1、青蒿素在合成生物学中的研究进展青蒿素在合成生物学中的研究进展CONTENTS简介:青蒿素与合成生物学青蒿素的生物合成主要包括四大步骤提高工程菌中目的产物产量的措施工业化研究进展 研究展望参考文献Part1 ： 简介:青蒿素与合成生物学 青蒿素(artemisinin)是中国科学家于 20 世纪 70年代从传统中草药青蒿或称黄花蒿中分离提纯的抗疟有效单体, 其化学本质是含“过氧桥”结构(1,2,4-三噁烷环)的倍半萜内酯。合成生物学与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的办法不同，合成生物学的研究方向完全是相反的，它是从最基本的要素开始一步步建立零部件。与基因工程把一个物种的基因延续、改变并
2、转移至另一物种的作法不同，合成生物学的目的在于建立人工生物系统（artificial biosystem），让它们像电路一样运行。通过合成生物学技术来制备青蒿素, 利用细胞工厂将是未来青蒿素生产的主要方式。1.Bouwmeestera HJ, Wallaartb TE, Janssena MH A, et al. Amorpha-4, 11-diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis J. Phytochemistry, 1999, 52: 843854. Part2 ：青蒿素的生物合
3、成主要包括四大步骤第一步是通过甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸两条途径形成法尼基焦磷酸（FPP)第二步是在紫穗槐-4, 11-二烯合酶（ADS）的作用下将 FPP 环化形成青蒿素的中间体紫穗槐-4, 11-二烯 Zhang ZR, Liao ZH, Peng MF. Cloning and functional analyses of HDS gene from Artemisia annua J. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2012, 43: 148154. 青蒿素的生物合成主要包括四大步骤第三步是在紫穗槐 -4, 11- 二烯氧化酶（AMO）的作用下, 紫穗槐-4
4、, 11-二烯进一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛, 进而合成青蒿酸和/或二氢青蒿酸第四步是青蒿酸和或二氢青蒿酸通过一系列酶反应和或非酶反应形成青蒿素 由于从青蒿酸/二氢青蒿酸形成青蒿素的途径不是很清楚,现在通过合成生物学技术制备青蒿素的研究绝大部分采用的都是一种半合成的路线。即通过代谢工程制备青蒿素的前体如紫穗槐-4, 11-二烯、青蒿酸和二氢青蒿酸,然后通过半合成的方法合成青蒿素参与青蒿素合成的特异性酶基因紫穗槐紫穗槐-4, 11-二烯氧化酶基因二烯氧化酶基因2 0 0 6 年 , 美国的 K e a s l i n g从青蒿腺毛中克隆得到了紫穗槐-4, 11-二烯氧化酶基因 CYP71AV1。
5、对底物具有特异性, 只能作用于紫穗槐-4, 11-二烯。醛脱氢酶基因醛脱氢酶基因2009 年, Teoh 等从青蒿中分离得到1个醛脱氢酶基因命名为 Aldh1。ALDH1 能作用于青蒿醛和二氢青蒿醛，生成相应的青蒿酸和二氢青蒿酸。细胞色素细胞色素 P450 还原酶基因还原酶基因CYP71AV1 是一种 P450 氧化酶, 其不能单独发挥作用, 必须由电子配偶体的配合。青蒿醛双键还原酶基因青蒿醛双键还原酶基因2009 年, Zhang 等从青蒿中分离得到一个双键还原酶, 命名为 Dbr。催化青蒿醛形成二氢青蒿醛,但产物以 11S-二氢青蒿醛为主。Part3 ：合成生物学角度：提高工程菌中目的产物
6、产量的措施通过“开源”方式增加前体供应通过“节流”方式增加前体供应 提高底物利用效率 优化培养和生产条件Han JL, Li ZQ, Ye HC, et al. Molecular cloning, prokaryotic expression, and enzyme activity assay of fps from Artemisia annua strain 00 l J. J Agric Univ Hebei (河北农业大学学报), 2008, 31: 7175. 3.1通过“开源”方式增加前体供应1.Wu W, Yuan M, Zhang Q, et al. Chemotype-d
