1、流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围 细胞结构细胞结构细胞大小细胞大小细胞颗粒度细胞颗粒度细胞表面积细胞表面积核浆比例核浆比例DNADNA含量与细胞周期含量与细胞周期RNARNA含量含量蛋白质含量蛋白质含量 细胞功能细胞功能细胞表面细胞表面/ /胞浆胞浆/ /核的特异性抗原核的特异性抗原细胞活性细胞活性细胞内细胞内/ /外的细胞因子外的细胞因子激素结合位点、细胞受体激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化蛋白磷酸化pHpH值值钙离子浓度钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位细胞膜电位、线粒体膜电位 1. 1. 上机检测上机检测 单色单色/双色双色/多色样本多色样本 参数调节参数调节 电压、阈值、设门、
2、补偿电压、阈值、设门、补偿2. 2. 细胞分选细胞分选3. 3. 细胞表面和胞内标志检测细胞表面和胞内标志检测4. 4. 细胞周期细胞周期(PI(PI单染单染) ) 5. 5. 细胞凋亡（细胞凋亡（AnnexinAnnexin V V与与PIPI双染）双染）举例：举例：FACS Calibur可检测可检测FL1-4四个通道的四个通道的4个颜色个颜色检测器组检测器组（激光器）（激光器）所需探测器所需探测器（PMT）位置）位置带通带通/长通透镜长通透镜适用染料适用染料488nm蓝蓝色激光色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE, PIFL3670 LPPerCP,PerCP-Cy5.
3、5, PE-Cy7635nm红红色激光色激光FL4661/16APC搭配荧光素原则搭配荧光素原则1. 不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的。2. 每个通道只能选择每个通道只能选择1种荧光素。种荧光素。3. 各个通道之间的荧光素可以随意搭配各个通道之间的荧光素可以随意搭配流式抗体荧光标记搭配流式抗体荧光标记搭配 将将光散射特性光散射特性与与细胞的表面免疫荧光分析细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理结合起来，区别经这些特殊处理发生选发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型择性凋亡的淋巴细胞亚型以及以及活细胞的
4、分类活细胞的分类。 由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。 不推荐不推荐APC和和PE-Cy5一起一起使用，使用，上流式以后，容易导致补偿过度。上流式以后，容易导致补偿过度。 推荐使用推荐使用Alex Fluro488和和Alex Fluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对，适合流式细胞仪的光谱性质，对P
5、H值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。发射光谱存在巨大差异，无需补偿。数据显示数据显示1. 直方图（直方图（Histogram）2. 二维点图（二维点图（Dot Plot）3. 等高线图（等高线图（Contour Plot）4. 密度图（密度图（Density）5. 三维图（三维图（3D Plot）等）等 “设门设门”就就是确定阳性细胞群，去除散点部分。是确定阳性细胞群，去除散点部分。指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群（细胞基本处于同一状
6、态，有想要分析的特定细胞群（细胞基本处于同一状态，有可比较性）。通过可比较性）。通过“设门设门”得到不同的区域，从而对得到不同的区域，从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。其中的细胞进行单参数或多参数分析。 设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有设门是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。包括在线设门和离线设门。在线设门和离线设门。 补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，纠正重叠时）荧光补偿是指在流式细胞多色分析中，
7、纠正荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光荧光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色。对应的同型对照抗体分别进行染色。实验样本：自发荧光非特异荧光特异荧光实验样本：自发荧光非特异荧光特异荧光同型对照：自发荧光非特异荧光同型对照：自发荧光非特异荧光单参数直方图分析单参数直方图分析荧光峰的高低即在纵轴对荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中荧光强度的细胞在
