1、体外抗菌药物抑菌体外抗菌药物抑菌试验（亦称细菌对试验（亦称细菌对药物的敏感试验药物的敏感试验-简称药敏试验）简称药敏试验）病原生物学实验室2009 3 4一、概念v药物敏感试验是在体外检测抗菌药物对细菌的抑制和杀灭的作用。根据药物的常规剂量在体内所能达到的浓度对细菌的影响，将被检菌株对该药的敏感程度分为三级：敏感、中度敏感中介度、耐药。 v敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到的浓度所抑制或杀灭。v中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。 只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠球菌。v中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差
2、而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果做出判断。v 耐药(R)：表示细菌不能被常规剂量的药物所达到的浓度所抑制。药物在体外稀释的不同浓度对细菌生长的影响，可分为二种： v 最小抑菌浓度(MIC)：抗菌药物能抑制被检菌生长的最小浓度。药物对同一菌株MIC值越小，其抗菌力就越强， 细菌对这种药物就越敏感。v 最小杀菌浓度(MBC)：抗菌药物能完全杀灭被检菌所需要的最小浓度。v近年来，广谱和超广谱抗菌药物的应用及滥用，造成耐药菌株数迅速增加，耐药范围不断扩大，导致抗菌治疗效果严重下降，耐药菌引起的内源性感染和医院交叉感染已成为全球性的突出问题。如何
3、指导科学合理地抗菌治疗及耐药监测已成为微生物实验室及临床微生物实验室的重要任务之一。体外检测抗菌药物对细菌的敏感试验作为实验室的主要手段，在临床医学中有着重要的作用。二、 药敏试验的常用方法vK-B纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法及 E-test法试验 前面讲过药物对同一菌株，MIC值越小，其抗菌力就越强， K-B法的抑菌圈(环) 就越大，细菌对这种药物就越敏感，这是K-B 纸片扩散法与稀释法的关系，呈负相关。（一） K-B纸片扩散法v是由Kirby和Bauer所创建，此方法属定性试验，是药敏试验中最成熟的方法之一，但操作时影响因素较多，需注意质控。经世界卫生组织推荐统一实验条件，规定了统一
4、用水解洛蛋白培养基及平板大小，培养基厚度，标准菌株、菌龄及菌浓度，操作手法，纸片质量及厚度，药敏纸片之间距离，观察量取结果时间及工具，为各国广泛采用的方法。v根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须参照遵守。 v原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生长快的细菌进行药敏试验。 1 水解酪蛋白琼脂（Mueller-Hinton AgarMHA） 倾注成4mm厚
5、的1215cm平板，将其保存于4冰箱可用1周。2硫酸钡比浊管 1.175%氯化钡（BaCl2 .2H2O）0.5ml加0.36N(1%)流酸溶液99.5ml,充分混匀，每管4ml其浊度相当于0.5麦氏（McFarland standard）比浊管第一管1/2（1.5亿/ml相当于1.5108CFUm1）,使用期半年。材料材料3 抗菌素纸片 现有商品（阿米卡星(AMK)、庆大霉素(GEN)、青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林舒巴坦(AMS)、呢拉西林(PIP)、头抱唑林(FZN)、头孢呋辛(FRX)、头孢他啶(CAZ)、氨曲南(ATM)、亚胺配南(1MP)、环丙沙
6、星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)、复方新诺明(SXT) 4 质控菌 金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大肠埃希菌（ATCC25922）5 其它 无菌生理盐水、无菌棉拭、镊子、游标毫微米卡尺、消毒小试管、1ml 、10ml 吸管。操作方法 1 将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌先接种在血平板或营养平板上，37孵育1624h。 2 再将菌落接种至营养肉汤中，培养46小时后用灭菌生理盐水校正菌液浓度至0.5麦氏标准比浊管(相当于1.5108CFUm1)。 3 用灭菌棉拭子蘸取相当于1.5108CFU/m1的金黄色葡萄球菌菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后，在MHA 平板表面上，从不
