1、第八章第八章 现代食品微生物检验技术现代食品微生物检验技术第八章第八章 现代食品微生物检验技术现代食品微生物检验技术免疫学技术是以抗原抗体的特异性反应为基础发展起来的一种技术免疫学方法检测灵敏度高、特异性好，而且快速、简便，所以其发展迅速，广泛应用于生物分析检测免疫检测技术是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，其中抗原和抗体之间所发生反应的特异性和灵敏性是免疫检测技术的关键常规免疫检测技术主要是用于检测抗原或抗体的体外免疫血清学反应或免疫血清学技术第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 一、酶联免疫吸附技术一、酶联免疫吸附技术
2、将抗原和抗体的特异性反应与酶的催化作用有机地结合的一种新技术 广泛应用于各种抗原和抗体的定性和定量测定 食品病原菌检测最常用的分析方法，是一种把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术 基本原理是将抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面，测定时，将待测样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原一抗体复合物，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被同相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 一、酶联免疫吸附技术一、酶联免疫吸附技术 双抗
3、体夹心法测抗原或抗体 间接法测抗体 双位点一步法 竞争法 捕获法测IgM抗体 ABS（avidin biotin system）-ELISA法 PCR-ELISA法 斑点免疫酶结合试验（DIA）第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 一、酶联免疫吸附技术一、酶联免疫吸附技术 “三明治夹心”实验第一节第一节 免疫学技术免疫学技术双抗体夹心法 一、酶联免疫吸附技术一、酶联免疫吸附技术 ELISA检测的主要步骤 将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板的小孔内，洗涤一次；加入待测抗原，洗去未结合的抗原；加入与待测抗原特异性结合的酶联抗体，使形成夹心；加入该酶的底物，若产生有色的酶解产物，说明存在与已知抗体
4、特异结合的抗原第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 二、免疫荧光技术二、免疫荧光技术 将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法 荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位 异硫氰酸荧光素（FITC）、四乙基罗丹明（RIB200）、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC） 荧光抗体法；荧光抗原法第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 二、免疫荧光技术二、免疫荧光技术 免疫荧光细胞（或组织）化学技术 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体
5、） 直接法、夹心法、间接法和补体法第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 三、免疫印迹技术三、免疫印迹技术 根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法 在凝胶电泳和同相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术 用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 三、免疫印迹技术三、免疫印迹技术 基本原理是将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离，然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其他外力作用下，使凝胶中的单一抗原组分转移到印迹纸上，并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等，对抗原固定化基质膜
6、进行检测和分析第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 三、免疫印迹技术三、免疫印迹技术 3个步骤 抗原分离:聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将含有目标蛋白（抗原）的样品按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带 第二为抗原印迹:电转移，目的是将凝胶中已分离的条带转移至硝酸纤维素膜上 第三为抗原检定:酶免疫定位，是将前两步中已分离但肉眼看不见的抗原条带显示出来第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 四、乳胶凝集试验四、乳胶凝集试验 间接凝集试验 以聚苯乙烯乳胶微粒作为惰性载体，用人工大分子乳胶颗粒标记抗体，使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应，以达到检测目标病原微生物或毒素的目的 传统的乳胶凝集试
7、验分试管法与玻片法 乳胶凝集试验的灵敏度和特异性都比较高第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 五、放射免疫技术五、放射免疫技术 放射免疫分析、同位素免疫技术或放射免疫测定法 一种将放射性同位素测量的高度灵敏性、精确性与抗原抗体反应的特异性相结合的体外测定超微量（10-1510-9g）物质的新技术 操作简便、迅速、准确可靠，应用范围广，可自动化或用计算机处理，但需一定设备、仪器，对抗原抗体纯度要求较严格第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 五、放射免疫技术五、放射免疫技术 RIA的基本原理，是利用标记抗原（*Ag）和非标记抗原（Ag）对特异性抗体（Ab）发生竞争性结合第一节第一节 免疫学技术免疫学技