7、ependent metabolic response to methyl jasmonate elicitation in Artemisia annua J. Planta Med, 2011, 77: 10481053. 青蒿素是一种倍半萜青蒿素是一种倍半萜, 其生物合成包括两部分。上游部分上游部分 (top pathway) 主要指倍半萜共同前体 法尼基焦磷酸（FPP) 的形成。通过 MEP 和MVA 两条途径形成的 FPP 池可以为下游各种半萜以及甾提供前体物质。下游部分下游部分(bottom pathway) 是青蒿素生物合成的特异途径, 即在 ADS 的竞争作用下, 将上游途径中
8、形成的 FPP 池中的部分 FPP 引入青蒿素生物合成代谢流中。优化措施：优化措施：增加基因的拷贝数、启动子修饰、密码子优化、基因替换、增加辅酶数量、优化或平衡多基因控制的代谢途径3.2通过“节流”方式增加前体供应 除了增加法尼基焦磷酸（FPP)的绝对供应总量之外, 减少 FPP池中的前体流入其他倍半萜代谢途径, 促使相对更多的前体流入青蒿素及其中间体生物合成的特异途径也是有效提高其产量的方法。 这些这些节流措施主要节流措施主要包括包括：抑制或下调竞争代谢途径, 从而限制或减少流入竞争代谢途径中的 FPP 供应。3.3提高底物利用效率 提高青蒿素生物合成特异途径中的途径酶效率, 主要通过两种方
9、式：提高提高单个基因效率和优化平衡整条单个基因效率和优化平衡整条途径途径来实现这来实现这个目的个目的。对于单个基因效率的对于单个基因效率的提高提高, ：主要采取增加基因拷贝数、密码子优化、强启动子调控和融合基因等方式。对于代谢途径的平衡优化：对于代谢途径的平衡优化：主要采用一种基于全局的数学算法和生物信息分析, 如代谢流控制分析。相对于单个基因效率的提高, 整条代途径的平衡优化显得更为困难和复杂, 对最终产物产量的影响也是最深刻和直接的。3.4优化培养和生产条件 除了对青蒿素代谢途径自身进行优化外，培养条件对工程菌中青蒿素及其前体的产量也有相当大的影响。 长期以来, 以美国堪萨斯大学 Weat
10、hers 研究团队为代表, 通过添加植物激素、营养成分、光照、非生物胁迫刺激剂等试图提高青蒿培养细胞的青蒿素含量。 开展细胞培养并获取高产青蒿素的技术仍然是一条漫长的路。Farhi M, Marhevka E, Ben-Ari J, et al. Generation of the potent anti-malarial drug artemisinin in tobacco J. Nat Biotechnol, 2011, 29: 10721074. Part4：工业化研究进展工业化研究进展中国从上世纪80年代开始关注化学合成方法制造青蒿素。1984年年初，实现青蒿素的人工全合成。遗憾的是
11、，该成果至今未能实现工业化生产，而这也是此后几乎所有青蒿素人工合成面临的窘境。可以说，人工合成之困，在于工业化；工业化之难，在于成本。到目前为止，已有的合成方法大部分实现不了工业化，而原因是合成路线中使用的化学试剂比较贵，或合成效率比较低。 在全球范围内，能实现人工合成青蒿素工业化生产的能实现人工合成青蒿素工业化生产的企业，只有法国赛诺菲公司企业，只有法国赛诺菲公司。国际上现在非常关注青蒿素的生物发酵生产。但是，生物发酵面临的问题是，它只能生产出青蒿酸，从青蒿酸到青蒿素最后几步的生产仍存在挑战。人工合成青蒿素途径人工合成青蒿素途径 生物发酵生物发酵 化学合成化学合成Part4：工业化研究进展工
12、业化研究进展 法国赛诺菲公司利用美国授权的酵母工程菌发酵生产青蒿酸，2012年年底已生产出39吨，转化为青蒿素后相当于4000万份抗疟药。然而，将青蒿酸“转化为青蒿素抗疟药”远非想象中的那么简单。该公司仅仅建立了一条小型生产线。由于比黄花蒿植物提取方法成本高，其目的仅是为了平衡和稳定市场，对植物提取进行补充，而非取代植物提取方法来生产青蒿素。美国伯克利分校的美国伯克利分校的Keasling课题组构建了一个课题组构建了一个能制备紫穗槐能制备紫穗槐-4，11-二烯的二烯的E.coli工程菌工程菌甲羟戊酸合成模块甲羟戊酸合成模块(顶部模块，top module)FPP合成模块合成模块(底部模块，bo