8、样本中所占比例的相对多少，而所占比例的相对多少，而非绝对数目。非绝对数目。双双参参数数散散点点图图分分析析散点图散点图等高线图等高线图密度图密度图FCM的主要测定指标：的主要测定指标：FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)FCM标记方法标记方法 单标：一种单抗单标：一种单抗/tube-FL1, FSC, SSC（三参数）（三参数） 双标：两种单抗双标：两种单抗/tube-FL1, FL2, FSC, SSC（四参数）（四参数） 三三/四标：三种单抗四标：三种单抗/tube、四种单抗、四种单抗/tube-FL1-FL3/4, FSC, SSC 分析时，使用分析时，使用FL2-
9、w和和FL2-A显示。显示。 FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前含量（前提是用提是用Rnase处理去除处理去除RNA）；）； , FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧光峰的脉是指检测荧光峰的脉冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用, 用于去除粘连细胞。用于去除粘连细胞。流式测细胞周期，一般分为流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋期前面有个凋亡峰亡峰(也称也称sub-G0期期)，而如果分析时，而如果
10、分析时细胞窗口细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后） 颗粒杂质、气泡颗粒杂质、气泡对检测的影响对检测的影响FSC：反映细胞：反映细胞相对大小及其表面积相对大小及其表面积 SSC：反映：反映颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性对血液中淋巴细胞设门（对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型）分析其免疫表型在在线线设设门门离线设门离线设门TB细胞分选细胞分选细胞表面标志物检测细胞表面标志物检测从增殖的角度分类高等动物细胞从增殖的角度分类高
11、等动物细胞连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、连续分裂细胞，在细胞周期中连续运转因而又称为周期细胞，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。部分骨髓细胞。休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称休眠细胞暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G0G0期细胞，如淋期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。巴细胞、肝、肾细胞等。不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神不分裂细胞，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等等。经、肌肉、多形核细胞等等。不同类型细胞的不同类型细胞的G1G1长
12、短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长长短不同，是造成细胞周期差异的主要原因。细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关短与物种的细胞类型有关。G1G1期期(gap1)(gap1)；S S期期(synthesis phase)(synthesis phase) ；G2G2期期(gap2)(gap2)；M M期又称期又称D D期期(mitosis or (mitosis or division)division) 依据依据细胞细胞DNA含量（横坐标）：含量（横坐标）： G1期期：DNA复制还没开始，复制还没开始，也是也是DNA含量最少的含量最少的，即流式，即流式检测结果图的检测结果图
13、的第一个峰第一个峰；S期期：DNA开始复制，到完开始复制，到完成复制，是成复制，是一个一倍一个一倍DNA到二到二倍倍DNA的过程，在流式结果图的过程，在流式结果图中显示期中显示期跨度特别大（第二个跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）不高但很宽的峰）；G2期期：DNA复制完成至分复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含裂的一段时间，此时细胞内含二倍二倍DNA，在流式结果图中的，在流式结果图中的第三个峰第三个峰；M期期：细胞分裂过程，此：细胞分裂过程，此时细胞内也是时细胞内也是二倍二倍DNA，用用DNA含量的方法是无法与含量的方法是无法与G2期期分开分开，所以有，所以有第三峰明显升高第三峰明显升高时报
14、告：时报告：G2/M期阻滞期阻滞。流式细胞仪分析细胞周期流式细胞仪分析细胞周期流式细胞仪检测细胞凋亡流式细胞仪检测细胞凋亡 1. 1. 细胞核的改变细胞核的改变 凋亡细胞核的改变，造成各种染色体凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞荧光染料对凋亡细胞DNADNA可染性发生改变。可染性发生改变。研究表明，用各种染色体荧光染料对经固研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其定的凋亡细胞进行染色，其DNADNA可染性降低。可染性降低。许多学者把这种许多学者把这种DNADNA可染性的降低认为是凋可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。亡细胞的标志之一。 DNA DNA可染性
