌种获得原始菌种第三步：工程菌构建第三步：工程菌构建 转化假单胞杆菌转化假单胞杆菌工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺2 2、基因工程菌的特性、基因工程菌的特性（1 1）具有宿主菌的特征：）具有宿主菌的特征： 细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。 菌落：直径菌落：直径2.5-3.0 mm2.5-3.0 mm，灰绿色半透明，灰绿色半透明, ,粘稠。粘稠。 生化特性生化特性: :缬氨酸、精氨酸和苏氨酸为
26、碳源。缬氨酸、精氨酸和苏氨酸为碳源。工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺（2 2）工程菌的特征：）工程菌的特征： SerSer- -， StrStrR R、TetTetR R、AmpAmpR R（3 3）具有生产干扰素能力：）具有生产干扰素能力： 放射性免疫学效价不低于放射性免疫学效价不低于2.02.010109 9 IU/LIU/L。3 3、菌种库的建立与保藏、菌种库的建立与保藏 QC QC：菌种特性、生产能力、质粒稳定性，：菌种特性、生产能力、质粒稳定性， 70 每批主代菌种库均进行划线每批主代菌种库均进行划线LBLB琼脂平板、涂片革兰氏染色、琼脂平板、涂片革兰氏染
27、色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。菌种检查合格后，方可投产。菌种检查合格后，方可投产。原始菌种库原始菌种库主菌种库主菌种库工作菌种库工作菌种库扩大培养，冻干保藏扩大培养，冻干保藏工程菌构建工程菌构建重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺培养，甘油培养，甘油18%18%，冷冻保藏，冷冻保藏第三节第三节 重组人干扰素的发酵工艺过程重组人干扰素的发酵工艺过程 种种子子罐罐培培养养发发酵酵罐罐培培养养菌菌体体收收集集工工作作菌菌
28、种种库库摇摇瓶瓶培培养养 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺1 1摇瓶培养摇瓶培养目的目的: :种子活化与菌种性能恢复种子活化与菌种性能恢复 取保存工作种子批菌种，室温融化取保存工作种子批菌种，室温融化 摇瓶培养：接种后摇瓶培养：接种后,30,30，pH7.0pH7.0，250 r/min250 r/min，18182h2h 检测：检测：ODOD值和发酵液杂菌。值和发酵液杂菌。 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺2 2种子罐培养种子罐培养目的目的: :种子放大，获得足量发酵用优质种子种子放大，获得足量发酵用优质种子接种：接入接种：接入50L50L种子
29、罐，接种量种子罐，接种量10%10%。培养：培养：3030，pH7.0pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速控制：级联调节通气量和搅拌转速 DODO为为30%30%，3 34h4h，OD4.0OD4.0。检测与控制：显微镜和培养基划线检查杂菌。检测与控制：显微镜和培养基划线检查杂菌。 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺3 3发酵罐培养发酵罐培养接种：通入接种：通入300L300L培养基的发酵罐，接种量培养基的发酵罐，接种量10%10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前前4h4h：3030，pH7.0pH7.0，DODO为为30%30%
30、。4h4h后：后：2020，pH6.0pH6.0，DODO为为60%60%，5 56.5h6.5h。终点控制：终点控制：ODOD值达值达9.09.01.01.0，55冷却水快速降冷却水快速降至至1515以下。以下。检测：发酵液杂菌检查检测：发酵液杂菌检查 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺4 4菌体收集菌体收集 连续流离心机：冷却的发酵液，连续流离心机：冷却的发酵液，16000 16000 r/minr/min离心收集。离心收集。 菌体保存：菌体保存：2020冰柜，不超过冰柜，不超过1212个月。个月。 检测：重组人干扰素含量、菌体蛋白含检测：重组人干扰素含量、菌体蛋白含
31、量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。质粒稳定性。 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺5 5发酵工艺控制分析发酵工艺控制分析 发酵中菌体生长与干扰素合成的关系发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.51.5 小时分裂速度最快，到小时分裂速度最快，到3.53.5小时开始下降。小时开始下降。 干扰素迅速合成出现在干扰素迅速合成出现在3.53.5小时之后，在小时之后，在4 4小时小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。达到最大，然后由于降解而迅速下降。 假单胞杆菌的生长