13、ttom module)紫穗槐紫穗槐-4，11-二烯二烯合成模块 这3个模块都由一些可拆卸的即插即用的元件构成， 因此，既可以方便地对模块中的元件进行优化，也能便捷地将这些模块用于其他代谢途径的构建，将众多复杂的生物合成途径演变成了可随时拆卸用的工程化生物系统。“中国神药中国神药”的青蒿素的青蒿素 2015年的诺贝尔生理学或医学奖，为中国原创新药青蒿素戴上了光环。但这个被国人自豪地称为“中国神药”的青蒿素，也给中国带来了些许压力与困窘。 据报道，在全球青蒿素大宗公立采购市场上，50%的份额已被异军突起的印度仿制药集团抢走，欧洲制药集团的市场份额迅速退守到不足30%，中国则缩减至5%以下。与此同
14、时，中国却是全球青蒿素生产原料的最大供应国。 一边，中国面临的青蒿素供应需求压力长期存在；另一边，市场份额日益缩减，而人工合成青蒿素工业化的路子又走不通。窘境之下，一批中国学家正在探索可工业化的人工合成方法，希望找到一条让中国不只是“原料供应国”的新路。Part5：研究展望 通过合成生物学制备青蒿素及其中间体的成功，无论对青蒿素本身还是对未来天然药物的生产格局都会产生深远的影响。 合成生物学工艺，能在短时间内获得大量的青蒿素，能稳定世界市场上青蒿素的供应，有效地降低青蒿素的价格，有利于控制疟疾在贫困国家的肆虐。 合成生物学制备青蒿素对其他稀缺药物的绿色制备具有借鉴意义，能有效地推动天然药物的可
15、持续发展、能引领其他天然药物的绿色制备。青蒿素是医药界的“重磅炸弹”，通过合成生物学制备青素的成功，其意义可能不止每年几十亿元的销售额。参考文献1.Bouwmeestera HJ, Wallaartb TE, Janssena MH A, et al. Amorpha-4, 11-diene synthase catalyses the first probable step in artemisinin biosynthesis J. Phytochemistry, 1999, 52: 843854. 2.Zhang ZR, Liao ZH, Peng MF. Cloning and fun
16、ctional analyses of HDS gene from Artemisia annua J. Chin Tradit Herb Drugs, 2012, 43: 148154. 3.Han JL, Li ZQ, Ye HC, et al. Molecular cloning, prokaryotic expression, and enzyme activity assay of fps from Artemisia annua strain 00 l J. J Agric Univ Hebei , 2008, 31: 7175. 4.Wu W, Yuan M, Zhang Q,
17、et al. Chemotype-dependent metabolic response to methyl jasmonate elicitation in Artemisia annua J. Planta Med, 2011, 77: 10481053. 5.Farhi M, Marhevka E, Ben-Ari J, et al. Generation of the potent anti-malarial drug artemisinin in tobacco J. Nat Biotechnol, 2011, 29: 10721074. 6.Westfall P, Pitera DJ, Lenihan JR, et al. Production of amorphadiene in yeast, and its conversion to dihydroartemisinic acid, precursor to the antimalarial agent artemisinin J. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109: E111118.