15、降低也可能是因为可染性降低也可能是因为DNADNA含量含量的降低，或者的降低，或者DNADNA结构的改变使其与染料结结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。该注意。 细胞凋亡会产生特征性改变，包括细胞核、细胞器、细胞膜成分和细胞形态等的改细胞凋亡会产生特征性改变，包括细胞核、细胞器、细胞膜成分和细胞形态等的改变，其中细胞核的改变最具特征性。变，其中细胞核的改变最具特征性。2 2. .光散射特性光散射特性 凋亡细胞形态的改变影响其光散射特凋亡细胞形态的改变影响其光散射特性。性。前散射光（前散射光（FSCFSC）与细胞的大小有关）与细胞
16、的大小有关，而而侧散射光侧散射光(SSC)(SSC)反映的是光在细胞内的反映的是光在细胞内的折射作用，与折射作用，与细胞内的颗粒多少有关细胞内的颗粒多少有关。 细胞凋亡细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，时，细胞固缩，体积变小，FSCFSC降低降低；染色体降解，核破裂形成，胞；染色体降解，核破裂形成，胞内颗粒往往增多，内颗粒往往增多，SSCSSC常增加常增加。细胞坏死细胞坏死时，细胞肿胀，时，细胞肿胀，FSCFSC增大增大；SSCSSC亦增大亦增大，故可根据故可根据FSCFSC和侧和侧SSCSSC区别凋亡细胞和坏区别凋亡细胞和坏死细胞。但该死细胞。但该检测受细胞形态的均一性检测受细胞形态的均一性和
17、核胞浆比率和核胞浆比率影响很大。影响很大。 在某些在某些淋巴细胞凋亡淋巴细胞凋亡中，用光散射中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤肿瘤细胞凋亡细胞凋亡中，其可靠性就较差。中，其可靠性就较差。双染和单染双染和单染 在在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PSPS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中凋亡早期，细胞膜中的的PSPS由由脂膜内侧翻向外侧。脂膜内侧翻向外侧。AnnexinAnnexin V V是一种分子量为是一种分子量为3536kD3536kD的的CaCa2+2+依赖性磷脂
18、结合蛋白，依赖性磷脂结合蛋白，与与PSPS有有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的的PSPS与与凋亡早凋亡早期细胞的胞膜结合期细胞的胞膜结合。故故AnnexinAnnexin V V被作为检测被作为检测细胞早期凋亡细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将的灵敏指标之一。将AnnexinAnnexin V V进行荧光素（进行荧光素（EGFPEGFP、FITCFITC）标记，作为荧光探针标记，作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与细胞凋亡的发生。与FITCFITC的绿色荧光信号相比，的绿色荧光信号相比，EGFPEGFP的绿色荧光信号具有信号强，
19、不的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点。易淬灭，稳定性高等优点。 碘化丙啶碘化丙啶（PropidiumPropidium Iodide,Iodide,PIPI）是一种核酸）是一种核酸染料染料，溴化乙锭的，溴化乙锭的类似物类似物，不能不能透过完整的细胞膜，透过完整的细胞膜，但能够透过但能够透过凋亡中凋亡中晚期细胞晚期细胞和死和死细胞细胞的细胞膜的细胞膜，嵌入，嵌入双链双链DNADNA后后释放释放红色红色荧光荧光。故故将将AnnexinAnnexin V V与与PIPI匹配使用匹配使用，可将，可将处于不同凋亡时期的细胞区分处于不同凋亡时期的细胞区分开开。注注：1. Annexin V
20、-EGFP，PI避光保存及使用。避光保存及使用。PI有毒，操作时要戴手套。有毒，操作时要戴手套。2. 上机前要过滤细胞！因为上机前要过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团。具有很强的粘附性，容易使细胞聚团。流式细胞仪检测流式细胞仪检测时，细胞数量不应低于时，细胞数量不应低于1105，不适用于检测组织样本。，不适用于检测组织样本。3. 如果是贴壁细胞，胰酶消化不当会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团如果是贴壁细胞，胰酶消化不当会引起假阳性，而用细胞刮子会造成细胞粘连成团影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含影响检测。可将胰酶消化后细胞的保存在含2%BSA的的PBS中，防止进一