8、术竞争结合反应 五、放射免疫技术五、放射免疫技术第一节第一节 免疫学技术免疫学技术放射免疫分析原理示意图 五、放射免疫技术五、放射免疫技术 操作程序第一节第一节 免疫学技术免疫学技术抗原标准曲线 五、放射免疫技术五、放射免疫技术 3个关键性技术问题 标记抗原。要求其纯度高、免疫化学活性好、比放射性强、用量适当 制备抗体。要求其特异性高、选用的稀释度适当。 分离B与F。理想的分离方法应当是分离完全、稳定可靠、操作简单、适用范围广第一节第一节 免疫学技术免疫学技术 一、一、PCR技术技术 （一）PCR的工作原理第二节第二节 分子生物学方法分子生物学方法PCR反应示意图 一、一、PCR技术技术 （二
9、）PCR技术的应用 对未知序列的扩增 利用不对称PCR完成单链DNA扩增 食品中致病菌和生活饮用水的指示菌的分析第二节第二节 分子生物学方法分子生物学方法PCR反应示意图 二、核酸探针杂交技术二、核酸探针杂交技术 （一）核酸探针杂交技术的基本原理 在核酸变性及复性原理基础上建立起来的实验技术 核酸探针是指能与特定核苷酸序列发生特异性互补杂交，杂交后又能用特殊方法检测的被标记的已知核苷酸链 应用核酸探针就可以检测待测核酸样品的特定基因序列第二节第二节 分子生物学方法分子生物学方法 二、核酸探针杂交技术二、核酸探针杂交技术 （二）核酸探针杂交技术的应用 细菌总数、大肠菌群、霉菌和酵母菌、致病菌以及
10、毒素 目标DNA的互补序列 rRNA为靶目标的检验 进行食品微生物检验比传统方法更加准确、灵敏，但同时也增加了假阳性出现的机会 保证实验环境的干净，避免其他DNA造成的污染第二节第二节 分子生物学方法分子生物学方法PCR反应示意图 一、一、ATP生物发光检测技术生物发光检测技术 （一）ATP生物发光技术的基本原理 基于生物发光体系的发光机理所设计 通过测定样品中ATP的浓度，即可推算出生物量 棉拭取样、样品萃取、添加荧光素和荧光素酶混合物、测定生物发光量、做出标准曲线、求出浓度和活菌数第三节第三节 光电化学方法光电化学方法PCR反应示意图 一、一、ATP生物发光检测技术生物发光检测技术 （二）
11、ATP生物发光技术的应用 在水中微生物检测领域的应用 在乳品工业生产中的应用 在肉类微生物检测中的应用 在物体表面微生物检测中的应用 在啤酒中的应用 在面粉中的应用 与免疫磁分离技术结合的应用第三节第三节 光电化学方法光电化学方法 二、阻抗法二、阻抗法（一）阻抗法的工作原理不同的微生物在培养基中可产生具有作为鉴定依据的特征性阻抗曲线，根据阻抗改变图形，可以对检测的微生物菌种进行鉴定直接阻抗测量法和间接阻抗测量法第三节第三节 光电化学方法光电化学方法 二、阻抗法二、阻抗法（二）阻抗法的应用全自动微生物监测系统用于乳制品、肉制品、海产品、蔬菜、冷冻食品、糖果、糕点、饮料、化妆品中的总菌数、大肠菌群
12、、霉菌和酵母菌计数以及乳酸菌、嗜热菌等的测试，操作方便、快速、结果准确第三节第三节 光电化学方法光电化学方法 一、生物传感器工作原理一、生物传感器工作原理 选择性地对样品中的待测物发出响应，通过生物识别系统和电化学或其他传感器把待测物质的浓度转化为电信号或光信号，根据信号大小定量测出待测物质的浓度 基因传感器、酶传感器、免疫传感器、微生物传感器、细胞器传感器、仿生传感器和分子印迹传感器 高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本、能在复杂的体系中进行快速在线连续监测第四节第四节 生物传感器生物传感器 二、生物传感器的应用与发展二、生物传感器的应用与发展 用于临床诊断检查、治疗时实施监控、发酵工业
13、、食品丁业、环境和机器人 光学免疫传感器实现了鼠伤寒沙门菌的快速检测 在食品微生物检测上的应用是食品中微生物和生物毒素的检验及微生物细胞数目的测定第四节第四节 生物传感器生物传感器 一、流式细胞技术的原理一、流式细胞技术的原理 流式细胞仪 第一部分为传感系统，包括样本递送系统、样品池、检测系统、电子传感器和激光源等；第二部分为计算机系统；第三部分为电路、光路和水路系统，有电源、光学传导和滤片、鞘液循环和回收部分 光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同
14、细胞生物学特性。使用荧光素，流式细胞术不仅能准确地区分、计数不同的细胞，而且能够辨别流体中细胞的生命状态第五节第五节 流式细胞技术流式细胞技术 一、流式细胞技术的原理一、流式细胞技术的原理 流式细胞仪进行测定时样品制备应遵循以下原则 使各种液体和悬浮细胞样本新鲜 针对不同的细胞样本进行适当洗涤、酶消化或EDTA处理， 对新鲜实体瘤组织可选用或联用酶消化法，机械打散法和化学分散法来获得足够数量的单细胞悬液 对石蜡包埋组织应先切成若干4050m厚的蜡片，经二甲苯脱蜡到出现水后，再用前述方法制备单细胞悬液。 单细胞悬液的细胞数不应少于l07个/mL第五节第五节 流式细胞技术流式细胞技术 二、流式细胞
15、技术的应用与发展二、流式细胞技术的应用与发展 在食品发酵工业生产中微生物检测的应用 在乳制品加工中的应用 在饮料类食品加工行业中的应用第五节第五节 流式细胞技术流式细胞技术 一、测试纸片快速检验法基本原理一、测试纸片快速检验法基本原理 载体是一种可以黏附同体培养基的不透水膜，上层聚丙烯薄膜含有黏合剂、指示剂及冷水可溶性凝胶；下层聚乙烯薄膜含有待检测微生物生长所需的琼脂培养基。 样品经过简单的处理后成为悬浮液，取一定量悬浮液滴加到干燥状态的固体培养基上，迅速吸收样品中的水分膨胀，待检测微生物可以均匀分散在该固体培养基表面 在此测试片上生长时，细胞代谢产物与上层的指示剂发生氧化还原反应，从而使微生
16、物着色 故测试片上就会呈现出特异颜色的菌落判断，根据这些菌落数可以报告样品中微生物活菌的数量第六节第六节 测试纸片快速检验法测试纸片快速检验法 二、测试纸片快速检测技术的应用二、测试纸片快速检测技术的应用 滤纸和已经通过AOAC（国际分析化学协会）认可的美国3M公司的Petrifilm为载体的测试片已开始被广泛应用第六节第六节 测试纸片快速检验法测试纸片快速检验法3M测试片与培养结果【思考题】【思考题】 简述ELISA检验的主要步骤。 简述荧光抗体染色法的分类。 简述PCR技术的应用。 简述ATP生物发光技术的主要应用。 简述流式细胞技术的主要应用。第八章第八章 现代食品微生物检验技术现代食品微生物检验技术