32、和干扰素的生产是半偶联相假单胞杆菌的生长和干扰素的生产是半偶联相关状态关状态 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 基因工程假单胞杆菌的生长需求基因工程假单胞杆菌的生长需求15%15%的溶解氧，的溶解氧，但但70%70%以上的溶解氧才能保证菌体中干扰素以上的溶解氧才能保证菌体中干扰素- -2b2b的大量合成，其产量是的大量合成，其产量是15%15%溶解氧的溶解氧的6 6倍，倍，而菌体生长速率未发生明显变化，质粒稳定性而菌体生长速率未发生明显变化，质粒稳定性也有很大的提高。也有很大的提高。 采用两段培养的策略，分别在生长阶段（采用两段培养的策略，分别在生长阶段（30%DO30
33、%DO）和生产阶段（和生产阶段（60%DO60%DO）采用各自最佳溶解氧浓度，）采用各自最佳溶解氧浓度，以提高干扰素的发酵水平。以提高干扰素的发酵水平。 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺5 5发酵工艺控制分析（溶解氧）发酵工艺控制分析（溶解氧）基因工程假单胞杆菌的生长最适温度与产物基因工程假单胞杆菌的生长最适温度与产物形成的最适温度是不同的。形成的最适温度是不同的。 最佳生长温度则为最佳生长温度则为3030，发酵温度控制在，发酵温度控制在2020可以有效防止干扰素可以有效防止干扰素-2b-2b的降解。的降解。 质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降质粒的稳定性随温度的升高而
34、迅速下降 培养后期降温是提高目标产物积累的重要培养后期降温是提高目标产物积累的重要措施。措施。 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺5 5发酵工艺控制分析（温度）发酵工艺控制分析（温度） pHpH的变化由工程菌代谢、培养基的组成和发的变化由工程菌代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。酵条件所决定。 干扰素干扰素-在低酸性条件下稳定，能耐受在低酸性条件下稳定，能耐受pH pH 2.52.5的酸性环境的酸性环境 在发酵后期降低在发酵后期降低pHpH，使大量蛋白酶失活，减，使大量蛋白酶失活，减少干扰素少干扰素-的水解，提高干扰素的积累量。的水解，提高干扰素的积累量。 前期前期pH7
35、.0pH7.0，后期，后期pH6.0pH6.0 发酵工艺发酵工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺5 5发酵工艺控制分析（发酵工艺控制分析（pHpH）15.4 重组人干扰素的分离纯化工艺过程重组人干扰素的分离纯化工艺过程1 1、干扰素分离工艺过程、干扰素分离工艺过程2 2、干扰素的纯化工艺过程、干扰素的纯化工艺过程分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺1 1、干扰素分离工艺过程、干扰素分离工艺过程 菌体裂解菌体裂解 预处理预处理 初级分离初级分离分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(1)(1)菌体裂解菌体裂解 目的：破碎细胞，释放干扰
36、素，防止降解目的：破碎细胞，释放干扰素，防止降解 裂解缓冲液：纯化水，裂解缓冲液：纯化水，2-102-10（pH7.5pH7.5） 使用保护剂：使用保护剂：EDTAEDTA（抑蛋白制酶的活性）（抑蛋白制酶的活性）/PMSF/PMSF是是丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，保护干扰素丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的抑制剂，保护干扰素被酶水解。巯基试剂如二硫二乙醇，防止干扰素中被酶水解。巯基试剂如二硫二乙醇，防止干扰素中的巯基被氧化形成二硫键。的巯基被氧化形成二硫键。 破碎破碎2020菌体：菌体：2 2厘米厘米 搅拌：加裂解缓冲液，低温下操作，搅拌：加裂解缓冲液，低温下操作，2-102-10，2hr2hr
37、 裂解方法裂解方法: :在缓冲液中，反复冻融，细胞完全破裂。在缓冲液中，反复冻融，细胞完全破裂。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(2)(2)预处理预处理 加絮凝剂聚乙烯亚胺加絮凝剂聚乙烯亚胺: : 2-10 2-10，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。，搅拌，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液加凝聚剂醋酸钙溶液: : 2-10, 2-10,搅拌，对菌体碎片、搅拌，对菌体碎片、DNADNA等进行沉淀。等进行沉淀。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺 连续流离心机：连续流离心机：2-102-10，16000 r/min16000 r/min