21、步的损伤。中，防止进一步的损伤。操作步骤操作步骤1. 细胞培养：取对数生长期的细胞，接板，药物处理，特定时间后终止培养。细胞培养：取对数生长期的细胞，接板，药物处理，特定时间后终止培养。2. 细胞固定：离心，收集细胞沉淀。细胞固定：离心，收集细胞沉淀。贴壁细胞用不含贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集的胰酶消化收集，消化时间消化时间不易过长不易过长。预冷。预冷PBS洗涤，加入预冷洗涤，加入预冷75%乙醇，乙醇，4固定固定4h以上。以上。3. 细胞染色：离心弃上清，细胞染色：离心弃上清，PBS洗涤，加入洗涤，加入PI和和RNase A，4避光孵育避光孵育30min。（。（PI单染）单染）或者或者
22、 加入加入500L Binding Buffer悬浮细胞悬浮细胞。加入加入5L Annexin V-EGFP混匀后，加入混匀后，加入5 L Propidium Iodide，混匀，混匀。室温、避光、反应室温、避光、反应515min；（双染）（双染）6. 请在请在1 h内，进行流式细胞仪的观察和检测。内，进行流式细胞仪的观察和检测。一般计数一般计数23万个细胞，结果用细胞周万个细胞，结果用细胞周期拟和软件期拟和软件ModFit分析。分析。Annexin V-EGFP的绿色荧光通过的绿色荧光通过FITC通道（通道（FL1）检测；）检测；PI红色红色荧光通过荧光通过PI通道（通道（FL2或或FL3）
23、检测，建议使用）检测，建议使用FL3。 因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧因检测细胞的类型、凋亡诱导剂种类、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照，光补偿也不同，建议每次检测均需使用未经凋亡诱导处理的正常细胞作为对照，将将荧荧光补偿光补偿调整到适合，调整到适合，去除光谱重叠和设定十字门的位置。去除光谱重叠和设定十字门的位置。若没有调节好，会导致细胞若没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而
24、且会影响到检测结果的不真实。结果解读结果解读: 纵坐标纵坐标Cell NumberCell Number：即计数的有效细胞数；横坐标：即计数的有效细胞数；横坐标DNA ContentDNA Content：即：即DNADNA含量；含量；G0/G1期细胞占总的期细胞占总的61.2%，DNADNA含量平均值为含量平均值为45.76。G2/M期占期占13.07%，DNADNA含量平均值含量平均值为为91.43。S期占期占25.73%。G2/G1为为2.0。细胞碎片为。细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有，细胞聚集体有0.06%。总的细。总的细胞数（仪器检测到的）为胞数（仪器检测到的）为17525个。在
25、细胞周期中分析的细胞数为个。在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎个（即排除了碎片及聚集体后）。峰的变异系数为片及聚集体后）。峰的变异系数为4.54%（好）（好）-CV是变异系数。一般是变异系数。一般CV越小，峰形越小，峰形越好，越尖锐。能控制在越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。就可以认可了。PI标记法测细胞周期标记法测细胞周期 在在FSC-SSC物理图中圈定目标细胞群，排除多细胞团块的影响，再以物理图中圈定目标细胞群，排除多细胞团块的影响，再以FL2A接受接受PI荧荧光信号检测细胞中光信号检测细胞中DNA含量为例
26、含量为例 ，将目标细胞显示群在，将目标细胞显示群在FL2A(area)-FL2W(width)散点图散点图中，粘连的两个二倍体细胞可能与一个四倍体细胞的中，粘连的两个二倍体细胞可能与一个四倍体细胞的FL2A信号相同，但是信号相同，但是FL2W的信号的信号却不同，粘连的双细胞的却不同，粘连的双细胞的FL2W值比单细胞要大，可以在散点图中将单细胞设门显示于值比单细胞要大，可以在散点图中将单细胞设门显示于FL2A直方图中，再分析细胞周期。直方图中，再分析细胞周期。FL2-W/FL2-AFL2-W/FL2-A设门排除双连体设门排除双连体细胞对细胞对G2/MG2/M期细胞比例的影响期细胞比例的影响凋亡晚
27、期或者坏死细胞凋亡晚期或者坏死细胞 CD45 CD45阴性筛选法，用阴性筛选法，用CD45CD45来筛选单一细胞来筛选单一细胞 选出来后在检测这一群细胞的凋亡情况。选出来后在检测这一群细胞的凋亡情况。通过通过CD45CD45阴性筛选可以去除淋巴系和其它髓系细胞。筛选后再用阴性筛选可以去除淋巴系和其它髓系细胞。筛选后再用ANNEXIN-VANNEXIN-V和和PIPI做双标做双标检测凋亡。检测凋亡。 样品中的细胞不是单纯的细胞，就得事先标记确定要检测的细胞群。样品中的细胞不是单纯的细胞，就得事先标记确定要检测的细胞群。正常细胞正常细胞凋亡早期的细胞凋亡早期的细胞双染检测细胞凋亡双染检测细胞凋亡 左上：可能是左上：可能是PIPI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。也有标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。也有说法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了，可不结合说法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了，可不结合AnnexinAnnexin-V-V而只结合而只结合PIPI。谢谢 谢！谢！
