1、2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心2012春季学期分光光度法分光光度法南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心内容内容3分光光度法的原理分光光度法的原理1如何求被测组分的含量如何求被测组分的含量2分光光度计的基本结构分光光度计的基本结构分光光度计的使用与注意事项分光光度计的使用与注意事项432012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度法分光光度法 概念：是
2、利用物质所特有的吸收光谱来概念：是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。鉴别物质或测定其含量的一项技术。 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便特点：灵敏度高、精确度高、操作简便、快速。对于复杂的组分系统，无须分、快速。对于复杂的组分系统，无须分离即可检测出其中所含的微量组分的特离即可检测出其中所含的微量组分的特点。点。2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度法的原理分光光度法的原理 LambertLambert定律定律I0I入射光强度透过光强度LC C液液层层厚度厚度0IIT 透光率lkIIolg溶液溶液浓浓度度2012
3、春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度法的原理分光光度法的原理 BeerBeer定律定律ckIIolgI0I入射光强度透过光强度LC C液液层层厚度厚度溶液溶液浓浓度度2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度法的原理分光光度法的原理 Lambert-Beer定律lkIIolgckIIolglckIIolglckA如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将LambertLambert和和BeerBeer定律定律合并，描述物质对单色光吸收强
4、弱与液层厚度和待测物浓度的关系。合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心分光光度法的原理分光光度法的原理IIlgAAabsorbanceIIlgIIlg0IIIlgII0IIlgI I0000000表示，即用），度，称作吸光度（表示溶液对光吸收的程由此可见，溶液不透光。乎被溶液完全吸收，即值无穷大，表示光线几时，当线较多；值大，表示溶液吸收光时，当光线；，表示溶液完全不吸收时，当公式的意义：lckIIolg2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教
5、学中心如何求被测组分的含量如何求被测组分的含量1.1.利用标准管计算测定物的含量利用标准管计算测定物的含量2.2.利用标准曲线计算测定物含量利用标准曲线计算测定物含量3.3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度利用标准系数法求出待测溶液的浓度4.4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度利用消光系数法求出待测溶液的浓度2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心利用标准管计算测定物的含量利用标准管计算测定物的含量 在相同条件下测定已知浓度（在相同条件下测定已知浓度（C CS S）标准液的吸光度（）标准液的吸光度（A AS S），），同时也测定末知浓度（同时也测
6、定末知浓度（C CU U）的吸光度（）的吸光度（A AU U），），CsAsAuCuCsCuAsAuAuAsLsLuKs：KuKsCsLsAsKuCuLu：Au即比值之比值也等于两浓度之与所以因为根据定律得2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心利用标准曲线计算测定物含量利用标准曲线计算测定物含量 先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出它们的吸光度。然后以各管吸光度（它们的吸光度。然后以各管吸光度（A A）为纵坐标，各）为纵坐标，各管的浓度（管的浓度（C C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。）为横坐
7、标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心标准曲线标准曲线(浓度浓度-吸光度曲线）吸光度曲线）0.20.80.40.6A 0 1 2 3 4 5根据测定管吸光
8、度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。 C2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心V-1100V-1100型可见光分光光度计型可见光分光光度计 0.000ATCFMODEPRINT0%T100%TA：吸光度：吸光度T：透射比：透射比C：浓：浓 度度F：斜：斜 率率MODEATCF切换键切换键PRINT确认键确认键0%T100%T校零、下降键校零、下降键校校100、上升键、上升键V-1100分光光度计键盘控制的使用说明分光光度计键盘控制的使用说明 V-1100 V-1100分光光度计操作步骤分光光度计
9、操作步骤 开机，预热开机，预热3030分钟。分钟。 转动波长旋钮，调所需波长。按转动波长旋钮，调所需波长。按 键切换到键切换到T T档。档。 将黑体放入光路中，合上盖，按将黑体放入光路中，合上盖，按 键校零键校零,T=000.0,T=000.0。 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按 键校键校T=100.0T=100.0 合上盖，按合上盖，按 键切换到键切换到A A档档 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中拉动拉杆，将标准
10、、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸，即可读取其吸光度光度A A值。重复值。重复3 3次，记录次，记录3 3组数据。组数据。 读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。MODE 0%MODE 100%2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心V-1100V-1100分光光度计分光光度计 使用注意事项使用注意事项 注意防震、防潮、
11、防光和防腐蚀。注意防震、防潮、防光和防腐蚀。 每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调换。换。 不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。 盛装参比液时，达到比色杯的盛装参比液时，达到比色杯的3/43/4即可，不宜过多，以防即可，不宜过多，以防溶液溢出。溶液溢出。 比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸拭净。拭净。 注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水清洗。清洗。 测试结束要及时登
12、记，仪器有问题及时报告。测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心操作练习实验材料操作练习实验材料 试剂：试剂： CuSOCuSO4 4标准液标准液 （8mg/ml8mg/ml） 待测待测CuSOCuSO4 4溶液溶液 蒸馏水蒸馏水 器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100 V-1100型可见光分光光度计型可见光分光光度计2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心操作练习步骤操作练习步骤加入物加入物 B S UB S
13、U蒸馏水蒸馏水 3ml 3ml CuSOCuSO4 4标准液标准液 3ml 3ml CuSOCuSO4 4待测液待测液 3ml 3ml分别取分别取3 3支试管，做好标记，按下表操作：支试管，做好标记，按下表操作： 以空白管以空白管B B调零，在调零，在690nm690nm处，读取标准管处，读取标准管S S和待测管和待测管U U吸光度吸光度A A值，记录值，记录3 3组数据，取平均组数据，取平均A A值，代入公式计算。值，代入公式计算。2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心数据处理表格数据处理表格测定管测定管各管测定次数各管测定次数 各管平均各管平均 A A值值 1 2 3 1 2 3标准管标准管待测管待测管各管各测定各管各测定3 3次，取其平均次，取其平均A A值再代入公式计算。值再代入公式计算。2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心结果计算结果计算SSUCAAmmol/L）待测管浓度（2012春季学期春季学期生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心2012春季学期南方医科大学南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心