38、 收集上清液：含有重组人干扰素收集上清液：含有重组人干扰素 杂质沉淀：杂质沉淀：121121、30min 30min 蒸汽灭菌蒸汽灭菌, ,焚烧处理。焚烧处理。（3 3） 初级分离初级分离 目的：体积大，浓度低，需要浓缩产品目的：体积大，浓度低，需要浓缩产品 措施措施- -盐析盐析: 4M: 4M硫酸铵，硫酸铵，2-102-10，搅匀，静置，搅匀，静置过夜。过夜。 离心：连续流离心机，离心：连续流离心机，16000 r/min16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，聚乙烯瓶中，保存：收集沉淀，粗干扰素，聚乙烯瓶中，44。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺
39、2 2、干扰素纯化工艺过程、干扰素纯化工艺过程 溶解粗干扰素溶解粗干扰素 沉淀与疏水层析沉淀与疏水层析 阴离子交换层析与浓缩阴离子交换层析与浓缩 阳离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 无菌过滤无菌过滤分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(1) (1) 溶解粗干扰素溶解粗干扰素 配制缓冲液：超纯水，配制缓冲液：超纯水，pH7.5pH7.5磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，0.45 m0.45 m滤器和滤器和10 ku10 ku超滤系统，百级层流超滤系统，百级层流下收集。冷却至下收集。冷却至2-102-10。 检查检查: : 缓冲液的缓冲液的pHpH
40、值和电导值，合格方可值和电导值，合格方可使用。使用。 溶解：溶解：2-102-10，匀浆器中，匀浆器中， 完全溶解。完全溶解。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(2) (2) 等电沉淀与疏水层析等电沉淀与疏水层析 等电点沉淀（等电点沉淀（1 1）除去杂蛋白：磷酸调节至）除去杂蛋白：磷酸调节至pH5.0pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液（含有人干扰素）。沉淀杂蛋白，离心收集上清液（含有人干扰素）。 疏水层析除去非疏水性蛋白：用疏水层析除去非疏水性蛋白：用NaOHNaOH调节上清液调节上清液pH7.0pH7.0，并用，并用5M NaCl5M NaCl调节溶液电导值
41、调节溶液电导值180 mS/cm180 mS/cm，上，上样，进行疏水层析，利用干扰素的疏水性进行吸附。样，进行疏水层析，利用干扰素的疏水性进行吸附。 洗脱与收集：在洗脱与收集：在2-102-10下，用下，用0.025M0.025M磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pH7.0pH7.0）1.6M NaCl1.6M NaCl进行洗涤，除去非疏水性蛋进行洗涤，除去非疏水性蛋白。用白。用0.01M0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH8.0pH8.0）进行洗脱，收集进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液，干扰素。干扰素。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(2)(2)等电沉淀与盐析等电沉淀与盐
42、析 等电点沉淀（等电点沉淀（2 2）：磷酸调节）：磷酸调节pH4.5pH4.5，调节，调节电导值电导值40 ms/cm40 ms/cm，2-102-10，静置过夜，静置过夜，除杂蛋白除杂蛋白 超滤：超滤：1000 ku1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液透析除盐：调整溶液pH 8.0pH 8.0，电导值，电导值，10 10 kuku超滤膜，超滤膜，0.005 M0.005 M缓冲液。缓冲液。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(3)(3)阴离子交换层析与浓缩阴离子交换层析与浓缩 基于蛋白质的电荷性除去杂质，准确控制缓冲液
43、基于蛋白质的电荷性除去杂质，准确控制缓冲液和上样液的和上样液的pHpH值及电导值，纯化干扰素值及电导值，纯化干扰素 0.01M0.01M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH8.0pH8.0）平衡树脂）平衡树脂 盐浓度线性梯度盐浓度线性梯度5 550 ms/cm50 ms/cm进行洗脱进行洗脱 配合配合SDS-PAGESDS-PAGE收集干扰素峰，收集干扰素峰，2-10 2-10 。 浓缩：把目标馏分合并，调整溶液浓缩：把目标馏分合并，调整溶液pHpH和电导值，和电导值，10 ku10 ku超滤膜，超滤膜，0.05M0.05M醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（pH5.0pH5.0）中透析。）中透析。分离纯化工艺分