7、同方向均匀涂布3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1圈。同样方法涂布大肠埃希菌。 4平板在室温下干燥35min后。根据试验菌株选择抗菌谱。如阳性球菌:金黄色葡萄球菌选择青霉素(PEN)、苯唑西林(OXA) 环丙沙星(CIP)、万古霉素(VAN)、克林霉素(CLI)等。大肠埃希菌选用氨苄西林(AMP)、头抱唑林(FZN)、庆大霉素(GEN)、环丙沙星(CIP)、亚胺配南(IMP)等。5用无菌镊子将含药纸片，紧贴于琼脂表面，各纸片之间相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，置37孵育18h24h观看结果。结果v纸片周围的细菌受抑制，形成明显的抑菌圈，用游标卡尺测量抑菌环直径的大小
8、记录之。v参考表中的质量控制标准，报告敏感(S)、耐药(R)。注意事项v标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范围内。如果超出该范围，应视为失控，须及时查找原因，予以纠正。v培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结果的准确性。（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法 v原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。按美国委员会临床实验室标准作分步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。优缺点v稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体外对病原菌
9、的抑制或杀灭浓度，有利于临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏试验常用的经典参照标准，但操作相对比较烦琐。材料（肉汤稀释法）v标准菌株ATCC25923 、待测菌株（金黄色葡萄球菌6h菌液） MH肉汤 、头孢霉素或青霉素注射粉剂、无菌蒸馏水、0.1mol/L消毒磷酸盐缓冲液、0.5麦氏标准比浊管(相当于1.5108CFU/m1)、吸头、无菌中试管、小试管或无菌96孔聚苯乙烯U型板、微量加样器、湿盒。操作方法 v药物原液配制 原液浓度常为测定浓度的10倍以上。根据药物性能选择溶剂。例如 取青霉素钾
10、注射粉剂80万u/支 + 蒸馏水4ml20万u /ml，取1ml +9mlMH 肉汤2万u /ml，取2万u /ml的5.12ml药液+MH肉汤14.88ml5120 u /ml，分装4ml/支，-20保存）。 v常用的原液浓度 肉汤稀释法为1280u（g）/ml，琼脂稀释法为5120u（ g）/ml。具体的还应根据某药的抑菌特性而定。最好用灭菌溶剂配制。如需要，原液配制好后用过滤法除菌，小量分装备用。大部分抗菌药物原液在-20以下可保存3个月，但在4下只能保存1周。 测定浓度稀释（参照下表） 测定浓度稀释文字说明 取试管15支，编好管号。 加MH肉汤1ml于2、4、7、10、13试管内。 加
11、MH肉汤3ml于3、5、8、10、11试管内。加MH肉汤7ml 于6、9、12、15试管内，然后分别加入药物原液（5120u/m1）1ml于1、2、3管内，从3管吹吸后，分别放入4、5、6各管1ml，从6管吹吸后，分别放入7、8、9管中各1ml，从9管吹吸后，分别放入10、11、12管内各1ml，从12管内吹吸后分别放入13、14、15管内各1ml。药物的浓度依次为5120、2560、1280、640、320、160、80、40、20、l0、5、2.5、1.25、0.625、0.31u/ml测定方法v试管法MIC： 将按上表稀释的浓度再稀释10倍，各管中抗菌药物的终浓度依次为128、64、32