44、离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(4)(4)阳离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩 用用0.1M0.1M醋酸缓冲液（醋酸缓冲液（pH 5.0pH 5.0）平衡树脂。）平衡树脂。 上样，相同缓冲液冲洗。上样，相同缓冲液冲洗。 盐浓度线性梯度盐浓度线性梯度5 550 ms/cm50 ms/cm进行洗脱进行洗脱 配合配合SDS-PAGESDS-PAGE收集干扰素峰。收集干扰素峰。 浓缩：合并馏分，浓缩：合并馏分，10 ku10 ku超滤膜进行。超滤膜进行。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(5)(5)凝胶过滤层析凝胶过滤层析 洗涤液：洗涤液：0.15
45、 M NaCl0.15 M NaCl的的0.01M0.01M磷酸缓冲磷酸缓冲液（液（pH7.0pH7.0）清洗系统和树脂）清洗系统和树脂 上样，相同缓冲液进行洗脱。上样，相同缓冲液进行洗脱。 合并干扰素部分合并干扰素部分分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(6)(6)无菌过滤分装无菌过滤分装 0.22 m0.22 m滤膜过滤干扰素溶液滤膜过滤干扰素溶液 分装，分装，2020以下的冰箱中保存。以下的冰箱中保存。分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺(7)(7)质量控制与检测项目质量控制与检测项目 基于药典方法和质量标准，进行检验和分析基于药典
46、方法和质量标准，进行检验和分析 重组人干扰素鉴别试验重组人干扰素鉴别试验 重组人干扰素效价测定重组人干扰素效价测定 蛋白质含量，纯度测定，分子量蛋白质含量，纯度测定，分子量 宿主残留蛋白质、残留宿主残留蛋白质、残留DNADNA 重组人干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，重组人干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N N端端序列序列 其他：热原，内毒素，残留抗生素其他：热原，内毒素，残留抗生素分离纯化工艺分离纯化工艺重组人干扰素生产工艺重组人干扰素生产工艺小结与思考题（1）1 1、重组人干扰素生产工艺路线有哪几条，、重组人干扰素生产工艺路线有哪几条，有何优缺点？有何优缺点？2 2、重组人干扰素发酵工段的关
47、键控制点、重组人干扰素发酵工段的关键控制点是什么，如何实现最优化过程控制？是什么，如何实现最优化过程控制？3 3、根据现有工艺路线，提出研发仿制重、根据现有工艺路线，提出研发仿制重组干扰素生产新工艺。组干扰素生产新工艺。干扰素生产工艺干扰素生产工艺小结与思考题（2）4 4、重组人干扰素纯化工艺的原理是什么？、重组人干扰素纯化工艺的原理是什么？5 5、重组人干扰素纯化工艺过程中各工段的、重组人干扰素纯化工艺过程中各工段的目的是什么？目的是什么？6 6、根据干扰素的理化和生物学特性，设计、根据干扰素的理化和生物学特性，设计纯化工艺路线？纯化工艺路线？干扰素生产工艺干扰素生产工艺重组人胰岛素和重组人
48、生长激素生产工艺重组人胰岛素和重组人生长激素生产工艺第一节第一节 重组人胰岛素重组人胰岛素第二节第二节 重组人生长激素重组人生长激素第一节 重组人胰岛素 胰岛素的生物合成胰岛素的生物合成 重组人胰岛素的临床应用重组人胰岛素的临床应用 重组人胰岛素的生产工艺重组人胰岛素的生产工艺重组人胰岛素生产工艺重组人胰岛素生产工艺1、胰岛素的生物合成、胰岛素的生物合成 是一种是一种多肽激素，由胰脏多肽激素，由胰脏细胞合成。细胞合成。 人胰岛素基因是单拷贝，位于染色体人胰岛素基因是单拷贝，位于染色体11短臂上，由三个外显短臂上，由三个外显子和子和2个内含子组成，全长个内含子组成，全长1430bp。 转录加工成
49、熟转录加工成熟mRNA，翻译得到由，翻译得到由pre、B、C、A区域组成区域组成的的109个氨基酸的前胰岛素原。穿越内质网，跨膜运输后，个氨基酸的前胰岛素原。穿越内质网，跨膜运输后，N端端23个氨基酸的信号肽被特异性蛋白酶切除，形成个氨基酸的信号肽被特异性蛋白酶切除，形成86个氨基个氨基酸残基的胰岛素原。酸残基的胰岛素原。 胰岛素原只有胰岛素原只有10胰岛素活性，在高尔基体加工形成二硫键，胰岛素活性，在高尔基体加工形成二硫键，由由I型内蛋白酶型内蛋白酶PC3切除切除C肽和肽和B链的连接，链的连接，II型内蛋白酶型内蛋白酶（PC2）切除）切除C肽与肽与A链的连接，生成成熟的胰岛素分泌到胞链的连接
50、，生成成熟的胰岛素分泌到胞外，进入血液循环。外，进入血液循环。 生物合成生物合成重组人胰岛素重组人胰岛素1 1、成熟胰岛素、成熟胰岛素 成熟的胰岛素由成熟的胰岛素由ABAB双链组成，双链组成，A A链具有链具有2121个氨基酸个氨基酸残基，残基，B B链具有链具有3030个氨基酸残基，个氨基酸残基，3 3对二硫键，对二硫键，2 2对对链间二硫键，位置分别是链间二硫键，位置分别是A-7A-7和和B-7B-7、A-20A-20和和B-19B-19之之间；间；1 1对链内二硫键，对链内二硫键，A-6A-6和和A-11A-11之间。之间。 单体分子量为单体分子量为5807 u5807 u，pI 5.3