12、、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03u/ml。各浓度取1ml加入已标记好的小试管内，以无药物MH肉汤为空白对照及生长对照。以另一排为质控菌对照。 每管加菌液50l（含菌量达到105 CFUm1）测试菌和质控标准菌的准备：增菌培养同K-B法，46小时幼龄菌用35m1生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准。再用MH肉汤1:100稀释。加完后，轻摇，置37孵育1824 h观察结果。v 微量法微量法MIC：同试管法，各管中抗菌药物的终浓度依次为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03u/ml。各浓度取200微升加入消毒的微
13、量反应板内，以无药物MH肉汤为空白对照及生长对照。以另一排为质控菌对照。 每孔加菌液10l（含菌量达到105 CFUm1）测试菌和质控标准菌的准备：同试管法。 置37孵育1824 h观察结果。MIC结果判断v先观察对照管应有细菌生长，然后逐管与对照比较，不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对测试菌(或标准菌)的MIC。 每次实验时应选用标准菌株在同一试验条件下进行测定，以控制质量。 (三)琼脂稀释法MICv 药液稀释同上，见表。 取每浓度各2m1加入已作好标记的90mm消毒平皿内，加入50的MHA18ml，使药物和培养基充分混匀，冷却后分区域接种,以无药物MHA为对照。药物终浓度即512、2
14、56、128、64、32、16、8、4、2、l、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031u/ml,比原来稀释了10倍。每平皿可分46区，接种46个菌株。 v 细菌接种：每格可用内径4mm外径6mm接环或加样器，划线或用加样器多点接种10l每点2l, 接种时先接种含药浓度低的平板，然后接种含药浓度高的平板，最后接种不含抗菌药物的平板，以检查整个实验过程中测试菌的存活状态。 置37孵育1824 h观察结果。结果 v菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计。v 影响因素: 培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响
15、结果。此外，肉汤稀释法不适于作磺胺药或三甲氧苄氨嘧啶等抑菌剂的药敏试验，因为敏感菌株在被抑制前已可繁殖数代，从而使结果的终点不清；而应用琼脂稀释法可获满意的结果。 质量控制v每个平板同时接种标准菌株，测试结果不能超过或低于标准菌株MIC的预期值范围，如超过或低于预期值范围一个稀释度以上时，应检查原因,标准菌株是否被污染或已变异等，并重复测定。(四) E-test法实验 v是扩散法和稀释法相结合的一种药敏方法。是以抗菌药物的梯度浓度试条(与宽5mm长50mm的塑料试条相粘合)，用数字标出所含该药物的浓度刻度（g/ml）将试条贴在含有细菌的琼脂表面上。v原理 抗菌药物在琼脂 内向四周扩散，使敏感细
16、菌在一定范围内受到抑制生长，形成抑菌圈。抗菌药物的浓度呈连续梯度递减，使抑菌圈的大小随药物浓度的递减而变化。根据试条两侧抑菌圈与试条相交位置的刻度数值，准确、定量地测出抗菌药物对某菌的最低抑菌浓度(MIC)。v优点 操作简单、定量检测、结果直观准确、重复性好，具有扩散法与稀释法相同效果。v材料、方法 注意事项等与K-B 大致相同（略）v结果 围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，抑菌圈和试条的横向相交处的读数刻度即是该测定抗菌药物对测试菌的最低抑菌浓度(MIC)。判定E试验 MIC的方法 v试条两侧的抑菌圈与试条相交处1.位于试条上所示上下刻度之间时，读取较高的一侧所示的读数。 2.两侧的抑菌圈与
17、试条相交处不一致时，读取刻度数值较高的一侧所示的读数。3.沿药敏试条边缘生长的细菌线在阅读结果时可忽略不计。 1 2 3 4 4. -内酰胺酶抑制剂因其固有活性等原因可能会导致沿药敏试条的下端形成一下延的抑菌圈，此时的MIC应是椭圆形抑菌圈正常椭圆线的延伸与药敏试条相交处的刻度读数。 5. 在椭圆形抑菌圈与药敏试条相交处或圈内有小菌落或大菌落时，应读生长被完全抑制的部分与药敏试条相交处的读数。 6. 出现双抑菌圈时，应读生长被完全抑制的部分与药敏试条相交处的读数。 7. 测试抑菌抗菌药物时，或接种菌量过高时， 应读80%抑菌部分或生长被明显抑制的部分与药敏试条相交处的读数。8. 当椭圆形抑菌圈在与药敏试条相交处呈凹下延伸时，阅读凹下起始处椭圆形切线的读数。一般高于完全抑制部位0.51个稀释度。 注意 v质量控制基本与稀释法相同，应掌握E试验药敏试条的正确使用和储存方式，如涂菌后一定要待琼脂表面干燥后方可置入药敏试条。
